Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Los autores agradecen a Paul Thomas de microscopio asesoramiento y asistencia. Este trabajo trata fue financiado por el BBSRC (subsidio no. BB/J009040/1 a M.M.M. y T.W.).

<ol>
	<li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium.">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li><li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells.">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells.">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li><li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila.">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li><li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-organizing+centers:+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites.">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres.">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li><li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening.">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer.">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li><li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts.">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation.">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li><li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine.">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIS1,+CLIP-170's+key+to+the+dynein/dynactin+pathway.">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li><li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa.">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li><li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice.">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly,+dynamics,+and+positioning+of+the+mitotic+spindle.">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li></ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aislamiento del tejido intestinal Aislamiento de pequeñas criptas intestinales, las vellosidades y criptas colónicas consiste en exponer la superficie de la mucosa, el tratamiento con solución de EDTA para aflojar la centrifugación, fraccionamiento (temblor) y contacto. Se ha modificado el protocolo de aislamiento intestinal presentan vellosidad/cripta de Belshaw et al. y Whitehead et al. 17 , 18
Exponer la superficie de la mucosa Hemos experimentado con un número de enfoques para exponer la superficie mucosa del tracto intestinal en el desarrollo de este procedimiento. Un enfoque clásico es evert (vuelta adentro hacia fuera) el tubo, generalmente en segmentos de aproximadamente 100 mm de largo, con una varilla metálica que está atrapada en un pliegue del tejido en un extremo y luego el tubo restante se deslizó sobre el tubo19. Para el tejido del ratón, una barra de metal (2,4 mm de diámetro) con los extremos redondeados es ideal. Este enfoque tiene la ventaja de ampliar la superficie de la mucosa que permite el acceso a la PBS y EDTA. Al principio utiliza este enfoque pero se trasladó a cortar el tubo de corta longitud (unos 5 cm) y apertura de cada sección con tijeras de disección como esto resultó más fácil. Este enfoque es apropiado si sólo tienen unos intestinos; pero si más animales debían ser utilizados en un experimento entonces un dispositivo especialmente diseñado para corte abierto el tubo longitudinalmente, como se describe por Yoneda et al. 14 sería más eficiente.
Separación de las vellosidades y las criptas de la capa muscular Inicialmente se utilizó EDTA en PBS y tiempos de incubación relativamente largo de hasta 60 min de 3 mM para aflojar la superficie de la mucosa de la subyacente tejido17,18. En esta concentración de EDTA encontramos que un tiempo de incubación de 30 min era suficiente para aflojar las criptas del colon de ratón. Sin embargo, para el aislamiento de cripta/vellosidad del intestino intentamos utilizando EDTA concentrado para un tiempo más corto, que ha demostrado para ser un enfoque eficaz. Se realizó todo el trabajo posterior con el tejido extraído mediante la técnica de EDTA 30 mM generando importantes fracciones de las vellosidades o criptas. Para criptas, normalmente se agruparon fracciones 3-5 antes de fijar, pero es importante verificar si estos son las fracciones adecuadas según los tiempos dependerá de una serie de factores como la posición a lo largo del tracto intestinal, la edad del ratón, la inflamación, la dieta anterior , etc. de manera similar, la longitud del tiempo el tejido necesita ser sacudido tras el tratamiento de EDTA sea eficaz puede variar bajo diferentes condiciones. El resultado es fracciones de tejido aislado que contiene una mezcla de vellosidades y criptas o principalmente las vellosidades o criptas (figura 2). Como en el colon no hay vellosidades, la extracción de la cripta puede ser posible en un solo paso sacudiendo el tejido en tubo de 30 s. Estas fracciones pueden fijarse y procesadas para el inmuno-etiquetado.
Aislamiento de organoides intestinal de matriz de sótano Aislamiento de organoides de sótano matriz cúpulas se logra mediante el uso de solución de recuperación de la célula. La solución trabaja por depolymerizing la matriz gelificada sótano pero el temperatura debe ser entre 2-8 ° C. Una nota de precaución es que los microtúbulos dinámicos no pueden ser preservados. Así, para el inmuno-etiquetado de microtúbulos dinámicos y + consejos como la celda EBs, recuperación de la matriz basal antes de la fijación no es recomendable. Sin embargo, la mayoría de los microtúbulos en las células diferenciadoras del organoide es relativamente estable y estos fueron preservados (figura 6). También trabajó bien para el inmuno-etiquetado de proteínas centrosómicas y Unión como marcadores de la célula.
Protocolos de fijación Formaldehído (recién hecha de PFA) es un fijador de acción relativamente rápida que forma reversible aglutina y 4% PFA funciona bien por ejemplo, en el inmuno-etiquetado microtúbulos y gamma tubulina y filamentos de actina tinción con Phalloidin. Más diluído soluciones PFA como 1% trabajado bien para el inmuno-etiquetado por ejemplo, con el marcador de célula de los marcadores Lgr5 y Paneth células CD24 dentro del nicho de células madre de cripta, mientras que concentraciones más altas de la PFA no funcionaba.
La adición de glutaraldehído da mejor preservación de los microtúbulos y la llamada fijación de PHEMO que consiste en una mezcla de 3,7% PFA, 0.05% glutaraldehído y 0.5% de detergente PHEMO tampón (tubos de 68 mM, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA y 3 mM MgCl2)2 da preservación excelente de microtúbulos sin comprometer la antigenicidad. También funciona bien para el inmuno-etiquetado gamma-tubulina β-catenina y E-cadherina y tinción filamentos de actina con phalloidin. Sin embargo, en culturas de organoides y tejido 3D, la fijación de PHEMO produce resultados inconsistentes y por lo tanto no se utilizó.
El metanol es un fijador coagulante relativamente buena penetración y tiende a preservar la antigenicidad. Fijación con metanol al 100% (-20 ° C) introduce alguna contracción da preservación de morfología moderada y funciona para muchos anticuerpos se incluyendo ninein en cultivos celulares 2D + consejos y microtúbulos. Sin embargo, algunos organoides se derrumbaron cuando se utiliza este método de fijación. Además, penetración de anticuerpos a través de criptas, vellosidades u organitas todo era inicialmente un problema, pero la adición de 0,1% detergente para la solución de lavado y lavado prolongado logra mejores resultados.
Una combinación de formaldehído y metanol había sido utilizada previamente por Rogers et al. 20 a inmuno-etiqueta EB1 en Drosophila. Un protocolo de fijación basado en una mezcla de formaldehído y metanol fue desarrollado por lo tanto para tejido intestinal y organitas basado en 3% metanol formaldehído y 97% frío a-20 ° C, pero omitiendo el carbonato de sodio 5 mM de la mezcla que fue utilizada por Rogers et al. 20 además, las muestras se fijaron en el congelador a-20 ° C. Esto trabajó particularmente bien para el inmuno-etiquetado + consejos, tales como CLIP-170 y el EBs, pero también resultó excelente para la fijación y el inmuno-etiquetado microtúbulos y actina dentro de tejido y 3D organitas. Muy buena conservación estructural era evidente y antigenicidad fue preservada por varias proteínas citoesqueléticas y asociadas así como proteínas centrosómicas como gamma tubulina y ninein, aunque etiquetado para ninein trabajó más consistentemente con metanol fijación.

