Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Paul Thomas for mikroskopet rådgivning og bistand. Dette arbejde involveret her blev støttet af BBSRC (give nr. BB/J009040/1 M.M.M. og T.W.).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Isolering af tarmens væv Isolering af lille tarm krypter og villi og Colon Krypter indebærer udsætter slimhinden, behandling med EDTA-oploesning til at løsne celle kontakter, fraktionering (ryste) og centrifugering. Præsenteres intestinal villi/krypt isolation protokol er blevet ændret fra Belshaw et al. og Whitehead et al. 17 , 18
Udsætter slimhinden Vi har eksperimenteret med en række tilgange til at eksponere slimhinden i tarmkanalen i udviklingen af denne procedure. En klassisk metode er at evert (turn indefra og ud) rør, normalt i segmenter cirka 100 mm lange, ved hjælp af en metalstang, der er fanget i en fold af væv på ene ende og derefter de resterende rør gled over tube19. Beliggenheden er perfekt til musen væv, en metalstang (2,4 mm i diameter) med afrundede ender. Denne fremgangsmåde har fordelen at udvide slimhinden giver bedre adgang til PBS og EDTA. Vi oprindeligt anvendt denne fremgangsmåde men flyttede til skæring af rør i korte længder (ca. 5 cm) og åbne hver sektion med dissekere saks, da dette viste sig lettere. Denne tilgang er passende, hvis kun et par tarmene er påkrævet; men hvis flere dyr skulle være brugt i et eksperiment derefter en specialbyggede enhed til skære åbne røret på langs, som beskrevet af Yoneda et al. 14 ville være mere effektiv.
Udstationering af villi og Krypter fra muskel lag I begyndelsen brugte vi 3 mM EDTA i PBS og forholdsvis lang inkubationstid gange på op til 60 min. for at løsne slimhinden fra det underliggende væv17,18. Ved denne koncentration af EDTA fandt vi en inkubationstiden på 30 min. var tilstrækkelig til at løsne Krypter fra mus kolon. Dog til tyndtarmen crypt/villus isolering prøvet vi at bruge mere koncentreret EDTA i kortere tid, som viste sig for at være en effektiv fremgangsmåde. Alle efterfølgende arbejde blev udført med væv udvundet ved hjælp af 30 mM EDTA teknik generere relevante fraktioner til villi eller Krypter. For Krypter, vi samles normalt fraktioner 3-5 før fastsættelse af men det er vigtigt at kontrollere, om disse er de passende fraktioner, som tider vil afhænge af en række faktorer såsom placering langs tarmkanalen, alder af musen, betændelse, tidligere kost , etc. ligeledes længden af tid, vævet skal blive rystet efter EDTA behandlingen være effektiv kan variere under forskellige betingelser. Resultatet er isoleret væv fraktioner der indeholder en blanding af villi og Krypter eller hovedsagelig enten villi eller crypts (figur 2). Da der er ingen villi i tyktarmen, krypt udvinding kan være opnåelige i ét trin ved at ryste væv i røret til 30 s. Disse fraktioner kan derefter fast og forarbejdet til immuno-mærkning.
Isolering af tarm organoids fra kælderen matrix Isolering af organoids fra kælderen matrix kupler kan opnås ved hjælp af celle opsving løsning. Løsningen virker ved depolymerizing geléagtig kælderen matrix, men temperaturen skal være 2-8 ° C. Et notat af forsigtighed er, at dynamiske mikrotubuli ikke kan bevares. Således, for immuno-mærkning af dynamiske mikrotubuli og + TIPs som cellen EBs, recovery fra kælderen matrix før fiksering anbefales ikke. Men de fleste af mikrotubuli i differentiering organoid cellerne er relativt stabile og disse blev bevaret (figur 6). Det fungerede også godt for immuno-mærkning af centrosomal og junctional proteiner samt celle markører.
