Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

يشكر المؤلفون بول توماس مجهر المشورة والمساعدة. أيد هذا العمل تشارك هنا بسرك (منحة لا. BB/J009040/1 M.M.M. و T.W.).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

عزل الأنسجة المعوية عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والاقبية colonic ينطوي على تعريض سطح المخاطية، المعاملة مع الحل أدتا تخفيف الاتصالات المحمولة وتجزئة (الهز) والطرد المركزي. تم تعديل البروتوكول العزلة الزوائد المعوية قدم/سرداب من بيلشاو et al. ووايتهيد et al. 17 , 18
تعريض سطح المخاطية ونحن قد جربت عددا من النهج لفضح السطح المخاطي للامعاء في وضع هذا الإجراء. نهج كلاسيكي إيفرت (إيقاف الداخل إلى الخارج) الأنبوب، عادة في مقاطع طويلة، حوالي 100 مم استخدام قضيب معدني يتم التقاطها في إضعاف النسيج في نهاية واحدة والانبوب المتبقي ثم انزلق عبر أنبوب19. للماوس الأنسجة، مثالي قضيب معدني (2.4 مم) ذات نهايات مستدير الزوايا. وهذا النهج قد يعود بالنفع لتوسيع سطح المخاطية مما يتيح إمكانية الوصول إلى برنامج تلفزيوني ويدتا. ونحن في البداية يستخدم هذا النهج لكنها انتقلت إلى قطع الأنبوبة إلى أطوال قصيرة (حوالي 5 سم) وفتح كل مقطع بتشريح مقص كما أثبت هذا أسهل. وهذا النهج مناسبة إلا إذا كان مطلوبة من عدد قليل من الأمعاء؛ ولكن إذا كانت الحيوانات أكثر أن تستخدم في تجربة ثم بنيت لهذا الغرض جهاز لقطع فتح الأنبوب طوليا، كما وصفها Yoneda et al. 14 سيكون أكثر كفاءة.
مفرزة من الزوائد والاقبية من طبقة العضلات في البداية استخدمنا 3 مم يدتا في برنامج تلفزيوني وفترات حضانة طويلة نسبيا تصل إلى 60 دقيقة لتخفيف سطح المخاطية من17،الأنسجة الكامنة وراء18. في هذا التركز يدتا وجدنا وقت حضانة من 30 دقيقة كانت كافية لتخفيف الأقبية من القولون الماوس. ومع ذلك، لعزل سرداب/زغابة الأمعاء حاولنا استخدام يدتا أكثر تركيزاً لفترة أقصر، التي ثبت أن اتباع نهج فعالة. وأجرى جميع الأعمال اللاحقة مع الأنسجة المستخرجة باستخدام تقنية يدتا 30 ملم توليد الكسور ذات الصلة للزوائد أو الأقبية. للأقبية، نحن عادة تجميع الكسور 3-5 قبل إصلاح لكن من المهم للتحقق من ما إذا كانت هذه هي الكسور المناسبة حسب التوقيت يعتمد على عدد من العوامل مثل موقف على طول القناة المعوية، وعمر الماوس، التهاب، والنظام الغذائي السابق ، إلخ وعلى نحو مماثل، قد يختلف طول الوقت الأنسجة يحتاج إلى أن تهتز بعد العلاج أدتا أن تكون فعالة تحت ظروف مختلفة. والنتيجة كسور الأنسجة المعزولة التي تحتوي على خليط من الزوائد والاقبية أو أساسا أما الزوائد أو الأقبية (الشكل 2). كما أن هناك لا الزوائد في القولون، استخراج سرداب قد يكون ممكن التحقيق في خطوة واحدة بالهز الأنسجة في أنبوب لمدة 30 ثانية. يمكن إصلاح هذه الكسور والمجهزة لوسم المناعية.
