Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Авторы благодарят Пол Томас за микроскопом консультации и помощь. Эта работа, здесь была поддержана СИББН (Грант нет. BB/J009040/1 м.м.м. и Т.У).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Изоляция кишечника ткани Изоляция малого кишечника склепы и ворсинки и толстой склепы предполагает, подвергая поверхность слизистой оболочки, лечение с ЭДТА решение ослабить ячейку контакты, фракционирование (встряхивания) и центрифугирования. Протокол изоляции представленных кишечных ворсинок/склеп был изменен от Belshaw et al. и Уайтхед и др. 17 , 18
Подвергая поверхность слизистой оболочки Мы экспериментировали с целый ряд подходов к разоблачить поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта в развитии этой процедуры. Классический подход является Эверт (поворот наизнанку) трубка, обычно в сегментах около 100 мм в длину, с помощью металлического стержня которое перехватывается в складку ткани на одном конце, а затем оставшиеся трубки скользнул через трубу19. Для мыши ткани идеально металлический стержень (2,4 мм) с закругленными кончиками. Этот подход имеет преимущество расширения поверхности слизистой оболочки, позволяя более широкого доступа к PBS и ЭДТА. Мы изначально используется этот подход, но переехал в резки трубки в короткой длины (около 5 см) и открытия каждой секции с рассечения ножницы, как это оказалось проще. Этот способ уместен, если только несколько кишечника требуется; но если больше животных должны были быть использованы в эксперименте затем устройство специально для резки открыть трубку продольно, как описано в Йонеды et al. 14 будет более эффективным.
Отряд ворсинки и склепы из мышечных слоя Сначала мы использовали 3 мм ЭДТА в PBS и относительно длительный инкубационный период до 60 мин ослабить поверхности слизистой оболочки из основной ткани17,18. На этой концентрации ЭДТА мы обнаружили, что время инкубации 30 минут было достаточно, чтобы ослабить склепы из мыши кишки. Однако для изоляции склеп/ворсинок тонкой кишки мы стараемся, используя более концентрированной ЭДТА за более короткое время, которое оказалось эффективным подходом. Все последующие работа была проведена с ткани, извлеченные с помощью метода ЭДТА 30 мм, создания соответствующих фракций ворсинки или склепы. Для склепы мы обычно объединяют фракции 3-5 до фиксации, но важно проверить, являются ли эти соответствующих фракций как таймингов будет зависеть от ряда факторов, таких как положение вдоль желудочно-кишечного тракта, возраст мышь, воспаление, Предыдущая диета , и т.д. аналогичным образом, продолжительность времени, ткани необходимо быть поколеблен после ЭДТА лечение эффективным могут отличаться в различных условиях. В результате получается фракции изолированных ткани, содержащие смесь ворсинки и склепы или главным образом ворсинки или склепы (рис. 2). Как есть нет ворсинки в толстой кишке, склеп добыча может быть достижимыми в один шаг путем встряхивания ткани в тубе 30 s. Эти фракции можно затем фиксированной и обрабатываются для иммуно маркировки.
Изоляция кишечных organoids из подвала матрицы Изоляция organoids с подвале матрица куполов можно достичь с помощью решения восстановления клеток. Решение работает на depolymerizing матрице загущенное подвал, но температура должна быть 2-8 ° C. Предостережение что динамический микротрубочки не могут быть сохранены. Таким образом, для иммуно маркировки динамических микротрубочек и + советы как EBs клеток, восстановления от подвала матрицы до фиксации не рекомендуется. Однако большинство микротрубочек в дифференциации органоид клетки являются относительно стабильными, и они были сохранены (рис. 6). Он также работал хорошо для иммуно маркировки centrosomal и соединительной белков, а также ячейки маркеры.
Фиксация протоколы Формальдегид (свежеприготовленные из PFA) является относительно быстрого действия фиксатором, который формирует реверсивные cross-links, и 4% PFA работает хорошо для, например, в иммуно маркировки микротрубочек и гамма тубулина и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Более разбавлять PFA решения, такие как 1% хорошо работала для иммуно маркировки например, маркером стволовых клеток маркеры Lgr5 и Paneth ячейки CD24 в склепе ниши стволовых клеток, в то время как более высокие концентрации PFA не работает.
Добавление глютаральдегид дает лучшее сохранение микротрубочек и так называемые PHEMO фиксации, которая состоит из смеси 3,7% PFA, глютаральдегид 0,05% и 0,5% моющего средства в PHEMO буфера (68 мм трубы, мм 25 HEPES, 15 мм EGTA и 3 мм MgCl2)2 без ущерба для антигенностью дает отличную сохранность микротрубочек. Он также хорошо работает для иммуно маркировки гамма тубулина, β-катенина и E-Кадгерины и окрашивания нитей актина с Фаллоидин. Однако в 3D ткани и органоид культур, PHEMO фиксации несогласованные результаты и поэтому не использовался.
Метанол является коагулянта фиксатором, который дает относительно хорошее проникновение и стремится сохранить антигенностью. Фиксация с 100% метанола (-20 ° C) вводит некоторые усадка, дает умеренный морфология сохранение и работает микротрубочек, + советы и много centrosomal антител, включая ninein в 2D клеточных культур. Однако некоторые organoids рухнул при использовании этого метода фиксации. Кроме того проникновение антител через весь склепы, ворсинки или organoids первоначально было проблемой, но добавление 0,1% моющего средства промывочный раствор и длительное Стиральная достигнуты лучшие результаты.
Сочетание формальдегида и метанола ранее использовалось Роджерс и др. 20 -иммуно лейбл EB1 в дрозофила. Протокол фиксации на основе смеси формальдегида и метанола, поэтому был разработан для кишечных тканей и organoids, основанные на 3% формальдегида и 97% метанола охлажденным до-20 ° C, но пропуск карбонат натрия 5 мм из смеси, которая использовалась Роджерс и др. 20 Кроме того, образцы были установлены в холодильнике при температуре-20 ° C. Это работает особенно хорошо для маркировки immuno + советы, например КЛИПА-170 и EBs, но доказано также отлично подходит для фиксации и иммуно маркировки микротрубочек и актина в ткани и 3D organoids. Очень хорошо структурных сохранение было очевидным и антигенностью сохранилось несколько белков цитоскелета и связанных с ними, а также centrosomal белков, таких как гамма тубулина и ninein, хотя маркировки для ninein более последовательно работал с метанолом Фиксация.

