Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Forfatterne takker Paul Thomas for mikroskop råd og hjelp. Dette arbeidet involvert her ble støttet av BBSRC (gi nei. BB/J009040/1 M.M.M. og T.W.).

Alle metodene som er beskrevet her ble utført i henhold til University of East Anglia's institusjonelle lisens retningslinjer.
1. isolering av tarmen Tissue
<ol>
	<li>Isolasjon i colonic Krypter for immuno-merking (se figur 1, skjematisk)
	<ol>
		<li>Euthanize musen (med CO2 kvelning) og fjerne tykktarmen (begynnelsen på caecum og utpakking caudally) med dissekere saks og pinsett14.</li>
		<li>Tømme innholdet i tykktarmen med fosfat bufret saltvann (PBS) ved hjelp av en glass pipette med gummi pære. PBS: natriumklorid (8.0 g/L), kalium klorid (0.2 g/L), disodium hydrogen fosfat (1,15 g/L) og kalium dihydrogen fosfat (0.2 g/L), ved pH 7.3.</li>
		<li>Bruk en metall stang (2,4 mm diameter) eller slutten av en glass pipette, hold en ende av colonic røret mens forsiktig skyve vev over stang/pipette dermed everting colonic vev slik at epitel er nå på utsiden. Merk: Hvis denne ikke er mulig da åpne kolon med saks og skive i 5 mm biter.</li>
		<li>Overføre everted tykktarm eller stykker til en 50 mL konisk rør som inneholder 40 mL PBS.</li>
		<li>Invertere røret for flere ganger å lenger fjerne intestinal innholdet, slim, osv.</li>
		<li>Overføre kolon/bitene til 40 mL 3 mM EDTA i PBS og ruge ved romtemperatur (RT) i 15 min. Merk: Fortynne 0,5 M EDTA pH 8.0 lager med PBS.</li>
		<li>Rist for å fjerne slim og overføre kolon/bitene til en 50 mL konisk rør som inneholder ferske 40 mL 3 mM EDTA i PBS. Inkuber for 35 min på RT.</li>
		<li>Overføre kolon/bitene til 10 mL PBS i et 50 mL konisk rør og rist kraftig for 30 s å løslate crypts (krypten brøkdel).</li>
		<li>Fjern kolon/brikker fra røret og plasser tilbake i 3 mM EDTA i tilfelle ytterligere isolasjon er nødvendig. Sentrifuge gjenværende krypten brøken på 300 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern 5 mL nedbryting av og resuspend krypten pellet i resterende 5 mL volumet.</li>
		<li>Observere under et stereomicroscope med zoom (50-100 X forstørrelse) etter tilstedeværelsen av colonic Krypter. Merk: Hvis det er ingen Krypter stede deretter ruge kolon/bitene i 3 mM EDTA i PBS for en annen 30 min og gjentar trinn 1.1.8 - 1.1.11.</li>
		<li>Sentrifuge krypten brøken på 300 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern alle nedbryting for å skaffe hemmelig pellets og fortsette umiddelbart til fiksering (del 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isolering av små intestinal Krypter og villi for immuno-merking (figur 2)
	<ol>
		<li>Euthanize mus (med CO2 kvelning) og fjerne tynntarmen (proksimale tolvfingertarmen til terminal ileum) med dissekere saks og pinsett14. Merk: Å vise ulike deler av tynntarmen så på dette stadiet separate og behandle separat. Se figur 1 og tabell 1 for et dataflytskjema og timing.</li>
		<li>Tømme innholdet i tynntarmen med PBS med en glass pipette med gummi pære.</li>
		<li>Klippes tynntarmen med dissecting saks og plasser i 15 mL PBS i en Petriskål.</li>
		<li>Forsiktig vaske tarmen i PBS fjerne luminal innhold mens ikke skade slimhinnen. Overføre vev til en frisk Petriskål gjenta PBS vask.</li>
		<li>Skjær tarmen i 3-5 mm biter og overføre til en 100 mm Petriskål som inneholder 15 mL 30 mM EDTA i PBS og ruge for 5 min på RT. alternativt ruge i 3 mM EDTA i PBS i 30 min.</li>
		<li>Del 1 (Villi isolasjon): overføre intestinal stykker til 10 mL PBS 50 mL konisk rør, rist kraftig for 10 s og hell i en 100 mm Petriskål. Sjekk brøken for isolert villi under en stereomicroscope. På dette stadiet, hovedsakelig villi bør være tilstede, men dette kan variere mellom isolasjoner. Merk: For å hindre isolerte villi/Krypter stikker til plast, Petri retter og samling rør skal pre belagt med fosterets Bovine Serum (FBS). Hell FBS i retter og/eller rør og umiddelbart fjerne den. Se tabell 1 for timing guider for hver fraksjon.</li>
		<li>Overføre intestinal brikkene inn 30 mM EDTA i PBS og ruge i 5 min. Under denne inkubasjonen, samle del 1 i en 15 mL konisk rør (precoated med FBS) og sentrifuge 300 x g for 5 min.</li>
		<li>Del 2: Overføre intestinal stykker til en 50 mL konisk rør som inneholder 10 mL PBS, rist kraftig for 20 s og og hell i en 100 mm Petriskål. Sjekk brøkdel under mikroskopet. Vanligvis på dette stadiet en blandet kultur av villi og Krypter, presentere (figur 2A).</li>
		<li>Overføre intestinal biter tilbake til 30 mM EDTA i PBS og ruge for ytterligere 5 min. Under denne inkubasjon pellets brøkdel 2 i en 15 mL konisk tube (precoated med FBS) på 300 x g for 5 min. fjerne nedbryting fra fraksjoner 1 og 2 uten å forstyrre pellet og fortsette umiddelbart til fiksering (trinn 3).</li>
		<li>Del 3 (krypten isolasjon): overføre intestinal stykker til 10 mL PBS 50 mL tube, riste for 20 s og hell i en 100 mm Petriskål. Sjekk brøkdel under mikroskopet. På dette stadiet inneholder brøkdel hovedsakelig crypts (figur 2B).</li>
		<li>Del 4: Overføre intestinal stykker til 10 mL PBS, riste for 20 s og hell i en 100 mm Petriskål. Sjekk brøkdel under mikroskopet. På dette stadiet skal bare Krypter vises.</li>
		<li>Del 5: Overføre intestinal stykker til 10 mL PBS, riste for 20 s og hell i en 100 mm Petriskål. Sjekk brøkdel under mikroskopet. Vanligvis på dette stadiet pakkes svært få Krypter. Hvis mer enn noen få crypts er pakket ut, deretter fortsette med en 6th brøkdel. Merk: Hvis en ren krypten befolkning er ønskelig (for eksempel for organoid generasjon), deretter bruke en 70 µm celle sil fjerne alle intakt villi fra krypten-beriket brøkdel.</li>
		<li>Samle fraksjoner 3-5 i separate 15 mL konisk rør og sentrifuge 300 x g for 5 min.</li>
		<li>Sjekk pellets fraksjoner 3 - 5 og fjerne supernatants uten å forstyrre pellets og videre umiddelbart til fiksering (del 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.Isolering av Intestinal Organoids fra kjelleren Matrix kupler i 24-vel plater
Merk: Dannelsen av organoids i kjelleren matrix kupler har vært beskrevet andre steder12.
