Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
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著者は、顕微鏡のアドバイスと支援ありがとうポール ・ トーマス。ここに関与するこの仕事は、BBSRC によって支えられた (付与なし。M.M.M. と t. w. BB/J009040/1)。

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

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腸組織の分離 小さな腸陰窩と絨毛と体液の分離には、粘膜面、遠心分離、分別 (揺れ) 細胞の接触を緩和する EDTA 溶液処理を公開することが含まれます。提示された腸絨毛/地下室の隔離のプロトコルは、補酵素 aらとホワイト ヘッドらから変更されています。17,18
粘膜面を公開します。 我々 は、この手順の開発で腸管の粘膜表面を公開する方法の数を試しましたが。古典的なアプローチは (ターン内側) を片脚に管では、通常約 100 mm 長い、セグメントは 1 つの端をクリックし、残りのチューブで組織のひだでキャッチ金属の棒を使用してチューブ19に下落しました。マウス組織、角の丸い金属の棒 (直径 2.4 mm) が理想的です。このアプローチには、PBS と EDTA へのアクセスを許可する粘膜の表面を拡大しての利点があります。我々 は当初、このアプローチを使用が、移動距離が短い (約 5 cm) に、管を切断しこれは容易に証明されるようにはさみを解剖と各セクションを開きます。このアプローチは、適切な場合にのみ、いくつかの腸が必要です。多くの動物がするかどうか、デバイスを使用実験で、専用切削オープン チューブ縦、米田らによって記述されました。14はより効率的になります。
絨毛と陰窩筋層からの剥離 最初基になる組織17,18から粘膜を緩める 3 mM PBS と比較的長い潜伏時間最大 60 分の EDTA を使用しました。EDTA のこの集中でわかったインキュベーション時間は 30 分マウス結腸から陰窩を緩めるのに十分です.ただし、小腸クリプト/絨毛隔離のため我々 は効率的な方法であることを証明する短い時間のより集中 EDTA を使用してみました。すべての後の作品は、絨毛やへんとう陰窩に関連する分数を生成する 30 mM EDTA 法を用いて抽出した組織で行われました。陰窩、我々 は通常、修正する前に分数 3-5 をプール、それはタイミングが腸管に沿って位置などの要因の数、マウス、炎症、以前ダイエットの年齢に依存しているので、適切な分数がこれらかどうかを確認することが重要、など同様に、組織は次の効果を発揮する EDTA 処理に動揺するのに必要な時間の長さが異なる条件下で異なる場合があります。結果は絨毛と陰窩または主に絨毛または陰窩 (図 2) の混合物を含む分離組織画分です。クリプト抽出が 30 の管の組織を揺することによって 1 つのステップで達成可能かもしれない大腸に絨毛がない、s。これらの画分は固定および免疫ラベリング処理できます。
地下の行列から腸オルガノイドの分離 地下行列ドームからオルガノイドの分離は、細胞の回復ソリューションを使用して実現できます。低ゲル化地下行列が 2-8 ° c. に温度のニーズによってソリューションの作品注意は動的微小管が保持されないがあります。したがって、動的微小管の免疫標識のように、+ EBs セルなどのヒントは、固定する前に地下の行列からの回復はお勧めしません。しかし、器官毛細細胞における微小管のほとんどが比較的安定している、これらの保存された (図 6)。また、centrosomal と接合部のタンパク質として細胞マーカーの免疫標識のためによく働いた。
固定のプロトコル (新鮮な PFA 製) ホルムアルデヒドはリバーシブルを形成する比較的速効定着剤クロスリンクし、4 %pfa 免疫標識の微小管と γ-チューブリンとファロイジンで染色のアクチン フィラメントの例のためによく働きます。希薄 PFA の高濃度が動作しませんでした、クリプト幹細胞ニッチ内幹細胞マーカー Lgr5 およびパネート細胞マーカー CD24 など免疫標識のためによく働いた 1% など PFA 溶液です。
グルタルアルデヒドの追加を与える微小管と 3.7 %pfa、0.05% グルタルアルデヒド PHEMO バッファー (68 mM パイプ、25 mM HEPES、15 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 3 mM MgCl2)2で 0.5% 洗剤の混合物から成っているいわゆる PHEMO 固定のより良い保全抗原性を損なうことがなく微小管の優れた保護を提供します。それはまたファロイジンで染色のアクチン フィラメントと E-カドヘリン、β-カテニンは、γ-チューブリンの免疫標識のためによく働きます。ただし、3 D ティッシュ、器官毛細文化 PHEMO 固定は矛盾した結果を生成、使用されませんでしたので。
メタノールは、比較的良好な浸透を与える、抗原性を維持するために傾向がある凝集剤の定着剤です。100% メタノール (-20 ° C) の固定いくつかの収縮を紹介し、適度な形態保全と微小管、+ のヒント、および 2 D 細胞培養で ninein を含む多くの centrosomal の抗体のために働きます。ただし、この固定方法を使用する場合、いくつか organoids が崩壊しました。また、全体の陰窩、絨毛、または organoids を介して抗体の浸透は当初、問題が、洗浄ソリューションおよび長期の洗濯に洗剤を 0.1% 添加がより良い結果を達成しました。
ホルムアルデヒド ・ メタノールの組み合わせは、ロジャースらによって以前使用されていた20で免疫ラベル EB1ショウジョウバエ。ホルムアルデヒドの混合物に基づいて固定プロトコルとメタノールしたがって腸組織と 3% ホルムアルデヒドと 97% メタノール-20 ° C に冷やしてがロジャースによって使用された混合物から炭酸ナトリウム 5 mM を省略に基づくオルガノイドのため開発されました。ら。20また、サンプル-20 ° C で冷凍庫で修正されましたこれは特に免疫標識の井戸 + クリップ 170 など、EBs のヒントを働いたが、固定と免疫標識の微小管とアクチン組織と 3 D organoids 内の優れたはまた証明しました。非常に良い構造保全は明らかと抗原性が γ-チューブリンなど ninein、centrosomal 蛋白質と同様、いくつかの細胞骨格と関連付けられているタンパク質の維持されたメタノールより一貫して働いた ninein のラベルが固定。