Fiksering protokoller Formaldehyd (frisklavet fra PFA) er en relativt hurtig virkende fiksativ, der danner reversible cross-links og 4% PFA fungerer godt for eksempel i immuno-mærkning mikrotubuli og gamma-tubulin og farvning actin filamenter med Phalloidin. Mere fortyndes PFA løsninger såsom 1% fungeret godt for immuno-mærkning for eksempel med stamcelle markører Lgr5 og Paneth celle markør CD24 i krypten stamcelle niche, mens højere koncentrationer af PFA ikke virkede.
Tilsætning af glutaraldehyd giver bedre bevarelse af mikrotubuli og den såkaldte PHEMO fiksering, som består af en blanding af 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyd og 0,5% vaskemiddel i PHEMO buffer (68 mM rør, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA og 3 mM MgCl2)2 giver fremragende bevarelse af mikrotubuli uden at kompromittere antigenicity. Det virker også godt for immuno-mærkning gamma-tubulin, β-catenin, og E-cadherin og farvning actin filamenter med phalloidin. Dog i 3D væv og organoid kulturer, PHEMO fiksering produceret inkonsistente resultater og derfor ikke blev anvendt.
Methanol er en koaguleringsmiddel fiksativ, der giver relativt gode penetration og tendens til at bevare antigenicity. Fiksering med 100% methanol (-20 ° C) introducerer nogle krympning, giver moderat morfologi bevarelse og virker for mikrotubuli, + TIPs og mange centrosomal antistoffer, herunder ninein i 2D cellekulturer. Men nogle organoids kollapsede når du bruger denne fiksering metode. Derudover penetration af antistoffer gennem hele Krypter, villi, eller organoids var oprindeligt et problem men tilsætning af 0,1% vaskemiddel til vaskeopløsning og langvarig vask opnåede bedre resultater.
En kombination af formaldehyd og methanol havde tidligere været brugt af Rogers et al. 20 at immuno-label EB1 i Drosophila. En fiksering protokol baseret på en blanding af formaldehyd og methanol er derfor udviklet til tarmens væv og organoids baseret på 3% formaldehyd og 97% methanol nedkøles til-20 ° C, men udelade natriumcarbonat 5 mM fra den blanding, der blev brugt af Rogers mfl. 20 desuden prøver blev fastsat i fryser ved-20 ° C. Dette fungerede særdeles godt for immuno-mærkning + TIPs, såsom klip-170 og EBs, men også viste sig fremragende til fastsættelse og immuno-mærkning mikrotubuli og aktin inden for væv og 3D organoids. Meget god strukturel bevarelse var tydelig og antigenicity blev bevaret for flere cytoskeletal og tilknyttede proteiner samt centrosomal proteiner som gamma-tubulin og ninein, selv om mærkning for ninein arbejdede mere konsekvent med methanol fiksering.

Dannelsen af epitheler med apico-basal polaritet er en grundlæggende proces i udvikling og indebærer en dramatisk reorganisation af mikrotubuli og centrosomal proteiner. En radial mikrotubulus array fra en centralt beliggende centrosomal mikrotubulusorganiserende center (MTOC) er fremtrædende i mange animalske celler og dette er velegnet til relativt flade celler. Derimod samle kolonneformat epitel celler, som de i tarmen, ikke-radial transcellular mikrotubulus arrays, der bedre understøtter den form og specialiserede funktioner af disse celler. Denne dramatiske reorganisering af mikrotubuli er opnået ved at centrosome flytter til apex og apikale ikke-centrosomal MTOC (n-MTOC) danner, der bliver ansvarlig for forankring af transcellular mikrotubuler1,2 , 3 , 4 , 5.
