Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

लेखक माइक्रोस्कोप सलाह और सहायता के लिए पॉल थॉमस धंयवाद । यह काम यहां शामिल BBSRC द्वारा समर्थित (अनुदान सं था । BB/J009040/1 से M.M.M. और T.W.).

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	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. 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B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

आंत्र ऊतक के अलगाव छोटे आंत्र तहखाने और विल्ली और बृहदांत्र तहखाने के अलगाव श्लैष्मिक सतह को उजागर शामिल है, EDTA समाधान के साथ उपचार के लिए सेल संपर्क, आंशिकता ढीला (मिलाते हुए), और केंद्रापसारक । प्रस्तुत आंत्र विल्ली/तहखाना आइसोलेशन प्रोटोकॉल को Belshaw एट अल. और व्हाइटहेड एट अल से संशोधित किया गया है । 17 , 18
श्लैष्मिक सतह को उजागर हम इस प्रक्रिया के विकास में आंत्र पथ के श्लैष्मिक सतह का पर्दाफाश करने के लिए दृष्टिकोण के एक नंबर के साथ प्रयोग किया है । एक क्लासिक दृष्टिकोण एवर्ट के लिए है (अंदर बाहर बारी) ट्यूब, आमतौर पर क्षेत्रों के बारे में १०० mm लंबे समय में, एक धातु की छड़ है कि एक छोर पर ऊतक के एक गुना में पकड़ा और फिर शेष ट्यूब ट्यूब पर गिरावट का उपयोग कर रहा है19। माउस के ऊतकों के लिए, एक धातु रॉड (२.४ मिमी व्यास) गोल सिरों के साथ आदर्श है । इस दृष्टिकोण श्लैष्मिक और EDTA के लिए बेहतर पहुंच की अनुमति सतह के विस्तार का लाभ है । हम शुरू में इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, लेकिन कम लंबाई में ट्यूब काटने के लिए ले जाया गया (के बारे में 5 सेमी) और इस आसान साबित के रूप में कैंची विदारक के साथ प्रत्येक अनुभाग खोलने. यदि केवल कुछ आंतों की आवश्यकता हो तो यह दृष्टिकोण उचित है; लेकिन अगर और अधिक जानवरों के लिए एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा था तो एक उद्देश्य के लिए बनाया डिवाइस खोलने के लिए ट्यूब longitudinally, के रूप में Yoneda एट अल द्वारा वर्णित. 14 अधिक कुशल होगा ।
मांसपेशी परत से विल्ली और तहखाने की टुकड़ी शुरू में हम पंजाब में 3 मिमी EDTA का इस्तेमाल किया और ६० मिनट तक की अपेक्षाकृत लंबे समय की मशीन समय अंतर्निहित ऊतक17,18से श्लैष्मिक सतह ढीला । EDTA की इस एकाग्रता में हम 30 मिनट की एक मशीन समय पाया माउस बृहदांत्र से तहखाना ढीला करने के लिए पर्याप्त था । हालांकि, छोटी आंत के लिए तहखाना/अंकुर अलगाव हम एक छोटे समय के लिए और अधिक केंद्रित EDTA का उपयोग करने की कोशिश की, जो एक कुशल दृष्टिकोण साबित हुआ । बाद में सभी काम 30 मिमी EDTA विल्ली या तहखाने के लिए प्रासंगिक अंशों पैदा तकनीक का उपयोग कर निकाले ऊतक के साथ शुरू किया गया था । तहखाने के लिए, हम सामान्य रूप से फिक्सिंग से पहले अंशों 3-5, लेकिन यह जांचना महत्वपूर्ण है कि क्या इन समय के रूप में उपयुक्त अंश है आंत्र पथ के साथ स्थिति के रूप में कारकों की एक संख्या पर निर्भर करेगा, माउस की आयु, सूजन, पिछले आहार , आदि इसी प्रकार, समय की लंबाई ऊतक EDTA उपचार के बाद हिल करने के लिए प्रभावी होने की जरूरत है विभिन्न परिस्थितियों में भिन्न हो सकते हैं. परिणाम अलग ऊतक विल्ली और तहखाने या मुख्य रूप से या तो विल्ली या तहखाना (चित्रा 2) का एक मिश्रण युक्त भिन्न है. के रूप में वहां बृहदांत्र में कोई विल्ली हैं, तहखाना निष्कर्षण एक कदम में ट्यूब में ऊतक झटकों से प्राप्त करने के लिए हो सकता है 30 एस । इन अंशों को फिर bliss-लेबलिंग के लिए स्थिर और संसाधित किया जा सकता है.
