Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
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Die Autoren danken Paul Thomas für Mikroskop-Beratung und Unterstützung. Dieses hier wurde unterstützt durch die BBSRC (keine zu gewähren. BB/J009040/1, M.M.M. und t.w.).

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	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. 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B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Isolierung von Darmgewebe Isolierung der kleinen Darm Krypten und Zotten und Kolon Krypten beinhaltet Freilegung der Schleimhautoberfläche, Behandlung mit EDTA Lösung Zellkontakte, Fraktionierung (schütteln) und Zentrifugation lösen. Die vorgestellten intestinalen Darmzotten/Krypta Isolierung Protokoll wurde von Belshaw Et Al. und Whitehead Et Al. modifiziert 17 , 18
Verfügbarmachen der Schleimhautoberfläche Wir haben mit einer Reihe von Ansätzen, die Schleimhautoberfläche des Verdauungstraktes bei der Entwicklung dieses Verfahrens aussetzen experimentiert. Ein klassischer Ansatz soll evert (innen nach außen drehen) das Rohr, in der Regel in Segmente ca. 100 mm lang, mit einem Metallstab, der in einer Falte des Gewebes an einem Ende und dann die restlichen Röhre gefangen ist glitt über die u-19. Für Maus Gewebe eignet sich ein Metallstab (2,4 mm Durchmesser) mit abgerundeten Enden. Dieser Ansatz hat den Vorteil der Schleimhautoberfläche ermöglicht besseren Zugang zu PBS und EDTA zu erweitern. Wir hatten ursprünglich verwendet diesen Ansatz aber zog in die Röhre in kurzen Längen (ca. 5 cm) schneiden und öffnen jeden Abschnitt mit Präparierscheren, wie dies erwies sich einfacher als. Diese Methode eignet sich, wenn nur wenige Darm erforderlich sind; aber wenn mehr Tiere werden in einem Experiment dann ein speziell gebaute Gerät verwendet für aufschneiden das Rohr längs, wie von Yoneda Et Al. beschrieben 14 wäre effizienter.
Ablösung der Zotten und Krypten von der Muskelschicht Zunächst haben wir 3 mM EDTA in PBS und relativ langen Inkubationszeiten von bis zu 60 min um der Schleimhautoberfläche aus den zugrunde liegenden Gewebe17,18zu lösen. Bei dieser Konzentration von EDTA fanden wir eine Inkubationszeit von 30 min ausreichend, Krypten von Maus Colon zu lösen war. Jedoch für die kleinen Darm Krypta/Villus Isolierung haben wir versucht, mit konzentrierter EDTA für eine kürzere Zeit, die einen effizienten Ansatz erwiesen. Alle nachfolgenden Arbeiten erfolgte mit Gewebe extrahiert, mit der 30 mM-EDTA-Technik Generierung von relevanten Fraktionen für Zotten und Krypten. Für Krypten wir gebündelt normalerweise 3-5 Fraktionen vor der Befestigung, aber es ist wichtig zu prüfen, ob diese die entsprechenden Fraktionen sind, wie die Zeiten eine Reihe von Faktoren wie z. B. Position entlang den Darm-Trakt, Alter der Maus, Entzündung, vorherige Diät hängen , etc. in ähnlicher Weise kann die Länge der Zeit, die das Gewebe muss im Anschluss an die EDTA Behandlung effektiv zu geschüttelt werden unter verschiedenen Bedingungen variieren. Das Ergebnis ist isolierte Gewebe Brüche mit einer Mischung aus Zotten und Krypten oder hauptsächlich Zotten oder Krypten (Abbildung 2). Da gibt es keine Zotten im Dickdarm, die Krypta-Extraktion kann erreichbar in einem Schritt durch Schütteln des Gewebes in der Röhre für 30 s. Diese Fraktionen können dann fixiert und für Immuno-Kennzeichnung verarbeitet werden.
Isolierung der intestinalen Organellen von Keller-matrix Isolierung der Organellen von Keller Matrix Domes kann mithilfe von Zelle-Recovery-Lösung erreicht werden. Die Lösung funktioniert, indem depolymerizing die gelierte Keller-Matrix, sondern die Temperatur um 2 bis 8 ° c betragen. Ein Wort der Warnung ist, dass dynamische Mikrotubuli nicht beibehalten werden können. Also, für Immuno-Kennzeichnung von dynamischen Mikrotubuli und + Tipps, wie die EBs-Zelle, Erholung von Keller-Matrix vor der Fixierung ist nicht zu empfehlen. Jedoch die meisten der Mikrotubuli in den differenzierenden organoide Zellen sind relativ stabil und diese blieben (Abbildung 6). Es funktionierte auch gut für Immuno-Kennzeichnung von centrosomal und Knoten Proteine sowie Zellenmarkierungen.
Fixierung-Protokolle Formaldehyd (frisch hergestellt aus PFA) ist ein relativ schnell wirkende Fixiermittel, die reversible Formen Vernetzungen und 4 % PFA eignet sich gut für z.B. in Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Gamma-Tubulin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Mehr verdünnen PFA Lösungen wie 1 % funktionierte gut für Immuno-Beschriftung z. B. mit der Stammzell-Marker Lgr5 und Paneth Zelle Marker CD24 innerhalb der Krypta Stammzellnische, während höhere Konzentrationen von PFA nicht funktioniert hat.