政井上皮の形成は開発における基本的なプロセスを微小管と centrosomal 蛋白質の劇的な再構成が含まれます。放射状の微小管配列整理センター位置 centrosomal 微小管から発せられる (脂質) は多くの動物細胞で顕著で、比較的フラット電池に適して。対照的に、腸のような円柱状の上皮細胞より良い形状とこれらの細胞の特別な機能をサポートしている非ラジアル transcellular 微小管配列を組み立てます。Transcellular 微小管1,2のアンカレッジの責任となる頂点とを形成し、根尖部の非 centrosomal MTOCs (n MTOCs) へ移動体による微小管のこの劇的な再編を実現します。,3,4,5。
上皮細胞の分化と関連する微小管再構成の私達の知識の多くは、生体内で組織アーキテクチャを表示しない 2 Dの in vitro細胞層の調査から来ています。Clevers や同僚6、によって開拓された organoid 文化 3 D培養の開発はように模倣体内アーキテクチャと開発主要な技術の進歩を表します。上皮細胞の分化の階層は腸; で明らか陰窩の下部に幹細胞増殖し、徐々 に、彼らは完全に前に差別になる小さな腸粘膜や大腸の表面にクリプトを移行するを区別するためのセルを増幅未熟なトランジットを生じ7ルーメンに流した。重要なは、これがどこ幹細胞のニッチから細胞増殖形成嚢胞その後下部と嚢胞領域に向かって徐々 に進んで分化細胞とクリプトのような芽を生成する腸 organoids にレプリケートされます。絨毛のような8になります。腸器官毛細のためだけでなく微小管と薬と食品のスクリーニングのための理想的なプラットフォームを提供することと同様に、上皮細胞の分化が、他の多くの蛋白質の中に centrosomal の再編を検討する強力なモデルを表す化合物の潜在的な治療の利点9,10。
Organoids、蛍光付けられた蛋白質のライブ イメージングに適して両方ノック- と編集11,12CRISPR/Cas9 遺伝子を用いたノックアウト オルガノイドを生成できます。しかし、式と勉強する内因性のタンパク質の局在化の確立は重要な特にタグ付きタンパク質の動作を確認します。免疫標識 3 D organoids 地下マトリックスまたはex vivo分離の成長組織は 2 D で培養皿で育った細胞よりも複雑です。固定のプロトコルは (すなわち、結合の抗体のエピトープ) 抗体の抗原性を維持したままオルガノイドの繊細な 3 D 構造を維持する必要があります。たとえば、4% パラホルムアルデヒド (PFA)、定着剤として使用されますが、比較的迅速な演技の定着剤と形態のよい保存を与える、私たちの経験でそれ頻繁抗原性が失われる結果、多くには適していませんcentrosomal 抗体。3 D 構造と組織に浸透する定着剤および抗体の能力を考慮も必要があります。このためには、我々 が変更し、組織分離と 3 Dの in vitro organoids とex vivoの間接免疫標識の開発されたプロトコルが腸組織を分離しました。固定して地下マトリックス内免疫標識の代替として 3 D オルガノイドの隔離のためのプロトコルで、小さい腸陰窩と絨毛と大腸の組織を分離する方法をについて説明します。微小管と、ninein などの centrosomal 蛋白質 (参照も参照8、EB タンパク質やクリップ 170 など微小管プラス端までトラッキング蛋白質 (+ ヒント) 免疫標識の 3 つの代替固定のプロトコルを提案します。 13)。各プロトコルに関連付けられている賛否両論についても述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