<ol>
	<li>Coat brønner med kjelleren matrix kuppel i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Vask brønner som inneholder kjelleren matrix kupler med 500 µL av PBS.</li>
	<li>Tilsett kaldt 250 µL av cellen gjenopprettingsløsning (4 ° C) hver brønn (se Tabell for materiale). Merk: Gjenopprettingsløsning kaldt cellen vil depolymerize alle, men stabil piskehale som henger.</li>
	<li>Skrape kjelleren matrix kupler bruker P1000 brønnene og nøye Pipetter opp og ned i brønnen til bruddet og fjerne kjelleren matrix av plast.</li>
	<li>Samle nedbryting i 1,5 mL lav bindende microcentrifuge rør.</li>
	<li>Invertere 1,5 mL lav bindende røret flere ganger og se under mikroskopet om organoids har vært isolert og fritt flytte og ikke i klumper. Hold røret under en stereomicroscope og visningen under lav (50 X) forstørrelse.</li>
	<li>Pellets til organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min på RT.</li>
	<li>Fjerne utvinning reagensen og videre umiddelbart til fiksering (trinn 3).</li>
</ol>
3. fiksering av isolerte tarmen Tissue og Organoids
<ol>
	<li>Metanol fiksering
	<ol>
		<li>Resuspend isolert intestinal krypten/villus brøken i 10 mL og organoids i 1 mL av metanol på 20 ° C.</li>
		<li>Inkuber Krypter/villi/organoids på 20 ° C i en fryser i 15 min og invertere lysrør hver 5 min.</li>
		<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern metanol og legge vask løsning (1 mL for organoids og 10 mL for isolert krypten/villus brøker). Vask løsningen kan enten bestå av PBS med 1% serum- eller PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum. Merk: Bruk serum fra samme art som sekundær antistoffer. For eksempel hvis sekundære antistoffer ble generert i geit deretter bruke geit serum.</li>
		<li>Umiddelbart, sentrifuge Krypter/villi/organoids 1000 x g for 5 min til pellets.</li>
		<li>Fjern vask løsningen og resuspend Krypter, villi, organoids i frisk vask løsning.</li>
		<li>Plasser på et rør rotator med hastigheten satt til 20 rpm. Vask celler for totalt 1 h, pelleting Krypter, villi, organoids med sentrifugering (1000 x g i 5 min) hver 15 min og erstatte vaskeløsning. Merk: Hvis et rør rotator ikke er tilgjengelig deretter Inverter rør manuelt hver 5 min for å resuspend isolert kulturer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formaldehyd/metanol fiksering Merk: Håndtere fiksativene og formaldehyd i avtrekksvifte.<ol>
		<li>Resuspend de isolerte Krypter/villi i 10 mL eller organoids i 1 mL av 20 ° C etappe, den stabiliserende løsning (9.2 mL av metanol med 800 µL av formaldehyd løsning).</li>
		<li>Fastsette Krypter, villi, organoids på 20 ° C i en fryser i 15 min og invertere røret hver 5 min.</li>
		<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern formaldehyd/metanol og legge vask løsning (1 mL organoids eller 10 mL for isolert Krypter/villus brøker). Vask løsningen kan enten bestå av PBS med 1% geit serum- eller PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum.</li>
		<li>Sentrifuge 1000 x g for 5 min til pellets Krypter, villi, organoids.</li>
		<li>Fjern vask løsningen og resuspend i frisk vask løsning.</li>
		<li>Plasser på et rør rotator med hastigheten satt til 20 rpm. Vask celler for totalt 1 h, pelleting Krypter, villi, organoids med sentrifugering (1000 x g i 5 min) hver 15 min og erstatte vaskeløsning.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PFA fiksering FORSIKTIG: PFA pulver og løsninger skal håndteres i avtrekksvifte. Merk: I de fleste tilfeller 4% PFA i PBS brukes, men avhengig av bevaring av antistoff antigenicity, lave konsentrasjoner kan brukes.<ol>
		<li>Resuspend de isolerte pelleted Krypter/villi 10 mL 4% PFA ruge på RT 1t og den isolerte pelleted organoids i 1 mL 4% PFA og Inkuber i 30 min. I begge tilfeller Inverter lysrør hvert 10 min.</li>
		<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern PFA og legge vask løsning (1 mL for organoids og 10 mL for isolert Krypter/villi). Vask løsningen består av PBS med 0,1% vaskemiddel og 1% serum.</li>
		<li>Sentrifuge 1000 x g for 5 min til pellets Krypter/villi/organoids.</li>
		<li>Fjern vask løsningen og resuspend i frisk vask løsning.</li>
		<li>Plasser på et rør rotator med hastigheten satt til 20 rpm. Vask celler for totalt 1 h, pelleting Krypter, villi, organoids med sentrifugering (1000 x g i 5 min) hver 15 min og erstatte vaskeløsning. Merk: Hvis et rør rotator ikke er tilgjengelig deretter Inverter rør manuelt hver 5 min for å resuspend isolert kulturer.</li>
		<li>Antigen henting (valgfritt trinn anbefales for PFA fiksering)<ol>
			<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min og fjerne nedbryting.</li>
			<li>Legg til 1-10 mL 10 mM natriumsitrat pH 6.0 (pre oppvarmet til 80 ° C) og ruge ved 80 ° C i 20 min.</li>
			<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min og fjerne nedbryting.</li>
			<li>Legg til 1-10 mL av fersk 10 mM natriumsitrat pH 6.0 (pre oppvarmet til 80 ° C) og ruge på RT for 20 min.</li>
			<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering 1000 x g i 5 min og fjerne nedbryting.</li>
			<li>Gjenta en ytterligere 3 ganger pelleting Krypter, villi, organoids med sentrifugering (1000 x g i 5 min) før du legger til frisk vaskeløsning vask i 1-10 mL PBS med 1% serum.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. blokkerer trinn
<ol>
	<li>Gjøre blokkerer løsningen: legge til 10% sekundære antistoff arter serum i PBS (valgfritt: legge til 0,1% vaskemiddel).</li>
	<li>Pellets Krypter, villi, organoids med sentrifugering (1000 x g i 5 min) og fjerne nedbryting.</li>