Der Zusatz von Glutaraldehyd gibt bessere Konservierung von Mikrotubuli und die so genannte PHEMO Fixierung besteht aus einer Mischung von 3,7 % PFA, 0,05 % Glutaraldehyd und 0,5 % Waschmittel in PHEMO Puffer (68-mM-Rohre, 25 mM HEPES, EGTA 15 mM und 3 mM MgCl2)2 bietet ausgezeichnete Erhaltungszustand der Mikrotubuli ohne Antigenität. Es funktioniert auch gut für Immuno-Kennzeichnung Gamma-Tubulin, β-Catenin und E-Cadherin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Jedoch in 3D Gewebe und organoide Kulturen, die PHEMO Fixierung inkonsistente Ergebnisse produziert und wurde deshalb nicht verwendet.
Methanol ist ein Gerinnungsmittel Fixiermittel, das relativ gute Penetration und tendenziell Antigenität zu bewahren. Fixierung mit 100 % Methanol (-20 ° C) führt einige Schrumpfung, gibt moderate Morphologie Erhaltung und arbeitet für Mikrotubuli, + Tipps und viele centrosomal Antikörper einschließlich Ninein in 2D Zellkulturen. Jedoch brach einige Organellen bei Verwendung dieser Methode der Fixierung. Darüber hinaus Eindringen von Antikörpern durch gesamte Krypten, Zotten oder Organellen war zunächst ein Problem aber die Zugabe von 0,1 % Waschmittel der Waschlösung und längeren waschen bessere Ergebnisse erzielt.
Eine Kombination von Formaldehyd und Methanol hatte früher von Rogers Et al. 20 , Immuno-Label EB1 in Drosophila. Eine Fixierung-Protokoll basiert auf einer Mischung aus Formaldehyd und Methanol wurde daher für Darmgewebe und Organellen basierend auf 3 % Formaldehyd und 97 % Methanol,-20 ° C gekühlt, aber weglassen der 5 mM Natriumcarbonat aus der Mischung, die von Rogers verwendet wurde Et Al. 20 Außerdem wurden Proben in der Tiefkühltruhe bei-20 ° c fixiert Dies funktioniert besonders gut für Immuno-Kennzeichnung + Tipps, wie CLIP-170 und der EBs, sondern erwies sich auch hervorragend für die Befestigung und Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Aktin in Gewebe und 3D Organellen. Sehr guter baulicher Erhaltung zeigte und Antigenität blieb für mehrere Zellskelett und assoziierte Proteine sowie centrosomal Proteine wie Gamma-Tubulin und Ninein, obwohl Kennzeichnung für Ninein konsequenter mit Methanol gearbeitet. Fixierung.

Bildung von Epithelien mit Apico-basale Polarität ist ein fundamentaler Prozess in der Entwicklung und beinhaltet eine dramatische Reorganisation von Mikrotubuli und centrosomal Proteine. Eine radiale Mikrotubuli Array ausgehend von einer zentral gelegenen centrosomal Mikrotubuli Organisation Zentrum (MTOC) ist prominent in vielen tierischen Zellen, und das ist gut geeignet für relativ flache Zellen. Im Gegensatz dazu montieren säulenartige Epithelzellen, wie diejenigen des Darms, nicht Radial transzelluläre Mikrotubuli-Arrays, die die Form und die spezielle Funktionen dieser Zellen besser zu unterstützen. Diese dramatische Reorganisation der Mikrotubuli wird durch den Umzug in die Spitze und apikalen nicht centrosomal MTOCs (n-MTOCs) bilden, Centrosome erreicht, die verantwortlich für die Verankerung des transzelluläre Mikrotubuli1,2 , 3 , 4 , 5.
Ein Großteil unseres Wissens über epithelialen Differenzierung und der damit verbundenen Mikrotubuli Reorganisation kommt aus Untersuchungen von 2D in Vitro Zellschichten, die die Gewebearchitektur in Vivo nicht angezeigt werden. Entwicklung von 3D in Vitro organoide Kulturen, vorangegangen durch Clevers und Kollegen6, stellt einen großen technologischen Fortschritt dar, wie sie in Vivo Architektur und Entwicklung imitieren. Eine Hierarchie der epithelialen Differenzierung spiegelt sich im Darm; Stammzellen am unteren Krypten geben Anlass zu unreif Transit verstärkt Zellen, die sich vermehren und allmählich zu unterscheiden, da sie die Gruft auf dem kleinen Darm Villus oder Kolon Oberfläche wandern wo sie vollständig vor unterschieden werden Schuppen Sie in das Lumen-7. Wichtig ist, ist dies im Darm Organellen repliziert, wo Zellen aus der Stammzellnische bildende Zysten wuchern, die anschließend Krypta-wie Knospen mit Stammzellen an der Unterseite und Differenzierung allmählich Fortschritte auf dem Weg der Zyste Region erzeugen, die Villus-wie8wird. Der Darm organoide stellt daher ein leistungsfähiges Modell, nicht nur Mikrotubuli und centrosomal Reorganisation bei epithelialen Differenzierung aber zahlreiche andere Proteine, sowie bietet eine ideale Plattform für das Screening von Medikamenten und Lebensmitteln zu studieren Verbindungen des therapeutischen Potentials nutzen9,10.
