Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Os autores graças a Paul Thomas para assistência e conselhos de microscópio. Este trabalho envolvido aqui foi apoiado pelo BBSRC (conceder n. BB/J009040/1 M.M.M. e TW).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Isolamento do tecido intestinal Isolamento de pequenas criptas intestinais e vilosidades e criptas do cólon envolve expor a superfície da mucosa, o tratamento com solução de EDTA para afrouxar a centrifugação, fracionamento (agitação) e contatos do celular. O protocolo de isolamento apresentado vilosidades intestinais/cripta foi modificado de Belshaw et al e Whitehead et al. 17 , 18
Expondo a superfície da mucosa Nós já experimentou uma série de abordagens para expor a superfície da mucosa do tracto intestinal no desenvolvimento deste procedimento. É uma abordagem clássica para evert (volta de dentro para fora) o tubo, geralmente em segmentos de cerca de 100 mm de comprimento, usar uma haste de metal que é pego em uma dobra do tecido em uma extremidade e, em seguida, o tubo restante deslizou sobre o tubo19. Para o tecido do mouse, uma haste de metal (2,4 mm de diâmetro) com extremidades arredondadas é ideal. Esta abordagem tem a vantagem de expandir a superfície da mucosa, permitindo melhor acesso a PBS e EDTA. Nós inicialmente usado esta abordagem, mas mudou-se para cortar o tubo em comprimentos curtos (cerca de 5 cm) e abertura de cada seção com tesoura de dissecação, como isto revelou-se mais fácil. Esta abordagem é apropriada, se apenas alguns intestinos são necessários; Mas se fossem mais animais para ser usado em um experimento então um dispositivo desenvolvido especificamente para cortar o tubo no sentido longitudinal, como descrito por Yoneda et al 14 seria mais eficiente.
Destacamento de vilosidades e criptas da camada muscular Inicialmente usamos 3 mM EDTA em PBS e tempos de incubação relativamente longo de até 60 min. para soltar a superfície da mucosa do tecido subjacente17,18. Nessa concentração de EDTA, encontramos que um tempo de incubação de 30 minutos foi suficiente para soltar as criptas do cólon de rato. No entanto, para o isolamento de cripta/das vilosidades do intestino delgado, tentámos usando EDTA mais concentrado para um tempo mais curto, o que provou para ser uma abordagem eficiente. Todo o trabalho posterior foi realizado com tecido extraído usando a técnica de 30 mM EDTA gerando fracções relevantes para vilosidades ou criptas. Para criptas, normalmente juntássemos frações 3-5 antes da fixação, mas é importante verificar se estas são as frações apropriadas como os timings vão depender de uma série de fatores tais como a posição ao longo do trato intestinal, idade do rato, a inflamação, a dieta anterior , etc. da mesma forma, o comprimento de tempo que o tecido precisa ser abalada após o tratamento de EDTA para ser eficaz pode variar em diferentes condições. O resultado é frações isoladas de tecido contendo uma mistura de vilosidades e criptas ou principalmente vilosidades ou criptas (Figura 2). Como não há nenhum vilosidades no cólon, a extração de cripta pode ser realizável em uma única etapa agitando o tecido no tubo por 30 s. Estas frações podem ser fixadas e processadas para imuno-rotulagem.
Isolamento de organoids intestinal de matriz de porão Isolamento de organoids de porão cúpulas de matriz pode ser conseguido usando solução de recuperação celular. A solução funciona por depolymerizing a matriz de porão gelificada, mas a temperatura deve ser de 2-8 ° C. Uma nota de cautela é que microtúbulos dinâmicos não podem ser preservados. Assim, por imuno-rotulagem dos microtubules dinâmicos e + dicas de como a célula de EBs, recuperação de matrix porão antes da fixação não é recomendada. No entanto, a maioria dos microtúbulos nas células de diferenciação organoides é relativamente estável e estes foram preservados (Figura 6). Também funcionou bem para imuno-rotulagem de proteínas centrosomal e juncionais, bem como marcadores de célula.
Protocolos de fixação Formaldeído (acabado de PFA) é um fixador de ação relativamente rápida que forma reversível ligações cruzadas e 4% PFA funciona bem, por exemplo, em microtúbulos imuno-rotulagem e gama-tubulina e coloração filamentos de actina com faloidina. Mais diluir soluções PFA como 1% trabalhado bem para imuno-rotulagem, por exemplo, com o marcador de célula de marcadores Lgr5 e Paneth células estaminais CD24 dentro do nicho de células-tronco da cripta, enquanto altas concentrações de PFA não funcionou.
A adição de glutaraldeído dá melhor preservação de microtúbulos e a fixação de PHEMO chamada, que consiste de uma mistura de 3,7% PFA, glutaraldeído 0,05% e 0,5% de detergente na PHEMO buffer (tubos de 68 mM, 25mm HEPES, 15mm EGTA e 3 milímetros de MgCl2)2 Dá excelente preservação dos microtúbulos sem comprometer a antigenicidade. Também funciona bem para imuno-rotulagem gama-tubulina, β-catenina e E-caderina e coloração filamentos de actina com faloidina. No entanto, em tecido 3D e organoides culturas, a fixação de PHEMO produzido resultados inconsistentes e, portanto, não foi usada.
O metanol é um coagulante fixador que dá relativamente boa penetração e tende a preservar a antigenicidade. Fixação com metanol 100% (-20 ° C) introduz um encolhimento, dá a preservação da morfologia moderada e trabalha para os microtúbulos, + dicas e muitos anticorpos centrosomal incluindo 8h30 em culturas de células 2D. No entanto, alguns organoids entrou em colapso quando usando este método de fixação. Além disso, penetração de anticorpos através de toda criptas, vilosidades ou organoids inicialmente era um problema, mas a adição de 0,1% de detergente para a solução de lavagem e lavagem prolongada alcançado resultados melhores.
Uma combinação de formol e metanol anteriormente tinha sido usada por Rogers et al . 20 a EB1 imuno-rótulo em drosófila. Um protocolo de fixação com base em uma mistura de formol e metanol, portanto, foi desenvolvida para tecido intestinal e organoids com base em 3% formol e 97% de metanol refrigerados a-20 ° C, mas omitindo o carbonato de sódio 5 mM da mistura que foi usado por Rogers et al. 20 além disso, as amostras foram fixadas em freezer a-20 ° C. Isto trabalhou particularmente bem para imuno-etiquetar + dicas, como CLIP-170 e o EBs, mas também se mostrou excelente para fixação e imuno-rotulagem microtúbulos e actina no tecido e 3D organoids. Muito boa preservação estrutural era evidente e antigenicidade foi preservada para várias proteínas do citoesqueleto e associadas, bem como centrosomal proteínas tais como a gama-tubulina e 8h30, apesar de rotulagem para 8h30 trabalhou mais consistentemente com metanol fixação.