Meget af vores viden om epitelial differentiering og tilknyttede mikrotubulus reorganisering er kommet fra undersøgelser af 2D i vitro cellelag, der ikke vises i vivo væv arkitektur. Udvikling af 3D in vitro- organoid kulturer, pioner af Clevers og co-arbejdere6, repræsenterer et stort teknologisk fremskridt, da de efterligner i vivo arkitektur og udvikling. Et hierarki af epitel differentiering er tydelig i tarmen; stamceller i bunden af Krypter give anledning til umodne transit forstærke celler, som formere sig og differentiere efterhånden som de vandrer op krypten ind på den lille tarm villus eller Colon overflade, hvor de bliver fuldt differentierede inden kaste ind i lumen7. Vigtigere, er dette gentaget i tarm organoids hvor celler fra stamceller niche formere danner cyster, der efterfølgende genererer krypt-lignende knopper med stamceller i bunden og differentiering gradvist fremskridt i retning af regionen cyste der bliver villus-lignende8. Den intestinale organoid udgør derfor en kraftfuld model til at studere ikke blot mikrotubulus og centrosomal reorganisering under epithelial differentiering, men mange andre proteiner samt giver en ideel platform for screening af medicin og mad forbindelser af potentielle terapeutiske fordele9,10.
Organoids er velegnet til live-imaging af fluorescerende-tagged proteiner samt både knock- og knock-out organoids kan genereres ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering11,12. Men de udtryk og lokalisering af de endogene proteiner til at blive undersøgt er vigtigt, især for at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Immuno-mærkning 3D organoids dyrkes i kælderen matrix eller ex vivo isoleret væv er mere komplekse end celler dyrkes i kultur retter i 2D. Fiksering protokol skal bevare den sarte 3D arkitektur af organoids samtidig stadig bevare antistof antigenicity (dvs., epitoper for bindende antistoffer). For eksempel, 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) er almindeligt anvendt som fiksativ, men mens det er relativt hurtig virkende fiksativ og giver gode morfologiske bevarelse, vores erfaring det ofte resulterer i tab af antigenicity og er ikke egnet til mange centrosomal antistoffer. Fiksativ og antistoffer evne til at trænge ind i 3D strukturer og væv bør også overvejes. Vi har ændret herpå, og udviklede protokoller for væv isolation og indirekte immuno-mærkning af 3D in vitro- organoids og ex vivo isoleret tarmens væv. Vi beskriver, hvordan du isolere lille tarm krypter og villi og Colon væv, og omfatter en protokol til isolation af 3D organoids som et alternativ til fastsættelse og immuno-mærkning inden for matrixen kælder. Vi præsenterer tre alternative fiksering protokoller for immuno-mærkning af mikrotubuli og centrosomal proteiner, såsom ninein, og mikrotubulus plus-ende tracking proteiner (+ TIPs), såsom EB proteiner og klip-170 (Se også referencer8, 13). Vi også diskutere fordele og ulemper knyttet til hver protokol.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Fremkomsten af 3D in vitro- organoids, der efterligner i vivo væv arkitektur og morfogenese har meget avanceret mulighed for at undersøge biologiske nøglespørgsmål i celle og udviklingsmæssige biologi. Derudover lover organoids sammen med de seneste tekniske fremskridt i gen redigering og virale gen levering at fremme medicinsk forskning og udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdomme. Organoids dyrkes in vitro- i kælderen matrix giver kraftfuld modelsystemer til at studere adfærd og funktion af forskellige proteiner og er velegnet til live-imaging af mærket fluorescerende proteiner. Men om oprettelse af udtryk og lokalisering af de endogene proteiner i ex vivo væv og i in vitro- organoids er vigtigt at kontrollere funktionsmåden for de mærkede proteiner. Til dette formål har vi udviklet og ændret væv isolation, fiksering og immuno-mærkning protokoller for lokalisering af mikrotubuli, centrosomal og tilknyttede proteiner i ex vivo tarmens væv og i in vitro- tarm organoids. Målet var for fiksativ at bevare 3D arkitekturen i organoids/væv samtidig bevare antistof antigenicity og giver god penetration og clearance af fiksativ og antistoffer. Udsættelse for kulde depolymerizes alle, men stabil mikrotubuli og dette var en vigtig faktor, når du ændrer de forskellige protokoller. Vi konstaterede, at øge den ethylendiamintetra syre (EDTA) koncentration fra 3 mM til 30 mM gav effektiv udstationering af villi og Krypter i tyndtarmen, mens 3 mM EDTA var tilstrækkelig for Colon Krypter. Udviklede formaldehyd/metanol fiksering protokol gav meget god strukturel bevarelse samtidig også bevare antigenicity for effektiv mærkning af mikrotubuli, aktin og ende-bindende (EB) proteiner. Det arbejdede også for centrosomal protein ninein selv om methanol protokol arbejdede mere konsekvent. Vi etableret yderligere, at fiksering og immuno-mærkning af mikrotubuli og tilknyttede proteiner kan opnås med organoids isoleret fra eller resterende inden for matrixen kælder.