Formación de epitelios polaridad apico-basal es un proceso fundamental en el desarrollo e implica una dramática reorganización de los microtúbulos y proteínas centrosómicas. Una matriz de microtúbulos radiales que emanan de un microtúbulos se encuentra organización de centro (COMT) es prominente en muchas células animales y esto es ideal para células relativamente planas. En contraste, las células epiteliales columnares, como las del intestino, montan no radiales transcelular microtubulares que soportan mejor la forma y funciones especializadas de estas células. Esta dramática reorganización de los microtúbulos es alcanzada por el centrosoma hacia el ápice y COMTs no centrosómicos apicales (n-MTOCs) formando, que se convierte en responsable de anclaje de los microtúbulos transcelular1,2 , 3 , 4 , 5.
Gran parte de nuestro conocimiento de la diferenciación epitelial y la reorganización de microtúbulos asociados proviene de las investigaciones de 2D en vitro capas celulares que se muestra la arquitectura de tejidos en vivo . Desarrollo de 3D en vitro organoide culturas por Clevers y colaboradores6, representa un gran avance tecnológico ya que imitan en vivo arquitectura y desarrollo. Una jerarquía de diferenciación epitelial es evidente en el intestino; las células de vástago en la parte inferior de las criptas dan lugar a inmaduro tránsito amplificando células que proliferan y diferencian gradualmente mientras migran hasta la cripta en la pequeña vellosidad intestinal o la superficie colónica, donde ser distinguidos completamente antes de ser arrojar sobre el lumen7. Lo importante, esto se repite en organoides intestinal donde las células del nicho de células madre proliferan formando quistes que posteriormente generan brotes de la cripta-como con las células de vástago en la parte inferior y avanzando gradualmente hacia la región del quiste, la diferenciación que se convierte en vellosidad como8. El organoide intestinal por lo tanto representa un poderoso modelo para el estudio no sólo de microtúbulos y se reorganización durante la diferenciación epitelial pero numerosas otras proteínas, así como proporcionar una plataforma ideal para la detección de drogas y alimentos compuestos de potencial terapéutico beneficia a9,10.
Organoides se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas y tanto golpe y organoides de knock-out pueden ser generada usando gene CRISPR/Cas9 edición11,12. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas a estudiar es importante, especialmente para comprobar el comportamiento de las proteínas etiquetados. Inmuno-etiquetado 3D organitas en matriz de sótano o ex vivo aislado el tejido es más complejo que las células cultivadas en platos de la cultura en 2D. El protocolo de fijación debe preservar la delicada arquitectura 3D de organoides todavía conservando antigenicidad de anticuerpos (es decir, los epitopos para atar los anticuerpos). Por ejemplo, 4% paraformaldehido (PFA) es comúnmente usado como un fijador pero mientras que es relativamente rápida fijador y da buena preservación morfológica, en nuestra experiencia con frecuencia resulta en la pérdida de antigenicidad y no es conveniente para muchos anticuerpos se. También debe considerarse la capacidad de los anticuerpos y fijador para penetrar el tejido y las estructuras 3D. Con este fin, hemos modificado y desarrollados protocolos para el aislamiento de tejido y el inmuno-etiquetado indirecto de organoides 3D en vitro y ex vivo aislaron de tejido intestinal. Describimos Cómo aislar pequeñas criptas intestinales y vellosidades y tejido colónico e incluir un protocolo para el aislamiento de organoides 3D como alternativa a la fijación e inmuno-etiquetado dentro de la matriz de sótano. Presentamos tres protocolos de fijación alternativos para el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas, como ninein y proteínas de plus-rastreo de microtúbulos (+ consejos), como las proteínas de la EB y CLIP-170 (véase también referencias8, 13). También discutimos los pros y los contras asociados a cada protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>washing and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>isolate organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lobind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td>prevent cells sticking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11517532</td>
			<td>Isolate crypts from villi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>used as non-stick agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (36.5&#8211;38% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 99.9% Analytical grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td>used as fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td>
			<td>Maxvision 
			Biosciences</td>
			<td>MF01-S</td>
			<td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator SB2 or SB3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td>microcentrifuge tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D27802</td>
			<td>anti-fade agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>N/C366</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td>
			<td>Clarity</td>
			<td>NQS13/2250</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement matrix for 3D organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>for processing tissue/organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td>for isolated organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td>primary antibody 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6160</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15246</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610473/4</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53360</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>610535</td>
			<td>primary antibody 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP2745d</td>
			<td>primary antibody 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rat 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>112545167</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-mouse 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>ST115545166</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight anti-rabbit 647</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111605144</td>
			<td>seconday antibody 1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