	<li>Legge 5-10 mL av blokkering løsning avhengig av antallet eksempler som kreves (se merknaden nedenfor). På dette stadiet, kan du dele Krypter/villi/organoids løsningen i individuelle rør (1,5 mL lav bindende microcentrifuge rør med hver rør som inneholder 0.2 - 1 mL) til farging med forskjellige antistoffer. Merk: Hver isolert Krypter/villi fraksjon vil gi mellom 5-10 eksempler som kan brukes for ulike merking kombinasjoner avhengig av pellet. Ideelt sett kreves en pellet størrelse mellom 2-4 mm for hvert utvalg.</li></ol>Forskjellige fraksjoner kan kombineres på dette stadiet som Krypter og villi kan lett identifiseres (figur 2).
	<li>Inkuber i blokkering løsning på RT på et rør rotator 1t.</li>

5. primære antistoff inkubasjon
<ol>
	<li>Fortynne primære antistoffer (se Tabell for materiale) i PBS inneholder 10% serum og 0,1% vaskemiddel. Mellom 100 til 200 µL er primære antistoff løsning påkrevd per microcentrifuge tube prøve.</li>
	<li>Fjerne blokkering løsningen ved sentrifugering (1000 x g i 5 min).</li>
	<li>Resuspend Krypter/villi/organoid pellets i primære antistoff løsningen og ruge på 4 ° C over natten med et rør rotator (20 RPM) for å holde Krypter, villi, organoids i suspensjon.</li>
	<li>Neste dag: bringe prøvene tilbake til RT 1t på røret rotator (20 rpm).</li>
	<li>Pellets prøven med sentrifugering (1000 x g i 5 min) og fjerne den primære antistoff-løsningen.</li>
	<li>Legg 1 mL av vaske løsning og resuspend krypten/villus/organoid pellets.</li>
	<li>Umiddelbart fjerne løsningen med sentrifugering (1000 x g i 5 min).</li>
	<li>Legg 1 mL frisk vaskeløsning og spinne cellene i et rør rotator (20 rpm) i 2 timer. Endre vaskeløsningen ved sentrifugering enhver 30 min som i trinn 5.7.</li>
</ol>
6. sekundære antistoff inkubasjon
<ol>
	<li>Fortynne de sekundære Antistoffene (se Tabell for materiale) i PBS med 10% serum og 0,1% vaskemiddel. Det kreves ca 200 µL av sekundær antistoff løsning per microcentrifuge tube prøve. Merk: Svært tvers absorbert antistoffer skal brukes til å redusere reaktivitet av sekundær antistoffer i musen krypten/villus/organoid.</li>
	<li>Sentrifuge 1000 x g i 5 min pellets Krypter, villi, organoids og resuspend pellets i 200 µL av sekundær antistoff løsning.</li>
	<li>Spinne rør på et rør rotator (20 rpm) på RT 1t.</li>
	<li>Sentrifuge 1000 x g i 5 min pellets Krypter, villi, organoids og fjerne supernatants (ikke-bundet sekundære antistoffer).</li>
	<li>Resuspend pellet i vaskeløsning og umiddelbart sentrifuge 1000 x g for 5 min til pellets Krypter, villi, organoids.</li>
	<li>Fjern nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av fersk vaskeløsning.</li>
	<li>Spinn på et rør rotator (20 rpm) på RT 1,5-2 h, endre vaskeløsning hvert 20-30 min som beskrevet tidligere i trinn 6.3-6.6.</li>
</ol>
7. kjernefysiske flekken
<ol>
	<li>Fortynne kjernefysiske flekken i vaskeløsning (i henhold til produsentens protocol), for eksempel DAPI eller Hoechst. For eksempel: DAPI lagerløsning (20 mg/mL) er fortynnes 1:10, 000. Lager løsningen kan holdes i dele på 20 ° C.</li>
	<li>Sentrifuge 1000 x g i 5 min pellets Krypter, villi, organoids og fjerne vask løsning.</li>
	<li>Resuspend pellet i kjernefysiske counterstain løsning.</li>
	<li>Spinn på et rør rotator (20 rpm) på RT i 10 min.</li>
	<li>Sentrifuge 1000 x g i 5 min pellets Krypter, villi, organoids, fjerne den kjernefysiske flekk løsningen og resuspend pellet i vaskeløsning.</li>
	<li>Spinn på et rør rotator (20 rpm) på RT for 30-60 min., endre vaskeløsning hvert 10 min.</li>
</ol>
8. montering isolert Krypter Villi og Organoids
<ol>
	<li>Sentrifuge 1000 x g i 5 min pellets Krypter, villi, organoids og fjerne alle vaskeløsning. Merk: Hvis pellet fordeler, deretter sentrifuge igjen.</li>
	<li>Legge til 2 dråper for hard montering media med antifade agent i pellets.</li>
	<li>Kutt slutten av P200 brønnene og nøye resuspend pellet i montering media. Unngå å generere bobler. Merk: De isolerte organoid kulturene er veldig klissete; Pass på at resuspend fullt.</li>
	<li>Bruk av brønnene å overføre blanding av Krypter/villi/organoids i montering media løsningen og støte på linje langs midten av et mikroskop lysbilde. Merk: Linjen må ikke være lengre enn cover-glasset som skal brukes. Sjekk med en stereomicroscope om Krypter, villi, organoids er godt spredt på lysbildet og ikke klumpet seg.</li>
	<li>Forsiktig plassere en cover-glass over toppen; unngå å generere bobler.</li>
	<li>Sett av objektglass i en lysbilde bok og oppbevares i kjøleskap over natten for montering media sette før analysere på AC confocal mikroskop. Merk: For musen antistoff farging i musen vev, bruke de kommersielle immunofluorescence kit (se Tabell for materiale). Erstatte det blokkerer trinnet (del 4) med en 10 min blokk med protein blokkerer løsning etterfulgt av en 1t inkubasjon med blokkering reagensen som følger med settet. Deretter på trinn 5,8 (i midten vask) Legg en 1t inkubasjon med fluorescens signal enhancer reagens. Selvlysende dilutant (andre sekundære antistoffer kan også brukes i kombinasjon med denne reagensen) bruke utstyrets reagens. Inkuber som ovenfor og gå fra trinn 6 med resten av protokollen.</li>
</ol>
9. fiksering og immun-merking av Organoids i kjelleren matrise
Merk: Organoids bestemt for fiksering og immun-merking mens resterende innenfor kjelleren matrix ble generert i kjelleren matrix kupler på runde glass coverslips i en 24-vel plate (en kuppel per brønn). Organoid kjelleren matrix kupler ble behandlet innen 24-vel platen av tillegg og fjerning av de ulike løsningene.