Isolering af tarmens væv til immuno-mærkning De beskrevne væv isolation protokoller for kolon og tyndtarmen blev optimeret for bevarelse og immuno-mærkning af mikrotubuli og tilknyttede proteiner, men ikke for stamcelleforskning levedygtighed og organoid generation (figur 1 og tabel 1 ). Formålet var at generere krypt og villus fraktioner, der var som ren (slim og andre væv) som muligt, samtidig minimere eksponeringen for EDTA og kolde at bevare strukturen og forhindre depolymerization af mikrotubuli med is kold løsninger, som inducerer depolymerization af alle, men stabil mikrotubuli. Figur 2 viser eksempler på billeder af brøker 2 og 3 fra isolerede lille tarmens væv, med fraktion 2 indeholdende en blanding af både villi og Krypter (figur 2A, B), mens brøkdel 3 indeholder hovedsageligt Krypter (figur 2 c D).
Fiksering og immuno-mærkning af isolerede tarmens væv De enkelte eller kombinerede fraktioner blev derefter behandlet for fiksering og immuno-mærket gennem en række foranstaltninger, herunder fiksering, vaskemiddel, blokering, antistof og vask løsninger, før re suspendere de endelige villi/Krypter pellet i montering medier, overførsel til dias, og dækker med glas coverslips. Krypter og villi blev derefter afbildet på en Konfokal mikroskop.
God konservering og mærkning af mikrotubuli og aktin i både villi og Krypter blev opnået ved følgende: en kombination af formaldehyd/metanol fiksering ved-20 ° C, gentagen vask i PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum og blokering i PBS med 0,1% vaskemiddel og 10% serum, efterfulgt af natten inkubation ved 4 ° C i primære antistoffer og derefter 2 h i sekundære antistoffer ved stuetemperatur (figur 3). Formaldehyd/metanol fiksering også fungeret godt for mærkning + TIPs som EBs og klip-170 i isolerede krypter og villi (figur 4). EB3 ophobninger plus-enden af mikrotubuli (kendt som kometer) var tydeligt i Krypter (figur 4A), mens association langs gitter af stabil mikrotubuli kunne ses i villi prøver (figur 4 c). Særskilte lokalisering af CLIP-170 og p150Glued (subunit af dynactin) var tydeligt på de apikale n-MTOC i isolerede villi (figur 4B). Fiksering med formaldehyd/methanol-protokollen arbejde ikke konsekvent for ninein lokalisering i isolerede tarmens væv ved hjælp af vores Pep3 antistof mod mus ninein. Men metanol fiksering ved-20 ° C efterfulgt af samme vask og blokerer løsninger som formaldehyd/methanol gav meget gode lokalisering af ninein inden for isolerede krypter og villi (figur 5; reference8). Interessant, mens ninein er koncentreret på de apikale centrosomes var nogle ophobning på celle base tydeligt i nogle celler i isolerede Krypter (figur 5). Hvorvidt dette er på grund af ikke-specifik mærkning eller en følge af isolation procedure at forsinke fiksering (og dermed påvirke bevarelse) vil har brug for yderligere undersøgelse. Methanol-fast (-20 ° C) frysemikrotomsnit af villi (Se figur 3bi i8) viste imidlertid også, ninein på cellen base i nogle celler, hvilket tyder på, at ninein kan også tilknyttes en basal befolkning af mikrotubuli.