आंत्र organoids के तहखाने मैट्रिक्स से अलगाव organoids के तहखाने मैट्रिक्स गुंबदों से अलगाव सेल वसूली समाधान का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । समाधान gelled तहखाने मैट्रिक्स depolymerizing द्वारा काम करता है, लेकिन तापमान 2-8 डिग्री सेल्सियस होने की जरूरत है । सावधानी का एक नोट है कि गतिशील microtubules संरक्षित नहीं किया जा सकता है । इस प्रकार, bliss के लिए-गतिशील microtubules की लेबलिंग और + EBs सेल के रूप में सुझाव, तहखाने मैट्रिक्स से निर्धारण से पहले वसूली की सिफारिश नहीं है । हालांकि, अंतर organoid कोशिकाओं में microtubules के अधिकांश अपेक्षाकृत स्थिर रहे है और ये (चित्रा 6) संरक्षित किया गया । यह भी centrosomal और जंक्शनीय प्रोटीन के bliss लेबलिंग के लिए अच्छी तरह से काम किया है और साथ ही सेल मार्करों ।
निर्धारण चलत Formaldehyde (हौसले से पीएफए से बने) एक अपेक्षाकृत तेजी से अभिनय निर्धारण है कि प्रतिवर्ती पार-लिंक रूपों और 4% पीएफए उदाहरण के लिए अच्छी तरह से काम करता है, bliss-लेबलिंग microtubules और गामा tubulin और actin के साथ धुंधला Phalloidin रेशा में । अधिक पतला पीएफए समाधान जैसे 1% bliss के लिए अच्छी तरह से काम किया-उदाहरण के लिए लेबलिंग, स्टेम सेल मार्करों Lgr5 और Paneth सेल मार्कर CD24 के साथ तहखाना स्टेम सेल आला के भीतर, जबकि पीएफए के उच्च सांद्रता काम नहीं किया.
glutaraldehyde के अलावा microtubules के बेहतर संरक्षण और तथाकथित PHEMO निर्धारण जो ३.७% पीएफए, ०.०५% glutaraldehyde और PHEMO बफर में ०.५% डिटर्जेंट (६८ मिमी पाइप, 25 मिमी HEPES, 15 मिमी EGTA और 3 मिमी MgCl2)2 का एक मिश्रण के होते है देता है antigenicity समझौता किए बिना microtubules के उत्कृष्ट संरक्षण देता है । यह भी bliss-लेबलिंग गामा-tubulin, β-catenin, और ई-cadherin, और actin के साथ धुंधला phalloidin रेशा के लिए अच्छी तरह से काम करता है । हालांकि, 3d ऊतक और organoid संस्कृतियों में, PHEMO निर्धारण असंगत परिणाम उत्पादित और इसलिए इस्तेमाल नहीं किया गया था ।
मेथनॉल एक कौयगुलांट निर्धारण है कि अपेक्षाकृत अच्छी पैठ देता है और antigenicity के संरक्षण के लिए आत्ममंथन करता है । १००% मेथनॉल के साथ निर्धारण (-20 डिग्री सेल्सियस) कुछ संकोचन परिचय, मध्यम आकृति विज्ञान संरक्षण देता है, और microtubules के लिए काम करता है, + युक्तियाँ, और 2d सेल संस्कृतियों में ninein सहित कई centrosomal एंटीबॉडी. हालांकि, इस निर्धारण विधि का उपयोग करते समय कुछ organoids ढह गई । इसके अलावा, पूरे तहखाने, विल्ली, या organoids के माध्यम से एंटीबॉडी के प्रवेश शुरू में एक समस्या थी, लेकिन धोने समाधान और लंबे समय तक धोने के लिए ०.१% डिटर्जेंट के अलावा बेहतर परिणाम हासिल किया ।
formaldehyde और मेथनॉल का एक संयोजन पहले रोजर्स एट अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था । २० ते bliss-लैबल EB1 मे Drosophila. formaldehyde और मेथनॉल के मिश्रण पर आधारित एक निर्धारण प्रोटोकॉल इसलिए आंतों के ऊतकों और organoids 3% formaldehyde और ९७% मेथनॉल ठंडा करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर आधारित के लिए विकसित किया गया था, लेकिन मिश्रण है कि रोजर्स द्वारा इस्तेमाल किया गया था से 5 मिमी सोडियम कार्बोनेट का लोप एट अल. 20 इसके अलावा, नमूनों को फ्रीजर में-20 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया गया था । यह bliss-लेबलिंग के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम किया + युक्तियां, क्लिप के रूप में-१७० और EBs, लेकिन यह भी फिक्सिंग और bliss लेबलिंग microtubules और ऊतक और 3 डी actin के भीतर organoids के लिए उत्कृष्ट साबित कर दिया । बहुत अच्छा संरचनात्मक संरक्षण स्पष्ट था और antigenicity कई cytoskeletal और जुड़े प्रोटीन के लिए संरक्षित किया गया था और साथ ही centrosomal प्रोटीन गामा के रूप में-tubulin और ninein, हालांकि ninein के लिए लेबल और मेथनॉल के साथ लगातार काम किया निर्धारण.