<ol>
	<li>Fjerner mediet fra brønner og legger bindemiddel; La 1t.</li>
	<li>Fjerne bindemiddel og vask i PBS inneholder 1% serum og 0,1% vaskemiddel for 2t, endre enhver 30 min.</li>
	<li>Fjern vaskeløsningen og blokkere i PBS med 10% serum og 0,1% vaskemiddel 1t.</li>
	<li>Fortynne antistoffer i PBS med 1% serum eller PBS med 1% serum og 0,1% vaskemiddel.</li>
	<li>Fjerne blokkering løsningen og legge til 100-200 μL primære antistoff (se Tabell for materiale) løsning i hver brønn. Merk: det er viktig å fjerne alle blokkerende løsningen for ikke å fortynne antistoffer ytterligere.</li>
	<li>Plasser platen i kjøleskapet og ruge over natten på 4 ° C</li>
	<li>Deretter la på RT for 1-2 h.</li>
	<li>Fjern antistoff løsning og vask for 2-3 h endre vaskeløsning hvert 20 min.</li>
	<li>Fjerne alle vaskeløsning og legge til 100-200 μL sekundære antistoffer utvannet (se Tabell for materiale) i PBS med 1% serum; Inkuber 1t på RT.</li>
	<li>Fjern sekundær antistoff løsning og vask for 2t, endre hvert 20 min.</li>
	<li>Fjern vaskeløsningen og legge DAPI løsning; La for 10 min RT. Bruk DAPI lager løsning (20 mg/mL) utvannet på 1:10, 000.</li></ol>Lager løsningen kan holdes i dele på 20 ° C.
	<li>Fjern DAPI løsning og vask for 40 min, endre hvert 10 min.</li>
	<li>Ved hjelp av pinsett, fjerne glass dekkglassvæske med kjelleren matrix kuppelen og plasser på et lysbilde med kjelleren matrix kuppelen vendt oppover; Legg noen dråper montering media og deretter sette et glass dekkglassvæske på toppen.</li>
	<li>Plasserer glass-lysbildet i et lysbilde bok og la i kjøleskapet over natten for montering media sette.</li>

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Isolering av tarmen tissue Isolasjon av små intestinal Krypter og villi og colonic Krypter innebærer utsette slimhinnen, behandling med EDTA løsning å løsne celle kontakter, fraksjoneres (rister) og sentrifugering. Presentert intestinal villi/krypten isolasjon protokollen har blitt endret fra Belshaw et al. og Whitehead et al. 17 , 18
Utsette slimhinnen Vi har eksperimentert med en rekke tilnærminger til å eksponere slimhinnen av tarmkanalen i utviklingen av denne prosedyren. En klassisk tilnærming er å evert (slå genseren) røret, vanligvis i segmenter 100 mm lang, ved hjelp av et metall stang som er fanget i en fold av vev i ene enden og gjenværende røret gled over tube19. For musen vev er metall stang (2,4 mm diameter) med avrundede ender ideelt. Denne tilnærmingen har fordelen av å utvide slimhinnen bedre tilgang til PBS og EDTA. Vi først benyttet denne tilnærmingen, men flyttet til kutte røret i korte lengde (ca 5 cm) og åpne hver del med dissekere saks som dette bevist enklere. Denne tilnærmingen er riktig hvis bare noen tarmen er obligatoriske. men hvis flere dyr skulle bli brukt i et eksperiment deretter en spesialbygd enhet for skjæring åpne røret langs, som beskrevet av Yoneda et al. 14 ville være mer effektiv.
Avdeling av villi og Krypter fra muskel laget Først brukte vi 3 mM EDTA i PBS og relativt lange inkubasjonstiden ganger opptil 60 min for å løsne slimhinnen fra underliggende vev17,18. På denne konsentrasjonen av EDTA fant vi en inkubering periode av 30 min var tilstrekkelig til å løsne Krypter fra musen kolon. Men for tynntarmen krypten/villus isolasjonen prøvde vi å bruke mer konsentrert EDTA i kortere tid, som viste seg for å være en effektiv tilnærming. Alle påfølgende arbeid ble foretatt med vev utdraget benytter 30 mM EDTA teknikken generere relevante brøker for villi eller crypts. Krypter, vi samlet normalt fraksjoner 3-5 før Utbedring men det er viktig å sjekke om dette er riktig fraksjoner som tidsberegningene vil avhenge av en rekke faktorer som plasseringen langs tarmkanalen, alder av musen, betennelse, tidligere diet , etc. , hvor lenge vevet må ristes etter EDTA behandling å være effektive variere under ulike forhold. Resultatet er isolert vev brøker som inneholder en blanding av villi og Krypter eller hovedsakelig villi eller crypts (figur 2). Som det er ingen villi i tykktarmen, krypten utvinning kan være oppnåelig i ett trinn ved å riste vevet i røret for 30 s. Disse fraksjoner kan deretter fast og behandles for immuno-merking.