Fiksering og immuno-mærkning af organoids isoleret fra kælderen matrix Lille tarm organoids blev genereret og dyrket i kælderen matrix i tre uger eller længere (figur 6A, reference6,15). En kold (4 ° C) celle opsving løsning blev brugt til at isolere organoids fra matrixen kælder. Depolymeriseret kælderen matrix løsning med organoids blev overført til rør og centrifugeres inden fiksering og immuno-mærkning. Det produceres meget ren præparater og god adgang til organoids for de forskellige løsninger. Den differentierede celler i organoid villus domæner indeholder stabile apico-basal mikrotubuli; disse mærket godt i de fleste tilfælde (fig. 6B, C) og EB1 kunne også ses langs en mikrotubulus gitter (figur 6E; reference13). Men, kolde celle opsving løsning kan resultere i depolymerization af de dynamiske mikrotubuli, som var tydelig i nogle prøver af manglen på EB1 kometer (som binder til plus-slutningen af voksende mikrotubuli) i basal krypt domæner (figur 6F ). I andre prøver, blev astral (dynamisk) mikrotubuli bevaret (figur 6D). Organoid isolation forud for fiksering og immuno-mærkning også arbejdet for junctional proteiner, ninein, klip-170, og celle markører, såsom mucin goblet celler og chromogranin A for enteroendocrine celler.
Fiksering og immuno-mærkning af organoids i kælderen matrix Figur 7 viser en organoid på stadiet cyste (A-C) og på et tidligt stadium af crypt udvikling (D), både fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og ninein. God mikrotubulus bevarelse og mærkning samt mærkning for ninein på apikale n-MTOC var indlysende. Figur 8A, B viser en krypt domæne inden for en dag 6 organoid fast med methanol-protokollen og mærket for mikrotubuli og EB1. God bevarelse af mikrotubuli og EB1 kometer var tydeligt foreslår bevarelsen af dynamiske mikrotubuli.
Organoids var også fast og immuno-mærket mens de resterende inden for matrixen kælder. Ulemperne ved denne fremgangsmåde kan være dårlig penetration af fiksativ og diffusering af antistoffer i kælderen matrix (fig. 8B), men i begge tilfælde mindre hyppigt når 0,1% vaskemiddel indgik i fiksativ og/eller vaske løsninger. Derudover 4% PFA gjorde ikke bevare kælderen matrix godt men ladet det opløses, selv om dette var mindre så med 1% PFA.Metanol fiksering, på den anden side induceret nogle gange organoid sammenbrud.
Mærkning med nogle antistoffer som mod stamcelle markør Lgr5 og Paneth celle markør bevist CD24 mislykket med 4% PFA, methanol eller formaldehyd/methanol protokoller. Men, fastsættelse af organoids inden for matrixen kælder med 1% PFA i PBS med 0,1% vaskemiddel ved stuetemperatur resultere i mærkningen for både Lgr5 og CD24 (figur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig1.jpg"> 
Figur 1: isolering af lille tarm villi og Krypter. Blokdiagram af de vigtigste skridt i lille tarm villus og krypten isolation forud for fiksering og immuno-mærkning. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig2.jpg"> 
Figur 2: isoleret villi og Krypter fra mus tyndtarmen. Brightfield mikroskop billeder af tarm fraktioner viser villi (store pile) og crypts (små pile). (A, B) Fraktion 2 indeholder en blanding af villi og Krypter, og bevarelsen af morfologi på villus og krypten er tydelig i B. (C, D) Brøkdel 3 viser isolation krypter og fravær af villi og intakt Krypter herunder en todelt krypten i C. Skalere barer = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig3.jpg"> 
Figur 3: isoleret lille tarm villus og krypten fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og aktin. (A) skematisk af villus og krypten epitel med forskellige celletyper er angivet. De markerede felter angiver de repræsentative regioner afbildet i B og C. (B, C) Konfokal optiske dele gennem en del af en villus (B) og basal crypt (C) isoleret fra tyndtarmen ved hjælp af 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/methanol, vasket i PBS, som indeholder 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokeret i PBS som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og mærket for mikrotubuli med rotte monoklonalt anti-tubulin antistof (grøn) og aktin med kanin polyklonale anti-β-actin antistof (rød). Velbevaret apico-basal mikrotubulus bundter er tydeligt i både villus og krypten celler, og aktin kan ses koncentreret i den apikale region står over for lumen (pil). Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig4.jpg"> 