La llegada de las 3D en vitro organoides que imitan la arquitectura de tejido en vivo y la morfogénesis ha avanzado enormemente la capacidad para el estudio de cuestiones biológicas fundamentales en biología celular y del desarrollo. Además, organitas junto con los últimos avances técnicos en la edición de genes y genes virales se compromete a avanzar en la investigación médica y desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades. Organoides en vitro en matriz de sótano proporcionan sistemas potente modelo para estudiar el comportamiento y función de proteínas diferentes y se adaptan bien para vivir-la proyección de imagen de proteínas fluorescentes etiquetadas. Sin embargo, establecer la expresión y localización de las proteínas endógenas en tejido ex vivo y in vitro es importante verificar el comportamiento de las proteínas etiquetados organitas. Con este fin hemos desarrollado y modificado aislamiento de tejido, la fijación y el inmuno-etiquetado protocolos para localización de microtúbulos, proteínas centrosómicas y asociados en tejido intestinal ex vivo y en vitro intestinal organitas. El objetivo fue para que el fijador preservar la arquitectura 3D de organoides y tejidos también preservando la antigenicidad de anticuerpo y permitir la buena penetración y remoción de anticuerpos y fijador. Exposición al frío depolymerizes todos pero los microtúbulos estables y esto fue un factor clave cuando se modifica los distintos protocolos. Se encontró que aumentando la concentración de (EDTA) ácida etilendiaminotetracético de 3 mM a 30 mM dio la separación eficiente de las vellosidades y las criptas en el intestino, mientras que 3 mM EDTA era suficiente para las criptas colónicas. El protocolo de fijación formaldehído/metanol desarrollado dio muy buena conservación estructural también conservando antigenicidad de etiquetado eficaz de microtúbulos, actina y las proteínas (EB) final. También trabajó para el ninein proteínas centrosómicas a pesar del Protocolo de metanol más consistentemente. Además establecimos que pueden lograrse la fijación y el inmuno-etiquetado de microtúbulos y proteínas asociadas con organoides aislados o permanecer dentro de la matriz de sótano.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Presentamos los protocolos para el aislamiento de estructuras 3D intestinales del tejido en vivo y en vitro matriz sótano integrado organoides y fijación diversos detalles y protocolos optimizados para el inmuno-etiquetado de microtúbulos, la coloración proteínas centrosómicas y Unión, así como la célula de marcadores como la proteína de la célula de vástago Lgr5.

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Etiquetado y mediada por virus Trasplante de Medial ganglionar Eminencia (MGE) Las células para<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudios

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Ex vivo perfusion de la placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...