apico के साथ epithelia के गठन-बेसल ध्रुवीयता विकास में एक मौलिक प्रक्रिया है और microtubules और centrosomal प्रोटीन के एक नाटकीय पुनर्गठन शामिल है । एक रेडियल microtubule सरणी एक केंद्र स्थित centrosomal microtubule आयोजन केंद्र (MTOC) से उत्पंन कई पशु कोशिकाओं में प्रमुख है और यह अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सपाट कोशिकाओं के लिए अनुकूल है । इसके विपरीत, ऐसी आंत के उन के रूप में स्तंभ उपकला कोशिकाओं, गैर रेडियल transcellular microtubule arrays कि बेहतर आकार और इन कोशिकाओं के विशेष कार्यों का समर्थन इकट्ठा । microtubules के इस नाटकीय पुनर्गठन एपेक्स और शिखर गैर centrosomal MTOCs (n-MTOCs) के गठन, जो anchorage transcellular के microtubules के लिए जिंमेदार हो जाता है के लिए जा centrosome द्वारा हासिल की है1,2 , 3 , 4 , 5.
उपकला भेदभाव और संबद्ध microtubule पुनर्गठन के हमारे ज्ञान की बहुत 2d की जांच से आ गया है इन विट्रो सेल परतों है कि vivo ऊतक वास्तुकला में प्रदर्शित नहीं करते । इन विट्रो organoid संस्कृतियों में 3 डी का विकास, चालाक और सह कार्यकर्ता द्वारा बीड़ा उठाया है6, एक प्रमुख तकनीकी उंनति का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में वे vivo वास्तुकला और विकास में नकल । उपकला विभेद का एक पदानुक्रम आंत में स्पष्ट है; तहखाने के तल पर स्टेम कोशिकाओं अपरिपक्व पारगमन बढ़ाना कोशिकाओं है कि पैदा और धीरे अलग अंतर के रूप में वे छोटे आंत्र अंकुर या बृहदांत्र सतह, जहां वे पूरी तरह से किया जा रहा से पहले विभेदित पर तहखाने प्रवास को जंम दे लुमेन7में बहाया । महत्वपूर्ण बात, इस आंत्र organoids में दोहराया है, जहां स्टेम सेल आला से कोशिकाओं पैदा बनाने अल्सर है कि बाद में स्टेम सेल के साथ नीचे और विभेदन धीरे पुटी क्षेत्र की दिशा में प्रगति में तहखाने की तरह पैदा होता है, जो8तरह अंकुर बन जाता है । आंतों organoid इसलिए का प्रतिनिधित्व करता है एक शक्तिशाली मॉडल का अध्ययन करने के लिए न केवल microtubule और centrosomal पुनर्गठन के दौरान उपकला भेदभाव लेकिन कई अन्य प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में दवाओं और भोजन की स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श मंच प्रदान संभावित चिकित्सीय लाभ के यौगिकों9,10.
Organoids अच्छी तरह से रहने के लिए अनुकूल है फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन की इमेजिंग और दोनों दस्तक में और नॉक आउट Organoids CRISPR/Cas9 जीन संपादन11,12का उपयोग कर उत्पंन किया जा सकता है । हालांकि, अंतर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की स्थापना के लिए अध्ययन किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से टैग प्रोटीन के व्यवहार को सत्यापित करने के लिए । bliss-लेबलिंग 3d organoids तहखाने मैट्रिक्स या पूर्व vivo में उगाया पृथक ऊतक 2 डी में संस्कृति व्यंजन में उगाई कोशिकाओं से अधिक जटिल है । निर्धारण प्रोटोकॉल organoids के नाजुक 3d वास्तुकला के संरक्षण जबकि अभी भी एंटीबॉडी antigenicity (यानी, बाध्यकारी एंटीबॉडी के लिए epitopes) संरक्षण की जरूरत है । उदाहरण के लिए, 4% paraformaldehyde (पीएफए) आमतौर पर एक निर्धारण के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन जब यह एक अपेक्षाकृत तेजी से अभिनय निर्धारण है और अच्छा रूपात्मक संरक्षण देता है, हमारे अनुभव में यह antigenicity के नुकसान में अक्सर परिणाम है और कई के लिए उपयुक्त नहीं है centrosomal एंटीबॉडी. 3d संरचनाओं और ऊतक घुसना करने के लिए निर्धारण और एंटीबॉडी की क्षमता पर भी विचार किया जाना चाहिए । इस अंत करने के लिए, हम संशोधित किया है और ऊतक अलगाव और अप्रत्यक्ष bliss-3 डी के लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल का विकास इन विट्रो organoids और पूर्व vivo अलग आंत्र ऊतक । हम वर्णन कैसे छोटे आंत्र तहखाना और विल्ली और बृहदांत्र ऊतक अलग करने के लिए, और एक विकल्प के रूप में 3d organoids के अलगाव के लिए फिक्सिंग और bliss के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल-लेबलिंग तहखाने मैट्रिक्स के भीतर । हम microtubules और centrosomal प्रोटीन के bliss-लेबलिंग के लिए तीन वैकल्पिक निर्धारण प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जैसे ninein, और microtubule प्लस-एंड ट्रैकिंग प्रोटीन्स (+ टिप्स), जैसे EB प्रोटीन्स और क्लिप-१७० (देखें भी8संदर्भ, 13). हम भी पेशेवरों और प्रत्येक प्रोटोकॉल के साथ जुड़े विपक्ष पर चर्चा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