عزل أورجانويدس المعوية من مصفوفة الطابق السفلي يمكن عزل أورجانويدس من الطابق السفلي القباب مصفوفة باستخدام حل الاسترداد الخلية. يعمل الحل عن طريق ديبوليميريزينج المصفوفة تبلور الطابق السفلي ولكن يلزم درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. الحذر من أن ميكروتوبوليس الحيوية قد لا يتم الاحتفاظ. وهكذا، لوسم المناعية لدينامية microtubules و + نصائح مثل الخلية الحديدية، لا يوصي بالانتعاش من مصفوفة الطابق السفلي قبل التثبيت. ومع ذلك، معظم microtubules في تمييز الخلايا أورجانويد مستقرة نسبيا وكانت هذه المحافظة (الشكل 6). كما أنها عملت جيدا للعلامات المناعية لبروتينات سينتروسومال وهالة، فضلا عن علامات خلية.
تثبيت البروتوكولات فورمالدهايد (طازجة من منهاج عمل بيجين) كروسلينكس مثبت التصرف السريع نسبيا التي تشكل عكسها ونسبة 4 في المائة منهاج العمل يعمل جيدا على سبيل المثال، في وسم المناعية microtubules وغاما-tubulin وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. أكثر تمييع حلول منهاج العمل مثل 1% عملت جيدا بالنسبة وسم المناعية على سبيل المثال، مع علامات Lgr5 وبانيث الخلايا الجذعية علامة خلية CD24 داخل سرداب الخلايا الجذعية المتخصصة، في حين لم تنجح تركيزات أعلى من منهاج عمل بيجين.
إضافة glutaraldehyde يعطي أفضل الحفاظ على ميكروتوبوليس وما يسمى فيمو تثبيت البرنامج الذي يتكون من خليط من 3.7% منهاج عمل بيجين، جلوتارالديهيدي 0.05% والمنظفات 0.5% في فيمو المخزن المؤقت (أنابيب 68 مم، 25 مم هيبيس، 15 اجتا و 3 ملم MgCl2)2 يعطي المحافظة ممتازة من ميكروتوبوليس دون المساس أنتيجينيسيتي. كما أنها تعمل جيدا لوسم المناعية غاما-tubulin وبيتا-كاتينين، وهاء-كادهيرين وخيوط أكتين المصبوغة مع فالويدين. ومع ذلك، في أنسجة ثلاثية الأبعاد والثقافات أورجانويد، تثبيت فيمو تنتج نتائج غير متناسقة ولذلك لم يستخدم.
من الميثانول مثبت تخثر يعطي اختراق جيدة نسبيا، ويميل إلى الحفاظ على أنتيجينيسيتي. التثبيت مع 100 ٪ الميثانول (-20 درجة مئوية) يقدم بعض الانكماش ويتيح الحفاظ على مورفولوجيا معتدلة ويعمل microtubules، + نصائح، والعديد من الأجسام المضادة سينتروسومال بما في ذلك نينين في 2D خلية الثقافات. ومع ذلك، انهارت بعض أورجانويدس عند استخدام أسلوب التثبيت هذا. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختراق من الأجسام المضادة من خلال أسرة الأقبية أو الزوائد أو أورجانويدس كان في البداية مشكلة ولكن إضافة المنظفات 0.1% إلى الحل الغسيل والغسيل طويلة حققت نتائج أفضل.
مزيج من الفورمالدهايد والميثانول كان يستخدمها سابقا روجرز et al. 20 إلى EB1 المناعية-التسمية في المورفولوجية. تثبيت بروتوكول يستند إلى مزيج فورمالدهايد والميثانول لذلك بوضع الأنسجة المعوية وأورجانويدس استناداً إلى 3% فورمالدهايد و 97 ٪ الميثانول مبردة إلى-20 درجة مئوية، ولكن إهمال كربونات الصوديوم 5 مم من الخليط التي تم استخدامها بواسطة روجرز وآخرون. كانت عينات 20 بالإضافة إلى ذلك، ثابتة في الثلاجة عند-20 درجة مئوية. هذا عملت لا سيما جيدا للعلامات المناعية + نصائح، مثل القصاصة-170 والحديدية، ولكن ثبت أيضا ممتازة لتحديد ووسم المناعية microtubules واكتين داخل الأنسجة و 3D أورجانويدس. الحفاظ على هيكلية جيدة جداً وكان واضحا والمحافظة على أنتيجينيسيتي لعدة بروتينات cytoskeletal والمرتبطة بها، فضلا عن البروتينات سينتروسومال مثل غاما-tubulin ونينين، على الرغم من أن وضع العلامات نينين عمل أكثر اتساقا مع الميثانول التثبيت.