Isolering av intestinal organoids fra kjelleren matrisen Isolasjonen av organoids fra kjelleren matrix kupler kan oppnås ved hjelp av cellen gjenopprettingsløsning. Løsningen fungerer ved depolymerizing gelled kjelleren matrisen men temperaturen må være 2-8 ° C. Advarsel er at dynamisk piskehale som henger ikke beholdes. Derfor, for immuno-merking av dynamisk piskehale som henger og + TIPs som EBs cellen, utvinning fra kjelleren matrisen før fiksering er ikke anbefalt. Men de fleste av de piskehale som henger i unike organoid cellene er relativt stabil, og dette ble bevart (figur 6). Det fungerte også bra for immuno-merking av centrosomal og junctional proteiner som cellen markører.
Fiksering protokoller Formaldehyd (ferske fra PFA) er et relativt rapid-fungerende bindemiddel som danner reversibel cross-links 4% PFA fungerer godt for eksempel i immuno-merking piskehale som henger og gamma-tubulin og flekker begrepsordbok filamenter med Phalloidin. Mer fortynne PFA løsninger som 1% fungerte bra for immuno-merking for eksempel med stilk cellen markørene Lgr5 og Paneth cellen merket CD24 innen krypten stamcelleforskningen nisje, mens høyere konsentrasjoner av PFA ikke fungerte.
Tillegg av glutaraldehyde gir bedre bevaring av piskehale som henger og såkalte PHEMO fiksering som består av en blanding av 3,7% PFA, 0,05% glutaraldehyde og 0,5% vaskemiddel i PHEMO buffer (68 mM rør, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA og 3 mM MgCl2)2 gir utmerket bevaring av piskehale som henger uten å svekke antigenicity. Det fungerer også godt for immuno-merking gamma-tubulin, β-catenin, og E-cadherin og flekker begrepsordbok filamenter med phalloidin. Men i 3D vev og organoid kulturer, PHEMO fiksering produsert inkonsekvente resultater og var derfor ikke brukes.
Metanol er et coagulant bindemiddel som gir relativt god penetrasjon og tendens til å beholde antigenicity. Fiksering med 100% metanol (20 ° C) introduserer noen krymping, gir moderat morfologi bevaring og arbeider for piskehale som henger, + TIPs og mange centrosomal antistoffer inkludert ninein i 2D cellekulturer. Noen organoids kollapset imidlertid når du bruker denne fiksering metoden. I tillegg penetrasjon av antistoffer gjennom hele Krypter, villi eller organoids var opprinnelig et problem men tillegg av 0,1% vaskemiddel vaskeløsning og langvarig vask oppnådd bedre resultater.
En kombinasjon av formaldehyd og metanol hadde tidligere blitt brukt av Rogers et al. 20 til immuno-label EB1 i Drosophila. En fiksering protokoll basert på en blanding av formaldehyd og metanol ble derfor utviklet for tarmen tissue og organoids basert på 3% formaldehyd og 97% metanol nedkjølt til 20 ° C, men utelater 5 mM natriumkarbonat fra blandingen som ble brukt av Rogers et al. 20 i tillegg prøver ble løst i fryseren på 20 ° C. Dette fungerte spesielt godt for immuno-merking + TIPs, som CLIP-170 og EBs, men også viste seg utmerket for feste og immun-merking piskehale som henger og utgangen innen vev og 3D organoids. Veldig god strukturell bevaring var tydelig og antigenicity ble bevart for flere cellen cytoskjelett og tilhørende proteiner, samt centrosomal proteiner som gamma-tubulin og ninein, selv om merkingsteknikker for ninein arbeidet mer konsekvent med metanol fiksering.

Dannelse av epithelia med apico-basale polariteten er en grunnleggende prosess i utviklingen og innebærer en dramatisk omorganisering av piskehale som henger og centrosomal proteiner. En sirkulær microtubule matrise fra et sentralt centrosomal microtubule organisere center (MTOC) er fremtredende i mange dyreceller og dette er godt egnet for relativt flat celler. Derimot samle kolonne epitelceller, som de av tarmen, ikke-radielt transcellular microtubule matriser som bedre støtte form og spesialiserte funksjoner til disse cellene. Denne dramatiske omorganisering av piskehale som henger oppnås ved centrosome flytte til toppen og apikale ikke-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) utgjør, som blir ansvarlig for anchorage til transcellular piskehale som henger1,2 , 3 , 4 , 5.
Mye av vår kunnskap om epithelial differensiering og tilknyttede microtubule omorganiseringen har kommet fra undersøkelser av 2D i vitro celle lag som ikke vises i vivo vev arkitektur. Utviklingen av 3D i vitro organoid kulturer, utviklet av Clevers og kolleger6, representerer en stor teknologisk fremgang som de etterligner i vivo arkitektur og utvikling. Et hierarki av epitelial differensiering er tydelig i tarmen; stamceller nederst Krypter gi opphav til umodne transitt forsterke celler som sprer og gradvis skille som de migrere opp krypten på små intestinal villus eller colonic overflaten, hvor de blir fullt differensiert før de blir kaste inn lumen7. Viktigere, replikeres dette i intestinal organoids der sprer celler fra stamcelleforskningen nisje danner cysts det deretter genererer krypt-lignende knopper med stamceller nederst og differensiering gradvis framover mot regionen cyste som blir villus-lignende8. Den intestinal organoid representerer derfor en kraftig modell å studere ikke bare microtubule og centrosomal omorganisering epithelial differensiering, men mange andre proteiner, samt gir en ideell plattform for screening av narkotika og mat forbindelser av potensielle terapeutiske fordeler9,10.