Formação de epitélios com polaridade ápico-basal é um processo fundamental no desenvolvimento e envolve uma reorganização dramática dos microtúbulos e proteínas centrosomal. Uma matriz radial do microtubule emanando de um localização central microtubule centrosomal organizando o centro (MTOC) é proeminente em muitas células animais e isso é bem adequado para células relativamente planas. Em contraste, as células epiteliais colunares, como as do intestino, montam matrizes de microtubule transcellular não-radial que suportam melhor a forma e funções especializadas dessas células. Esta reorganização dramática dos microtúbulos é conseguida a centrossoma movendo-se para o ápice e apicais MTOCs não-centrosomal (n-MTOCs), formando-se, que se torna responsável pela fixação dos microtúbulos transcellular1,2 , 3 , 4 , 5.
Muito do nosso conhecimento de diferenciação epitelial e a reorganização do microtubule associado vem de investigações de 2D em vitro camadas celulares que não exibem a arquitetura do tecido na vivo . Desenvolvimento de culturas em 3D em vitro organoides, precurssores Clevers e colegas de trabalho6, representa um grande avanço tecnológico, como eles imitam na vivo arquitetura e desenvolvimento. Uma hierarquia de diferenciação epitelial é evidente no intestino; células-tronco na parte inferior da criptas originar trânsito imaturo, amplificando as células que se proliferam e se diferenciam gradualmente como eles migram até a cripta para o pequena vilosidades intestinais ou a superfície do cólon, onde eles se tornam totalmente diferenciados antes de ser galpão para o lúmen,7. Importante, isto é replicado no organoids intestinal, onde as células desde o nicho de células-tronco se proliferam formando cistos que posteriormente geram cripta, como botões com células-tronco na parte inferior e a diferenciação que gradualmente progredindo em relação à região de cisto, que se torna, como vilosidades8. Os organoides intestinal, portanto, representa um poderoso modelo para estudar não só microtubule e reorganização centrosomal durante a diferenciação epitelial, mas inúmeras outras proteínas, bem como fornecendo uma plataforma ideal para a seleção de medicamentos e alimentos compostos de potencial terapêutico beneficia9,10.
Organoids são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas ambos TOC- e em organoids de mata-mata pode ser gerado usando CRISPR/Cas9 gene edição11,12. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas a ser estudado é importante, especialmente para verificar o comportamento das proteínas marcados. Organoids 3D imuno-rotulagem cultivados em matriz de porão ou ex vivo isolado tecido é mais complexo do que as células cultivadas em pratos de cultura em 2D. O protocolo de fixação precisa preservar a arquitetura 3D delicada de organoids, ainda preservando a antigenicidade de anticorpo (ou seja, os epítopos para anticorpos de ligação). Por exemplo, paraformaldeído 4% (PFA) é comumente usado como um fixador mas enquanto é um fixador agindo de forma relativamente rápida e dá boa preservação morfológica, em nossa experiência frequentemente resulta em perda de antigenicidade e não é adequado para muitos anticorpos centrosomal. A capacidade do fixador e anticorpos de penetrar tecidos e estruturas 3D também deve ser considerada. Para este fim, modificamos e protocolos desenvolvidos para isolamento de tecido e indireta imuno-rotulagem de organoids 3D em vitro e ex vivo isolaram tecido intestinal. Descrevemos como isolar pequenas criptas intestinais e villi e tecido do cólon e incluem um protocolo para a isolação de organoids 3D como uma alternativa para fixação e imuno-rotulagem dentro da matriz do porão. Apresentamos três protocolos alternativos de fixação para imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas centrosomal, tais como 8h30 e microtubule proteínas de rastreamento plus-final (+ dicas), como as proteínas do EB e CLIP-170 (Veja também referências8, 13). Também discutimos os prós e contras associados com cada protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