تشكيل epithelia مع الأقطاب أبيكو القاعدية هو عملية أساسية في عملية التنمية، وينطوي على إعادة تنظيم هائلة microtubules والبروتينات سينتروسومال. مجموعة microtubule شعاعي النابعة من ميكروتوبولي سينتروسومال بموقع مركزي تنظيم مركز (بعد) بارز في العديد من الخلايا الحيوانية وهذا مناسب تماما لخلايا مسطحة نسبيا. على النقيض من ذلك، تجميع عمودي من الخلايا الظهارية، مثل تلك التي الأمعاء، صفائف microtubule ترانسسيلولار شعاعي غير أن دعم أفضل شكل ومهام متخصصة لهذه الخلايا. عملية إعادة التنظيم هذه مثيرة ميكروتوبوليس ويتحقق من خلال سينتروسومي الانتقال إلى ذروة وغير سينتروسومال متوكس قمي (n-متوكس) تشكيل، الذي يصبح مسؤولاً لرسو السفن من1،ميكروتوبوليس ترانسسيلولار2 , 3 , 4 , 5.
الكثير من معرفتنا بالتمايز الظهارية، وإعادة تنظيم microtubule المرتبطة بها قد تأتي من التحقيقات في 2D في المختبر طبقات الخلايا التي لا يتم عرض بنية الأنسجة في الجسم الحي . ويمثل التطور 3D في المختبر الثقافات أورجانويد، بادرت كليفيرس وزملاء العمل6، تقدم التكنولوجي رئيسية كما أنها تحاكي في فيفو العمارة والتنمية. التسلسل هرمي للتمايز الظهارية يتجلى في الأمعاء؛ الخلايا الجذعية في الجزء السفلي من أقبية تؤدي إلى عبور غير ناضجة تضخيم الخلايا التي تتكاثر وتفرق تدريجيا عندما تهاجر حتى سرداب على زغابة معوية صغيرة أو على سطح colonic، حيث أنها أصبحت متباينة تماما قبل أن تسلط في التجويف7. الأهم من ذلك، وهذا يتكرر في أورجانويدس المعوية حيث تتكاثر الخلايا من الخلايا الجذعية المتخصصة تشكل الخراجات التي تولد براعم سرداب الشبيهة بالخلايا الجذعية في القاع والتمايز تتقدم تدريجيا نحو منطقة كيسه، في وقت لاحق يصبح مثل الزوائد8. أورجانويد المعوية وبالتالي يمثل نموذجا قويا لدراسة ليس فقط من ميكروتوبولي وإعادة تنظيم سينتروسومال خلال التمايز الظهارية لكن العديد من البروتينات الأخرى، فضلا عن توفير منصة مثالية لفحص الأدوية والأغذية مركبات إمكانات العلاجية فوائد9،10.
أورجانويدس هي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية معلم وكلاهما تدق والمغلوب أورجانويدس يمكن إنشاؤها باستخدام الجينات كريسبر/Cas9 تحرير11،12. إنشاء تعبير والتعريب من البروتينات الذاتية دراستها غير هامة، خاصة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. أورجانويدس 3D وسم المناعية نمت في مصفوفة الطابق السفلي أو السابقين فيفو عزل الأنسجة أكثر تعقيداً من الخلايا التي نمت في أطباق الثقافة في 2D. تثبيت البروتوكول يحتاج إلى الحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد الدقيقة أورجانويدس مع المحافظة على جسم أنتيجينيسيتي (أي، [ابيتوبس] لربط الأجسام المضادة). على سبيل المثال، بارافورمالدهيد 4% (PFA) يستخدم عادة كمثبِّت ولكن رغم أنه مثبت النيابة سريع نسبيا ويعطي جيدة الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، في تجربتنا أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان أنتيجينيسيتي وليست مناسبة للعديد الأجسام المضادة سينتروسومال. وينبغي أيضا النظر في مثبت وأجسام مضادة قادرة على اختراق هياكل ثلاثية الأبعاد والأنسجة. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن قد عدلت والبروتوكولات المتقدمة لعزل الأنسجة ووسم المناعية غير المباشرة أورجانويدس 3D في المختبر و السابقين فيفو عزل الأنسجة المعوية. ونحن تصف كيفية عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة والزوائد والأنسجة colonic، وتشمل بروتوكول لعزل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد كبديل لتحديد ووسم المناعية داخل المصفوفة الطابق السفلي. نحن نقدم ثلاثة بروتوكولات تثبيت البديلة لوسم المناعية microtubules والبروتينات سينتروسومال، مثل نينين، والبروتينات تتبع زائد-نهاية ميكروتوبولي (+ نصائح)، مثل البروتينات EB ومقطع-170 (انظر أيضا المراجع8، 13). كما نناقش إيجابيات وسلبيات المقترنة مع كل بروتوكول.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