Organoids er godt egnet for live-imaging fluorescerende-merket proteiner og begge knock-i og Bank-out organoids kan genereres ved hjelp av CRISPR/Cas9 gene redigering11,12. Men er etablering uttrykk og lokalisering av endogene proteiner studier viktig, spesielt for å kontrollere virkemåten til merket proteiner. Immuno-merking 3D organoids vokst i kjelleren matrise eller ex vivo isolert vev er mer kompleks enn celler dyrket i kultur retter i 2D. Fiksering protokollen må bevare delikat 3D arkitektur organoids samtidig bevare antistoff antigenicity (dvs., epitopes for innbinding antistoffer). For eksempel 4% paraformaldehyde (PFA) brukes ofte som men mens det er et relativt raske fungerende bindemiddel og gir god morfologiske bevaring, i vår erfaring det ofte resulterer i tap av antigenicity og er ikke egnet for mange centrosomal antistoffer. Muligheten for bindemiddel og antistoffer å trenge 3D strukturer og vev bør også vurderes. Dette har vi endret og utviklet protokoller for vev isolasjon og indirekte immuno-merking av 3D i vitro organoids og ex vivo isolert tarmen tissue. Vi beskriver hvordan å isolere liten intestinal Krypter og villi og colonic vev, og inkluderer en protokoll for isolering av 3D organoids idet en alternativ å fikse og immun-merking i kjelleren matrix. Vi presenterer tre alternative fiksering protokoller for immuno-merking av piskehale som henger og centrosomal proteiner, slik som ninein, og microtubule plus-ende-sporing proteiner (+ TIPs), for eksempel EB proteiner og klipp-170 (se også referanser8, 13). Vi også diskutere fordeler og ulemper knyttet til hver protokoll.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Ankomsten av 3D i vitro organoids som etterligner i vivo vev arkitekturen og morphogenesis har sterkt avansert mulighet til å studere viktige biologiske spørsmål i cellen og utviklingsbiologi. I tillegg lover organoids sammen med de siste tekniske utviklingen innen genet og viral gen levering å fremme medisinsk forskning og utvikling av nye legemidler for behandling av sykdommer. Organoids dyrket i vitro i kjelleren matrise gir kraftig modellsystemer for å studere atferd og funksjon av og er godt egnet for live-imaging fluorescerende-merket proteiner. Men er etablering uttrykk og lokalisering av endogene proteiner i ex vivo vev og i vitro organoids viktig å kontrollere atferden til merket proteiner. Dette har vi utviklet og endret vev isolasjon, fiksering og immun-merking protokoller for lokalisering av piskehale som henger, centrosomal og tilhørende proteiner i ex vivo tarmen tissue og i vitro intestinal organoids. Målet var bindemiddel å bevare 3D arkitektur organoids/vevet samtidig bevare antistoff antigenicity og aktivere god penetrasjon og rydding av bindemiddel og antistoffer. Eksponering for kulde depolymerizes alle, men stabil piskehale som henger, og dette var en viktig faktor når du endrer ulike protokollene. Vi fant at øker ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) konsentrasjonen fra 3 mM til 30 mM ga effektiv avdeling av villi og Krypter i tynntarmen mens 3 mM EDTA var tilstrekkelig for colonic Krypter. Utviklet formaldehyd/metanol fiksering protokollen ga veldig god strukturell bevaring samtidig bevare antigenicity for effektiv merking av piskehale som henger, utgangen og slutten-binding (EB) proteiner. Det har også jobbet for centrosomal protein ninein selv om metanol protokollen arbeidet mer konsekvent. Videre etablerte vi at fiksering og immun-merking av piskehale som henger og tilhørende proteiner kan oppnås med organoids isolert fra eller resterende innen kjelleren matrix.

Isolering av tarmen tissue for immuno-merking Beskrevet vev isolasjon protokollene for kolon og tynntarmen var optimalisert for bevaring og immun-merking av piskehale som henger og tilhørende proteiner, men ikke for stamcelleforskningen levedyktighet og organoid generasjon (figur 1 og tabell 1 ). Målet var å generere krypten og villus fraksjoner som var ren (fri for Slim og andre vev) som mulig, samtidig minimere eksponering mot EDTA og kaldt å bevare strukturen og forhindre depolymerization piskehale som henger med isen kalde løsninger som induserer depolymerization alle, men stabil piskehale som henger. Figur 2 viser eksempler på bilder av brøker 2 og 3 fra isolert liten tarmen tissue, med del 2 som inneholder en blanding av både villi og Krypter (figur 2A, B), mens brøkdel 3 inneholder hovedsakelig crypts (figur 2C D).
Fiksering og immun-merking av isolerte tarmen tissue Personlige eller kombinert fraksjoner ble deretter behandlet for fiksering og immun-merket gjennom en rekke trinn inkludert fiksering, vaskemiddel, blokkering, antistoffer og vaske løsninger, før re frakobles siste villi/crypts pellets montering medier, overføre til lysbilder og dekket med glass coverslips. Krypter og villi ble deretter fotografert på AC confocal mikroskop.
God bevaring og merking av piskehale som henger og utgangen både villi og Krypter ble oppnådd ved følgende: en kombinasjon av formaldehyd/metanol fiksering på 20 ° C, gjentatt vasker i PBS inneholder 0,1% vaskemiddel og 1% serum og blokkering i PBS med 0,1% vaskemiddel og 10% serum, etterfulgt av natten inkubasjon 4 ° C i primære antistoffer og deretter 2 h i sekundære antistoffer ved romtemperatur (Figur 3). Formaldehyd/metanol fiksering også fungerte bra for merking + TIPs som EBs og klipp-170 i isolerte Krypter og villi (Figur 4). EB3 ansamlinger på pluss-slutten piskehale som henger (kjent som kometer) var tydelig i crypts (figur 4A), mens association langs gitteret stabil piskehale som henger kunne sees i villi prøver (figur 4C). Forskjellige lokalisering av klipp-170 og p150Glued (delenhet i dynactin) var tydelig på de apikale n-MTOCs i isolerte villi (figur 4B). Fiksering med formaldehyd/metanol protokollen fungerte ikke konsekvent for ninein lokalisering i isolerte tarmen tissue benytter våre Pep3 antistoff mot musen ninein. Men metanol fiksering på 20 ° C etterfulgt av samme vask og blokkerer løsninger som formaldehyd/metanol ga veldig god lokalisering av ninein isolert Krypter og villi (figur 5, referanse8). Interessant, mens ninein er konsentrert på apikale centrosomes var noen akkumulering ved celle tydelig i noen celler i isolerte crypts (figur 5). Enten dette skyldes uspesifisert merking eller en konsekvens av isolasjon prosedyre å forsinke trenger fiksering (og dermed påvirker bevaring) videre etterforskning. Imidlertid avslørte metanol-fast (20 ° C) kryostaten deler av villi (se figur 3bi i8) også ninein på cellen base i noen celler antyder at ninein kan også knytte en basal befolkning piskehale som henger.