Формирование эпителия с apico базальной полярности является основополагающим процесс развития и включает в себя драматической реорганизации микротрубочек и centrosomal белков. Массив радиальные микротрубочек, вытекающих из расположен centrosomal микротрубочки, организует центр (КТВМ) видно в многих животных клеток, и это хорошо подходит для сравнительно плоские клетки. В противоположность этому столбчатых эпителиальных клеток, таких, как те из кишечника, собрать-радиальная transcellular микротрубочки массивы, которые лучше поддерживать форму и специализированные функции этих клеток. Это драматической реорганизации микротрубочек достигается Центросома, переход к вершине и апикальной не centrosomal MTOCs (n-MTOCs) формирования, который становится ответственным за Анкоридж микротрубочек transcellular,1,,2 , 3 , 4 , 5.
Большая часть наших знаний эпителиальных дифференциации и связанные микротрубочек реорганизации пришла из исследования 2D в vitro слои клеток, которые не отображаются в vivo ткани архитектуры. Разработка 3D в vitro органоид культур, впервые,6Clevers и коллегами, представляет собой крупные технологические улучшения как они имитируют в vivo архитектуры и развития. Иерархия эпителиальных дифференциация проявляется в кишечнике; Стволовые клетки в нижней части склепы порождают незрелых транзита, усиливая клетки, которые размножаются и постепенно дифференцировать как они мигрируют вверх склеп на небольшой кишечных ворсинок или толстой поверхность, где они становятся полностью дифференцированной до того, как сарай в просвете7. Важно отметить, что это реплицируется в кишечных organoids, где клетки от ниши стволовых клеток пролиферировать образуя кисты, которые впоследствии сформировать бутоны склеп как с помощью стволовых клеток на дне и дифференциации, постепенно продвигается к кисты региона, который становится ворсинок как8. Кишечные органоид поэтому представляет мощную модель для изучения не только микротрубочек и centrosomal реорганизации во время дифференцировки эпителия, но многочисленные другие белки, а также обеспечивая идеальную платформу для скрининга наркотиков и продовольствия соединений потенциал терапевтические преимущества9,10.
Organoids хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков и оба забивные и organoids нокаут-может быть создан с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования11,12. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков для изучения важно, особенно для проверки поведения тегами белков. Иммуно маркировки 3D organoids, выращенных в подвале матрицы или ex vivo изолированные ткани является более сложным, чем клетки выросли в культуре блюда в 2D. Протокол фиксации необходимо сохранить деликатные 3D архитектура organoids сохраняя антигенностью антитела (то есть, epitopes для связывания антител). К примеру параформальдегида 4% (PFA) обычно используется как фиксатор, но пока это относительно быстрый обязанности фиксатором и дает хорошие морфологические сохранения, в наш опыт это часто приводит к потере антигенностью и не подходит для многих centrosomal антител. Следует также рассмотреть фиксатором и антител способность проникать 3D конструкций и тканей. С этой целью мы изменили и развитых протоколы для изоляции тканей и косвенные иммуно маркировки 3D в vitro organoids и ex vivo изолированных кишечных тканей. Мы опишем, как изолировать малого кишечника склепы и ворсинки и толстой ткани, и включить протокол для изоляции 3D organoids как альтернатива для фиксации и иммуно маркировки в матрице подвале. Мы представляем три альтернативных фиксации протоколы для иммуно маркировки микротрубочек и centrosomal