इन विट्रो organoids में 3 डी के आगमन कि vivo ऊतक वास्तुकला और morphogenesis में नकल बहुत सेल और विकास जीव विज्ञान में प्रमुख जैविक प्रश्नों का अध्ययन करने की क्षमता को उंनत किया है । इसके अलावा, जीन संपादन और वायरल जीन वितरण में हाल ही में तकनीकी प्रगति के साथ एक साथ organoids को चिकित्सा अनुसंधान और रोगों के उपचार के लिए नई दवाओं के विकास के अग्रिम वादों । Organoids तहखाने मैट्रिक्स में इन विट्रो में उगाया व्यवहार और विभिंन प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली मॉडल सिस्टम प्रदान करते है और अच्छी तरह से रहने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट के इमेजिंग-टैग प्रोटीन । हालांकि, अभिव्यक्ति और पूर्व vivo ऊतक में अंतर्जात प्रोटीन की स्थानीयकरण की स्थापना और इन विट्रो organoids में टैग प्रोटीन के व्यवहार को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस अंत करने के लिए हम विकसित और संशोधित ऊतक अलगाव, निर्धारण, और bliss-लेबलिंग प्रोटोकॉल microtubules, centrosomal के स्थानीयकरण के लिए, और पूर्व vivo आंत्र ऊतक में और में जुड़े प्रोटीन इन विट्रो आंत्र organoids. उद्देश्य निर्धारण के लिए था organoids/ऊतक के 3 डी वास्तुकला के संरक्षण जबकि यह भी एंटीबॉडी antigenicity के संरक्षण और अच्छी पैठ और निर्धारण और एंटीबॉडी की मंजूरी सक्षम करने के लिए । सभी लेकिन स्थिर microtubules ठंड depolymerizes के संपर्क में है और यह एक महत्वपूर्ण कारक था जब विभिंन प्रोटोकॉल को संशोधित । हमने पाया है कि ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) एकाग्रता 3 मिमी से 30 मिमी की वृद्धि की छोटी आंत में विल्ली और तहखाने की कुशल टुकड़ी दी जबकि 3 मिमी EDTA बृहदांत्र तहखाने के लिए पर्याप्त था । विकसित formaldehyde/मेथनॉल निर्धारण प्रोटोकॉल ने बहुत अच्छा संरचनात्मक संरक्षण दिया जबकि microtubules, actin, और एंड-बाइंडिंग (EB) प्रोटीन के प्रभावी लेबलिंग के लिए antigenicity का संरक्षण भी किया । यह भी centrosomal प्रोटीन ninein के लिए काम किया हालांकि मेथनॉल प्रोटोकॉल अधिक लगातार काम किया । हम आगे की स्थापना की है कि निर्धारण और bliss-microtubules के लेबल और संबंधित प्रोटीन से अलग organoids के साथ प्राप्त किया जा सकता है या तहखाने मैट्रिक्स के भीतर शेष ।