Organellen sind gut geeignet für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine und beide Knock-in und Knock Out Organellen mit CRISPR/Cas9 gen11,12Bearbeitung erzeugt werden können. Jedoch ist es wichtig, vor allem um das Verhalten der tagged Proteine überprüfen, zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine untersucht werden. Immuno-Beschriftung 3D Organellen gewachsen in Keller Matrix oder Ex Vivo isolierte Gewebe ist komplexer als Zellen in Kultur Gerichte in 2D angebaut. Die Fixierung-Protokoll muss die zarte 3D Architektur der Organellen zu erhalten Beibehaltung noch Antikörper Antigenität (d.h. die Epitope für die Bindung von Antikörpern). Beispielsweise 4 % Paraformaldehyd (PFA) wird allgemein als ein Fixiermittel verwendet, aber während es ein relativ schnelles Handeln Fixiermittel ist und guten morphologische Erhaltung gibt, nach unserer Erfahrung es häufig führt zu Verlust der Antigenität und eignet sich nicht für viele centrosomal Antikörper. Die Fähigkeit von Fixativ und Antikörpern 3D Strukturen und Gewebe eindringen sollte auch berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck haben wir modifiziert und entwickelten Protokolle für Gewebe isoliert und indirekte Immuno-Kennzeichnung der 3D in Vitro Organellen und Ex Vivo isoliert Darmgewebe. Wir beschreiben, wie kleine Darm Krypten und Zotten und Kolon Gewebe zu isolieren, und beinhalten ein Protokoll für die Isolierung von 3D Organellen als Alternative zur Festsetzung und Immuno-Kennzeichnung innerhalb der Keller-Matrix. Wir präsentieren Ihnen drei Alternativen Fixierung-Protokolle für die Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli und centrosomal, wie Ninein, und Mikrotubuli Plus-Ende Tracking-Proteine (+ Tipps), wie die EB Proteine und CLIP-170 (siehe auch Referenzen8, 13). Wir diskutieren auch die vor- und Nachteile jedes Protokoll zugeordnet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Das Aufkommen von 3D in-vitro- Organellen, die in Vivo Gewebearchitektur und Morphogenese imitieren hat die Fähigkeit, wichtige biologische Fragestellungen in Zell- und Entwicklungsbiologie stark vorangetrieben. Darüber hinaus verspricht Organellen zusammen mit technischen Fortschritten in gen bearbeiten und virale gen Lieferung, medizinische Forschung und Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Krankheiten zu gelangen. Organellen in Vitro im Keller Matrix gewachsen bieten leistungsstarke Modellsysteme für das Studium, das Verhalten und die Funktion von verschiedenen Proteinen und eignen sich gut für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine. Allerdings ist zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine in Gewebe Ex Vivo und in Vitro Organellen wichtig, das Verhalten der tagged Proteine zu überprüfen. Zu diesem Zweck haben wir entwickelt und modifiziert Gewebe Isolierung, Fixierung und Immuno-Kennzeichnung Protokolle für die Lokalisierung von Mikrotubuli, centrosomal und damit verbundenen Proteine im Darmgewebe Ex Vivo und in Vitro Darm Organellen. Das Ziel war, dass das Fixiermittel, 3D-Architektur der Organellen/Gewebe zu bewahren und auch gleichzeitig Antikörper Antigenität und ermöglicht gute Penetration und Räumung von Fixativ und Antikörper. Kälteexposition depolymerizes alle, aber stabilen Mikrotubuli und dies war ein Schlüsselfaktor, wenn Sie die verschiedenen Protokolle ändern. Wir fanden, dass die Erhöhung der Ethylenediaminetetraacetic Säuren (EDTA) Konzentration von 3 mM bis 30 mM effiziente Ablösung der Zotten und Krypten im Dünndarm gab, während 3 mM EDTA für Kolon Krypten ausreichte. Die entwickelten Formaldehyd/Methanol-Fixierung-Protokoll gab sehr guten baulichen Erhaltung Beibehaltung auch Antigenität für wirksame Kennzeichnung von Mikrotubuli, Actinfilamente und Ende-Bindeproteine (EB). Er arbeitete auch für das centrosomal Protein-Ninein, obwohl das Methanol-Protokoll konsequenter gearbeitet. Wir ergab weiter, dass Fixierung und Immuno-Kennzeichnung der Mikrotubuli und damit verbundenen Proteine mit Organellen von isoliert oder im Keller Matrix bleibt erreicht werden konnte.

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Viral-vermittelte Kennzeichnung und Transplantation von Medial Ganglienhügel (MGE) Zellen für<em&gt; In-vivo-</em&gt; Studien

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...