Figur 4: Isoleret lille tarm krypt og villi fast i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli, EB3, p150Gluedog klip-170. Konfokal optiske dele af krypt og villi regioner isoleret fra tyndtarmen ved hjælp af 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/methanol, vasket i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og immuno-mærket. (A) krypt mærket med kanin polyklonale α-tubulin antistof (rød) og rotte monoklonale EB3KT36 antistof (grøn) og farvet for DNA med DAPI (blå) viser apico-basal mikrotubuli og EB3 kometer. Single channel-omvendt billede viser tydeligt EB3 kometer i hele basal krypt celler tyder på god konservering af dynamisk og stabil mikrotubuli. (B) Villus epitelceller mærket med kanin polyklonale klip-170 antistof (rød, se også henvise til16) og mus monoklonale p150Glued antistof (grøn) viser apikale Co lokalisering. Inverteret enkelt kanal billeder er vist nedenfor. (C) Villus celler mærket med kanin polyklonale α-tubulin antistof (rød) og rotte monoklonale EB3-KT36 antistof (grøn) og farvet for DNA med DAPI (blå) viser apico-basal mikrotubuli med EB3 langs gitter. Foreningen EB3 gitter er fremhævet i det forstørrede billede inverteret enkelt kanal billedet antyder, at både EB3 kometer og lattice association. Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig5.jpg"> 
Figur 5: isolerede kolon krypt fast i methanol, immuno-mærket for ninein og E-cadherin, og farves med DAPI. Konfokal optisk sektion af den basale og uddybning af transit region i en krypt isoleret fra tyktarmen ved hjælp af 3 mM EDTA og fast i methanol, vasket i PBS, som indeholder 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel. Krypten blev mærket med kanin polyklonale ninein antistoffer (Pep3, se også reference8, rød) og mus monoklonale E-cadherin antistof (grøn) og farves med DAPI (blå). Single channel-omvendt billede viser ninein kun. Billedet viser en velbevaret krypt med E-cadherin afslørende omridset af de enkelte celler og ninein koncentreret på de apikale centrosomes. Det tyder på god penetration af fiksativ og antistoffer, og bevarelsen af antigenicity. Skalalinjen = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig6.jpg"> 
Figur 6: Organoid udvikling, fiksering, og immuno-mærkning af isolerede organoids. (A) fase kontrast billeder viser forskellige faser af organoid udvikling fra celle aggregater til cyste med bud indledning og fuldt dannet organoids med krypt og villus domæner.(B-F) Konfokal optiske dele gennem organoids isoleret fra kælderen matrix ved hjælp af celle opsving løsning ved 4 ° C (10 min) efterfulgt af formaldehyd/metanol fiksering, vask i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, blokering i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og immuno-mærkning for mikrotubuli, β-catenin og EB1. (B) Organoid cyste mærket for mikrotubuli (blå) og β-catenin (rød) afslører god mikrotubulus bevarelse og mærkning i de fleste celler. (C) forskellige apico-basal mikrotubuli er tydelige i disse udvidede epitelceller fra en organoid cyste. (D) dividere celler mærket for mikrotubuli viser spindler herunder astral (dynamisk) mikrotubuli (pil). (E, F) Villus domæne (E) og krypten domæne (F) organoid regioner viser nogle EB1 mærkning langs gitter af stabil mikrotubuli, især i villus, mens meget få EB1 kometer ses selv inden for basal krypten tyder på, at dynamic Mikrotubuli ikke er blevet bevaret. Skalere barer = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig7.jpg"> 