体内の組織構造や形態形成を模倣する 3 Dの in vitroオルガノイドの出現細胞と発生生物学の主要な生物学的質問を勉強する能力は大きく進歩しました。さらに、遺伝子編集とウイルス遺伝子導入の技術進歩と共にオルガノイド医学研究と疾患の治療のための新薬の開発を進めることを約束します。Organoids 栽培体外地下行列の動作と様々 なタンパク質の機能を研究するため強力なモデル システムを提供して、蛍光付けられた蛋白質のライブ イメージングに適しています。ただし、 ex vivo体内と体外式と内因性のタンパク質の局在を確立する organoids はタグ付きタンパク質の動作を確認することが重要。この目的のために開発し、組織の分離、固定および腸オルガノイド培養 ex vivo腸管組織に微小管、centrosomal、および関連付けられている蛋白質の局在の免疫分類のプロトコルを変更します。また抗体抗原性を維持し、良好な浸透と定着剤および抗体のクリアランスを有効にしながらオルガノイド培養用の 3 D 構造を維持する定着剤の目的であった。寒さへの暴露は、安定した微小管がすべて depolymerizes し、さまざまなプロトコルを変更する場合、これは重要な要因だった。エチレンジアミン酸 (EDTA) 濃度 3 mM から 30 mM に絨毛と小腸の陰窩の効率的な剥離を与えたこと 3 ミリメートルの EDTA はでしたが体液がわかった。開発したホルムアルデヒド ・ メタノール固定プロトコルは、微小管、アクチン、および結合 (EB) 蛋白質の効果的な分類のための抗原性を維持しながら非常に良い構造保全を与えた。メタノールのプロトコルはより一貫して働いていたが、また centrosomal タンパク質 ninein の働いた。さらに、固定と微小管と関連するタンパク質の免疫標識を organoids から分離したまたは地下マトリックス内に残ると達成できることを設立しました。

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

体内組織から腸管の 3 D 構造の隔離のためのプロトコルを提案して地下行列体外埋め込み organoids、ディテールの異なる固定と、微小管の免疫分類のために最適化されたプロトコルを汚すcentrosomal、および接合部のタンパク質だけでなく細胞マーカー Lgr5 幹細胞タンパク質を含みます。

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞<em&gt;インビボ</em&gt;研究

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...