O advento do 3D em vitro organoids que imitam a arquitetura de tecido na vivo e morfogênese avançou grandemente a capacidade de estudar questões biológicas centrais da biologia celular e do desenvolvimento. Além disso, organoids juntamente com os recentes avanços técnicos no gene edição e entrega do gene viral promete avançar a pesquisa médica e desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento de doenças. Organoids crescida em vitro na matriz de porão fornecer sistemas poderoso modelo para estudar o comportamento e a função de várias proteínas e são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas no tecido ex vivo e in vitro organoids é importante para verificar o comportamento das proteínas marcados. Para este fim temos desenvolvido e modificado o isolamento do tecido, fixação e imuno-rotulagem protocolos para localização de microtúbulos, centrosomal e associado as proteínas no tecido intestinal ex vivo e em vitro organoids intestinal. O objetivo foi para o fixador preservar a arquitetura 3D do organoids/tecido ao mesmo tempo preservar a antigenicidade do anticorpo e permitindo boa penetração e apuramento de fixador e anticorpos. Exposição ao frio depolymerizes todos, mas os microtúbulos estáveis e isto foi um fator chave ao modificar os diversos protocolos. Nós achamos que aumentar a ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) concentração do ácido de 3 mM a 30 mM deu descolamento eficiente das vilosidades e criptas no intestino delgado, enquanto 3 mM EDTA foi suficiente para criptas do cólon. O protocolo de fixação de formaldeído/metanol desenvolvidos deu muito boa preservação estrutural, preservando também a antigenicidade para rotulagem eficaz de actina, microtúbulos e proteínas (EB) a fim. Também trabalhou para a proteína centrosomal 8h30 embora o protocolo de metanol mais consistentemente trabalhado. Estabelecemos ainda mais que a fixação e imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas associadas poderiam ser alcançadas com organoids isolado do ou permanecendo dentro da matriz do porão.

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Apresentamos os protocolos para isolamento de estruturas 3D intestinais do tecido em vivo e em vitro matriz de porão embutido organoids e fixação de diferentes detalhes e protocolos otimizados para imuno-rotulagem dos microtúbulos, de coloração proteínas centrosomal e juncionais, bem como célula marcadores incluindo a proteína de células-tronco Lgr5.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Rotulagem mediada por vírus e transplante de Medial ganglionar Eminence (MGE) Células para<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudos

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Biologia do Desenvolvimento

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Perfusão ex vivo da placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...