белков, таких как ninein, и микротрубочек плюс конец отслеживания белков (+ советы), таких как белки EB и клип-170 (см. также ссылки8, 13). Мы также обсудить достоинства и недостатки, связанные с каждым протоколом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Появлением organoids 3D в пробирке , которые имитируют в vivo ткани архитектуры и морфогенез значительно расширить возможности для изучения ключевых биологических вопросов в клетке и биологии развития. Кроме того organoids вместе с последних технических достижений в ген редактирования и вирусных генов доставки обещает продвижения медицинских исследований и разработки новых препаратов для лечения заболеваний. Organoids выращенных в пробирке в подвале матрицы обеспечивают мощную модель системы для изучения поведения и функции различных белков и хорошо подходят для жить изображений меткой флуоресцентных белков. Однако создание выражения и локализации эндогенного белков в ex vivo ткани и в пробирке organoids имеет важное значение для проверки поведения тегами белков. С этой целью мы разработали и изменения тканей изоляции, фиксации и иммуно маркировки протоколы для локализации микротрубочек, centrosomal и связанных с ней белков в ex vivo кишечника ткани и в пробирке кишечных organoids. Целью было для фиксатором для сохранения 3D архитектура organoids/ткани также сохраняя антигенностью антитела и позволяет хорошее проникновение и распродажа фиксатором и антител. Воздействие холода depolymerizes все, но стабильные микротрубочки и это является ключевым фактором при изменении различных протоколов. Мы обнаружили, что увеличение Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) концентрации от 3 мм до 30 мм дал эффективное отряд ворсинки и склепы в тонкой кишке, в то время как ЭДТА 3 мм было достаточно для толстой склепы. Протокол фиксации развитых формальдегида/метанола дали очень хорошие структурных сохранения сохраняя при этом антигенностью для эффективного нанесения этикеток микротрубочек, актина и конец связывающих белков (EB). Он также работал для centrosomal белка ninein, хотя протокол метанола работал более последовательно. Далее мы установили, что фиксация и иммуно маркировки микротрубочек и связанных белков может быть достигнуто с organoids изолированы от или оставаясь в подвале матрицы.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Мы представляем протоколы для изоляции кишечных 3D конструкций из ткани в естественных условиях и в пробирке подвале матрица встроенного organoids и подробно различные фиксации и пятная протоколы, оптимизированный для иммуно маркировки микротрубочек, centrosomal и соединительной белки также как ячейки маркеры, включая стволовых клеток белка Lgr5.

Иммуно люминесцентные маркировки микротрубочек и Centrosomal белков в Ex Vivo кишечных тканей и 3D в Vitro кишечных Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Вирусный-опосредованной маркировки и трансплантации медиальной ганглиозные Высокопреосвященства (MGE) Клетки для<em&gt; В Vivo</em&gt; Исследования

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя<em&gt; В Vivo</em&gt; И<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализы

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Обработка тканей человека сердца к внеклеточного матрикса самостоятельной сборки Гидрогель для In Vitro и In Vivo приложений

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex естественных условиях перфузии плаценты грызунов

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Повторяя сосание к отнятию Переход в пробирке с использованием плода кишечных органоидов

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...