Fiksering og immun-merking av organoids isolert fra kjelleren matrise Liten intestinal organoids ble generert og vokst i kjelleren matrise i tre uker eller lenger (figur 6A, referanse6,15). En kald (4 ° C) cellen gjenopprettingsløsning ble brukt til å isolere organoids fra kjelleren matrisen. Den depolymerized kjeller matrix løsningen med organoids ble overført til rør og sentrifugeres før fiksering og immun-merking. Dette produsert veldig rent forberedelser og god tilgang til organoids for ulike løsninger. Differensiert cellene i organoid villus domener inneholder stabil apico-basale skal bli så piskehale som henger; Dette merket godt i de fleste tilfeller (figur 6B, C) og EB1 kan også sees langs microtubule gitteret (figur 6E, referanse13). Men kan kaldt celle gjenopprettingsløsning resultere i depolymerization de dynamiske piskehale som henger, som var tydelig i noen prøver av mangel på EB1 kometer (som binder til pluss-end voksende piskehale som henger) i de basale krypten domenene (figur 6F ). I andre prøver internhukommelsen astral (dynamisk) piskehale som henger (figur 6D). Organoid isolasjon før fiksering og immun-merking også jobbet for junctional proteiner, ninein, klipp-170 og celle markører, som mucin for beger celler og chromogranin A for enteroendocrine celler.
Fiksering og immun-merking av organoids i kjelleren matrise Figur 7 viser en organoid cyste scenen (A-C) og en tidlig utviklingsfase krypten (D), både fast formaldehyd/metanol og immun-merket for piskehale som henger og ninein. God microtubule bevaring og merking samt merkingsteknikker for ninein på apikale n-MTOCs var tydelig. Figur 8A, B viser et krypten domene i en dag 6 organoid fast med metanol protokollen og merket for piskehale som henger og EB1. God bevaring av piskehale som henger og EB1 kometer var tydelig foreslå bevaring av dynamisk piskehale som henger.
Organoids var også faste og immun-merket mens resterende innenfor kjelleren matrise. Ulempene med denne fremgangsmåten kan være dårlig gjennomtrengning av bindemiddel og overlapping av antistoffer i kjelleren matrix (figur 8B), men i begge tilfeller mindre ofte når 0,1% vaskemiddel var inkludert i bindemiddel og/eller vaske løsninger. I tillegg 4% PFA ikke bevare kjelleren matrix godt men forårsaket det å oppløse, var så med 1% PFA.Metanol fiksering, derimot, indusert noen ganger organoid kollaps.
Merking med noen antistoffer som mot stamcelleforskningen markør Lgr5 og Paneth celle markøren virket CD24 med 4% PFA, metanol eller formaldehyd/metanol protokoller. Imidlertid bestemmer organoids innenfor kjelleren matrise med 1% PFA i PBS med 0,1% vaskemiddel ved romtemperatur resultere i merking for både Lgr5 og CD24 (figur 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig1.jpg"> 
Figur 1: isolering av små intestinal villi og Krypter. Sekvensdiagram for de viktigste trinnene i små intestinal villus og krypten isolasjon før fiksering og immun-merking. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig2.jpg"> 
Figur 2: isolert villi og Krypter fra musen tynntarmen. Brightfield mikroskop bilder av intestinal fraksjoner viser villi (store piler) og crypts (liten piler). (A, B) Brøkdel 2 inneholder en blanding av villi og Krypter, og bevaring av morfologi på villus og krypten er tydelig i B. (C, D) Brøkdel 3 viser isolering av Krypter og fravær av villi og intakt Krypter inkludert en bifurcated krypt i C. Skalere barer = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig3.jpg"> 
Figur 3: isolerte liten intestinal villus og krypten fast formaldehyd/metanol og immun-merket for piskehale som henger og begrepsordbok. (A) skjematisk av villus og krypten epitel med forskjellige celletyper angitt. De merkede boksene angir representant regionene avbildet i B og C. (B, C) AC confocal optisk deler gjennom en del av en villus (B) og basale krypten (C) isolert fra tynntarm bruker 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/metanol, vasket i PBS med 1% geit serum og 0,1% vaskemiddel, blokkert i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og merket for piskehale som henger med rotte monoklonale anti-tubulin antistoff (grønn) og utgangen med kanin polyklonale anti-β-utgangen antistoff (rød). Godt bevart apico-basale microtubule pakker er tydelig i både villus og krypten celler og utgangen kan sees konsentrert i regionen apikale overfor lumen (pil). Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig4.jpg"> 
Figur 4: Isolerte liten intestinal krypten og villi fast formaldehyd/metanol og immun-merket for piskehale som henger, EB3, p150Gluedog KLIPPET-170. AC confocal optisk deler av crypt og villi isolert fra tynntarm bruker 30 mM EDTA og fast i formaldehyd/metanol, vasket i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, blokkert i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og Immuno-merket. (A) hemmelig merket med kanin polyklonale α-tubulin antistoff (rød) og rotten monoklonalt EB3KT36 antistoff (grønn) og farget for DNA med DAPI (blå) viser apico-basale piskehale som henger og EB3 kometer. Invertert enkeltkanals bildet viser tydelig EB3 kometer hele basale krypten celler foreslå gode bevaring av dynamisk og stabile piskehale som henger. (B) Villus epitelceller merket med kanin polyklonale klipp-170 antistoff (rød, se også referere til16) og monoklonale p150Glued antistoff (grønn) viser apikale co lokalisering. Invertert enkeltkanals bilder er vist nedenfor. (C) Villus celler merket med kanin polyklonale α-tubulin antistoff (rød) og rotten monoklonalt antistoff EB3-KT36 (grønn) og farget for DNA med DAPI (blå) viser apico-basale piskehale som henger med EB3 langs gitteret. EB3 gitter foreningen er markert med det forstørrede image mens invertert enkeltkanals bildet antyder både EB3 kometer og gitter association. Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig5.jpg"> 