Figur 7: Organoids fast i matrixen kælder i formaldehyd/methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og ninein. Konfokal optiske dele af organoids fast i formaldehyd/methanol, vasket og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel og mærket mens de resterende i matrixen kælder. (En-C) Organoid cyste mærket for mikrotubulus (grøn) og ninein (Pep3; reference8, red) og farves med DAPI (blå) viser det flettede billede i A og omvendt enkelt kanal billeder for mikrotubuli (B) og ninein (C). Billederne viser apico-basal mikrotubuli og apikale ninein lokalisering, tyder på meget god strukturel bevarelse af organoid og penetration af antistoffer samt rydning af ubundne antistoffer. (D, E) Organoid med udvikling af crypt fast og mærket som ovenfor og igen viser god strukturel bevarelse, mærkning og clearing af antistoffer. Forskellige apico-basal mikrotubuli og apikale n-MTOC ninein lokalisering er tydeligt og fremhævet i det forstørrede billede (E) af boxed regionen i D. Skalere barer = 10 μm (A-D); 5 μm (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig8.jpg"> 
Figur 8: Organoids fast i matrixen kælder i methanol og immuno-mærket for mikrotubuli og EB1. Konfokal optiske dele af organoids fast i methanol, vasket og blokeret i PBS, som indeholder 10% ged serum og 0,1% vaskemiddel og mærket, mens de resterende i matrixen kælder. (A) cyste domæne fra en fuldt udviklet organoid mærket med kanin polyklonale α-tubulin (rød) og mus monoklonale EB1 (grøn) antistoffer viser apico-basal mikrotubuli, spindler (pil) i to delende celler og særskilte EB1 kometer. Nogle diffusering af ubundne EB1 antistoffer er indlysende. Dog er god strukturel bevarelse og mærkning af mikrotubuli og EB1 observeret. Tilstedeværelsen af EB1 kometer tyder på, at dynamic mikrotubuli er bevaret (A, inverter). (B) Inverted billede af organoid cyste region viser α-tubulin antistof mærkning med betydelig antistoffer fanget inden for det omkringliggende kælderen matrix (pil). Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig9.jpg"> 
Figur 9: Organoids fast i matrixen kælder i 1% PFA og immuno-mærket for Lgr5 og CD24. Konfokal optiske dele af organoids fast i matrixen kælder i 1% PFA i PBS, som indeholder 0,1% vaskemiddel, vasket i PBS med 1% ged serum og 0,1% vaskemiddel, og mærket med antistoffer mod Lgr5 og CD24. (A, B) Stem cell niche i en krypt domæne viser Paneth cellerne positiv for CD24 (rød). Konfokal og fase kontrast billeder er blevet slået sammen i A. B viser enkelt kanal CD24 mærkning. (C) stamceller region inden for en krypt domæne viser en Lrg5 positive stamceller. Skalere barer = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56662/56662table1.jpg"> 
Tabel 1: tidslinje for lille tarm krypt og villi isolation og fiksering. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662table1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Vi præsenterer protokoller til isolation af intestinal 3D strukturer fra væv i vivo og in vitro- kælderen matrix indlejret organoids, og detaljer forskellige fiksering og farvning protokoller optimeret til immuno-mærkning af mikrotubulus, centrosomal og junctional proteiner samt som celle markører herunder stamceller protein Lgr5.

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Viral-medieret Mærkning og transplantation af Medial ganglioniske Eminence (MGE) Celler til<em&gt; In Vivo</em&gt; Undersøgelser

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo modeller til at studere hornhindeendothel-mesenkymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Behandling af menneskelige hjerte væv mod ekstracellulære Matrix selv samle Hydrogel for In Vitro og In Vivo applikationer

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknologi af primære mus intestinale Organoider ved hjælp af magnetisk nanopartikel Transduktionsvirale vektorer for frosne skæring

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo perfusion af rodent placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Sammenfatning af Suckling-til-fravænning overgang in vitro ved hjælp af føtale tarm Organoider

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...