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids (Video) | JoVE

हम vivo ऊतक में से आंतों 3d संरचनाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान और इन विट्रो तहखाने मैट्रिक्स एंबेडेड organoids, और विस्तार से अलग निर्धारण और दाग प्रोटोकॉल microtubule के bliss-लेबलिंग के लिए अनुकूलित, centrosomal, और जंक्शन प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्टेम सेल प्रोटीन Lgr5 सहित सेल मार्करों ।

bliss-फ्लोरोसेंट लेबलिंग के Microtubules और Centrosomal प्रोटीन में पूर्व Vivo आंत्र ऊतक और 3 डी इन विट्रो आंत्र Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies (Video) | JoVE

के लिए वायरल की मध्यस्थता लेबल और औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता का ट्रांसप्लांटेशन MGE () प्रकोष्ठों<em&gt; Vivo</em&gt; अध्ययन

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition (Video) | JoVE

इन विट्रो में और vivo मॉडल में अध्ययन करने के कॉर्नियल Endothelial-mesenchymal संक्रमण

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion (Video) | JoVE

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains (Video) | JoVE

वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications (Video) | JoVE

Extracellular मैट्रिक्स की ओर मानव कार्डियक ऊतक के प्रसंस्करण स्व-कोडांतरण Hydrogel के लिए इन विट्रो में और Vivo में अनुप्रयोगों

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids (Video) | JoVE

मानव आंत्र Organoids में उपकला बाधा पारगम्यता के वास्तविक समय माप

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning (Video) | JoVE

जमे हुए अनुभाग के लिए चुंबकीय नैनोकण ट्रांसडक्शन वायरल वेक्टर्स का उपयोग प्राथमिक माउस आंत्र organoids की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence (Video) | JoVE

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta (Video) | JoVE

Rodent अपरा के Ex Vivo छिड़काव

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids (Video) | JoVE

भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को संक्षिप्त करना

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...