Figur 5: isolert kolon krypten løst i metanol, immuno-merket ninein og E-cadherin, og farget med DAPI. AC confocal optisk delen av de basale og transitt-forsterke regionen i en krypt isolert fra kolon med 3 mM EDTA og løst i metanol, vasket i PBS med 1% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og blokkert i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel. Krypten var merket med kanin polyklonale ninein antistoffer (Pep3, se også referanse8, rød) og mus monoklonalt antistoff for E-cadherin (grønn) og farget med DAPI (blå). Invertert enkeltkanals bildet viser ninein bare. Bildet viser en godt bevart crypt med E-cadherin avsløre omrisset av individuelle celler og ninein konsentrert på apikale centrosomes. Det foreslår god gjennomtrenging av bindemiddel og antistoffer og bevaring av antigenicity. Skala bar = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig6.jpg"> 
Figur 6: Organoid utvikling, fiksering og immun-merking av isolerte organoids. (A) fase kontrast bilder viser ulike stadier av organoid utvikling fra cellen aggregater til cyste bud initiering og fullt dannet organoids med hemmelig og villus domener.(B-F) AC confocal optisk deler gjennom organoids isolert fra kjelleren matrise med cellen gjenopprettingsløsning ved 4 ° C (10 min) etterfulgt av formaldehyd/metanol fiksering, vaske i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, blokkering i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og immun-merking for piskehale som henger, β-catenin og EB1. (B) Organoid cyste merket for piskehale som henger (blå) og β-catenin (rød) avsløre god microtubule bevaring og merking i de fleste celler. (C) distinkte apico-basale piskehale som henger er tydelig i disse forstørret epitelceller fra en organoid cyste. (D) dele celler merket for piskehale som henger viser spindler inkludert astral (dynamisk) piskehale som henger (pil). (E, F) Villus domene (E) og krypten domene (F) organoid regioner viser noen EB1 merking langs gitteret stabil piskehale som henger, spesielt i villus, mens svært få EB1 kometer er sett selv innenfor basale krypten tyder det dynamiske piskehale som henger har ikke blitt bevart. Skalere barer = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig7.jpg"> 
Figur 7: Organoids fast i kjelleren matrix i formaldehyd/metanol og immun-merket for piskehale som henger og ninein. AC confocal optisk deler av organoids fast i formaldehyd/metanol, vasket og blokkert i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og merket mens resterende i kjelleren matrisen. (En-C) Organoid cyste merket for microtubule (grønn) og ninein (Pep3, referanse8, rød) og farget med DAPI (blå) viser det sammenslåtte bildet i invertert enkeltkanals bilder for piskehale som henger (B) og ninein (C). Bildene viser apico-basale piskehale som henger og apikale ninein lokalisering, foreslår veldig god strukturell bevaring av organoid og gjennomtrenging av antistoffer, samt clearing av ubundet antistoffer. (D, E) Organoid utvikle krypten fast og merket som ovenfor, og igjen viser utmerket strukturelle bevaring, merking og clearing av antistoffer. Forskjellige apico-basale piskehale som henger og apikale n-MTOC ninein lokalisering er tydelig og utheves med det forstørrede image (E) av regionen eske i D. Skalere barer = 10 μm (A-D); 5 μm (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig8.jpg"> 
Figur 8: Organoids fast i kjelleren matrix i metanol og immun-merket for piskehale som henger og EB1. AC confocal optisk deler av organoids fast i metanol, vasket og blokkert i PBS inneholder 10% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og merket, mens resterende i kjelleren matrisen. (A) cyste domene fra en fullt utviklet organoid merket med kanin polyklonale α-tubulin (rød) og mus monoklonalt EB1 (grønn) antistoffer viser apico-basale piskehale som henger, spindler (pil) i to dele celler og tydelig EB1 kometer. Noen fangst av ubundet EB1 antistoffer er tydelig. Men er god strukturell bevaring og merking av piskehale som henger og EB1 observert. Tilstedeværelsen av EB1 kometer antyder at dynamisk piskehale som henger har blitt bevart (A, inverter). (B) Inverted bildet av organoid cyste region viser α-tubulin antistoff merking med betydelig antistoffer fanget i omkringliggende kjelleren matrix (pil). Skalere barer = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig9.jpg"> 
Figur 9: Organoids fast i kjelleren matrisen i 1% PFA og immun-merket for Lgr5 og CD24. AC confocal optisk deler av organoids fast i kjelleren matrisen i 1% PFA i PBS med 0,1% vaskemiddel, vasket i PBS med 1% geit serum og 0,1% vaskemiddel, og merket med antistoffer mot Lgr5 og CD24. (A, B) Stamcelle nisje i en krypt domene viser Paneth celler positiv for CD24 (rød). AC confocal og fase kontrast bildene er slått sammen i. B viser én kanal av CD24 merkingen. (C) stilk cellen regionen i en krypt domenet viser en Lrg5 positiv stilk cellen. Skalere barer = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56662/56662table1.jpg"> 
Tabell 1: tidslinjen for små intestinal krypten og villi isolasjon og fiksering. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56662/56662table1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Vi presenterer protokoller for isolering av intestinal 3D strukturer fra i vivo vev og i vitro kjelleren matrix innebygd organoids, og detaljer forskjellige fiksering og Fargeprotokoller optimalisert for immuno-merking av microtubule, centrosomal og junctional proteiner også som celle indikatorer inkludert stamcelleforskningen protein Lgr5.

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Viral-mediert Merking og transplantasjon av Medial ganglieblokkere Eminence (MGE) Cells for<em&gt; I Vivo</em&gt; Studier

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em&gt; I Vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo-modeller for å studere hornhinne endotel-mesenchymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Behandling av menneskelig hjerte vev mot ekstracellulær Matrix selv montering Hydrogel for In Vitro og i Vivo programmer

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo av den gnager placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating patte-til-avvenning overgang in vitro bruker fosterets intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...