ظهور ثلاثية الأبعاد في المختبر أورجانويدس التي تحاكي في فيفو هندسة الأنسجة و morphogenesis متقدمة إلى حد كبير القدرة على دراسة المسائل البيولوجية الرئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي. وباﻹضافة إلى ذلك، وعود أورجانويدس جنبا إلى جنب مع التقدم التقني المحرز مؤخرا في تحرير الجينات والمورثات الفيروسية التسليم للنهوض بالبحوث الطبية واستحداث أدوية جديدة لعلاج الأمراض. أورجانويدس تزرع في المختبر في الطابق السفلي مصفوفة توفير نظم نموذجية قوية لدراسة السلوك ووظيفة البروتينات المختلفة، وهي مناسبة تماما للعيش-التصوير للبروتينات الفلورية ذات العلامات. ومع ذلك، إنشاء التعبير والترجمة من البروتينات الذاتية في أنسجة الجسم الحي السابقين و في المختبر أورجانويدس هامة للتحقق من سلوك البروتينات المعلمة. وتحقيقا لهذه الغاية علينا المتقدمة وتعديل عزل الأنسجة، وتثبيت، وبروتوكولات وسم المناعية للتعريب microtubules، سينتروسومال، وما يرتبط بها البروتينات في الأنسجة المعوية فيفو السابقين و في المختبر أورجانويدس المعوية. وكان الهدف لمثبت للحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد من أورجانويدس/الأنسجة الوقت أيضا الحفاظ على جسم أنتيجينيسيتي وتمكن من اختراق جيد وإزالة مثبت والأجسام المضادة. التعرض للبرد ديبوليميريزيس جميع ولكن ميكروتوبوليس مستقرة، وكان هذا عاملاً أساسيا عند تعديل البروتوكولات المختلفة. ووجدنا أن زيادة التركيز (يدتا) حمض الذي الإيثيلين من 3 مم إلى 30 مم أعطى مفرزة فعالة من الزوائد والاقبية في الأمعاء بينما كان كافياً للأقبية colonic يدتا 3 مم. وأعطى البروتوكول التثبيت المتقدمة فورمالدهايد/الميثانول الحفاظ على هيكلية جيدة جداً مع أيضا الحفاظ على أنتيجينيسيتي لوسم فعالة microtubules، أكتين، والبروتينات (EB) نهاية الملزمة. كما أنها عملت نينين البروتين سينتروسومال على الرغم من أن البروتوكول الميثانول عملت أكثر باستمرار. وأنشأنا كذلك أنه يمكن تحقيق التثبيت ووضع العلامات المناعية ميكروتوبوليس والبروتينات المرتبطة بها مع أورجانويدس المعزولة من أو البقاء داخل المصفوفة الطابق السفلي.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

نقدم البروتوكولات لعزل المعوية هياكل ثلاثية الأبعاد من الأنسجة في الجسم الحي والمضمنة في المختبر مصفوفة الطابق السفلي أورجانويدس، والتثبيت المختلفة بالتفصيل وتلطيخ البروتوكولات الأمثل لوسم المناعية من ميكروتوبولي، البروتينات سينتروسومال، وهالة كذلك خلية علامات بما في ذلك الخلايا الجذعية البروتين Lgr5.

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

وصفها والفيروسية بوساطة زرع الإنسي العقدية سماحة (MGE) خلايا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; دراسات

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

في المختبر وفي النماذج الحية لدراسة الانتقال القرنية غشائي-الوسيطة

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

السابقين فيفو Perfusion من المشيمة القوارض

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

خلاصه الرضاعة إلى الفطام الانتقالية في المختبر باستخدام الغدد المعوية الجنينية

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...