Name: a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev gjort mulig takket være støtte af: universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014 2016; og Kinesis for at levere plasticware nødvendigt at gennemføre denne undersøgelse. Vi takker Dr. Shane Windsor (Fakultet, University of Bristol, UK) for at give Cell_PIV software.

Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug og etiske udvalg på universitetet i Pavia. Dyrene blev opretholdt under 22 ° C, 60% luftfugtighed og en lys/mørke cyklus på 12:12 h.
1. æggestokken Isolation
<ol><li>Injicere intraperitoneal 2 fire til elleve uger gamle CD1 hunmus med 10 U af follikelstimulerende hormon med en steril 1 mL insulin sprøjte.</li>
	<li>Vente 46-48 h.</li>
	<li>Vejer musen og bedøver med en intramuskulær injektion på...

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

Der er flere vigtige skridt man skal tage sig af mens de udfører denne protokol med musen oocytter, samt de af andre arter. Når isoleret fra deres follikler, oocyter bør være umiddelbart overføres til optagelse dråber, som adskillelsen fra følgesvend cumulus celler udløsere i begyndelsen af GV at MII overgangen. En eventuel ændring af denne protokol kunne være tilsætning af 3-isobutylmethacrylat-1-Methylxanthin (IBMX) til M2 medium anvendes til p-piller isolation. IBMX forhindrer omgående udløsning af GV at ...

Kvindelig infertilitet er en patologi, som berører et stigende antal kvinder. Ifølge World Health Organization er omkring 20% af parrene ufrugtbar, med en 40% på grund af kvindelig infertilitet. Desuden er en tredjedel af kvinder, der gennemgår kræftbehandling (300.000 pr. år og 30.000 pr. år i USA eller Italien, henholdsvis) udvikle tidligt ovariesvigt.
En strategi til forebyggelse af barnløshed hos kræftpatienter er isoleret og kryopræservering af ovariefollikler før onkologisk behandling, efterfulgt af in vitro- modning (IVM) af GV oocyter MII fase (GV at MII overgang). Tilgængeligheden af non-invasiv markører for oocyt udviklingsmæssige kompetence ville forbedre befrugtningen og udviklingsprocesser og den samlede graviditet succes1,2.
Baseret på deres kromatin konfiguration observeret efter farvning med den supravital fluorokrom Hoechst 33342, pattedyr fuldt udvokset oocyter klassificeres enten som en omgivet Nucleolus (SN) eller en ikke omgivet Nucleolus (NSN)3. Udover deres forskellige kromatin organisation vise disse to typer af oocytter mange morfologiske og funktionelle forskelle3,4,5,6,7,8 ,9, herunder deres meiotiske og udviklingsmæssige kompetence. Når isoleret fra æggestokken og modnet i vitro, begge type oocyter reach MII fase, og efter sæd insemination, udvikle til de 2-celle stadium, men kun dem med en SN kromatin organisation kan udvikle sig til begrebet9. Selvom god som en klassificeringsmetode for at vælge kompetente vs inkompetente oocytter, er den største ulempe de mutagene virkning, som fluorokrom, sig selv og først og fremmest UV-lys bruges til dens afsløring kan have på cellerne.
Af alle disse grunde søgte vi efter andre non-invasiv datamærker forbundet med SN eller NSN kromatin kropsbygning som kunne erstatte brugen af Hoechst samtidig opretholde samme høje klassificering nøjagtighed. Time-lapse observation af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) fremstår som en funktion karakteristiske celle status. Nylige undersøgelser påviste f.eks, association mellem CMVs registreres på tidspunktet for befrugtning og kapacitet af mus og menneskelig zygotes til komplet præimplantationsdiagnostik og fuldbårne udvikling10,11.
Baseret på disse tidligere undersøgelser, beskriver vi her en platform for anerkendelse af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter5,6,7,8. Platformen er baseret på tre vigtigste skridt: 1) oocyter isoleret fra antral follikler er først klassificeret baseret på deres kromatin konfiguration enten som en omgivet nucleolus (SN) eller en ikke-omgivet nucleolus (NSN); 2) time-Lapse billeder af CMVs opstår under GV at MII overgangen af hver enkelt oocyt er taget og analyseret med partikel billede Velocimetri (PIV); og 3) oplysninger indhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige neurale netværk (FANN) for blinde klassificering12,13. Vi give nærmere oplysninger om de mest kritiske trin i den procedure, der er designet til musen til at gøre det klar tilgængelige til at blive testet og bruges til andre pattedyr arter (fx kvæg, abe og mennesker).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Folligon</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:157px;">A201A02</td>
			<td style="width:499px;">Hormonal treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">B2261</td>
			<td>For oocyte heterochromatin staining</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:363px;">Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:157px;">430165</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td>
			<td style="width:239px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:157px;">MR-015-D</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M4526</td>
			<td>For oocyte in vitro maturation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&#160;</td>
			<td style="width:239px;">WillCo&#160;</td>
			<td style="width:157px;">GWSt-3522</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">BioStation IM-LM&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">MFA91001</td>
			<td>Live cell screening system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:239px;">Delchimica Scientific Glassware</td>
			<td>6709230</td>
			<td>For follicles manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M8410</td>
			<td>To prevent contamination and medium evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Penicillin / Streptomycin</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">15070063</td>
			<td>To prevent medium contamination&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">ML16141079</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">25030</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T0625</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A3310</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">&#160;P4562</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td>
			<td style="width:239px;">Virbac Srl</td>
			<td style="width:157px;">QN01AX9</td>
			<td>For mice anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:363px;">Cell_PIV sofware&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td style="width:499px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MATLAB</td>
			<td style="width:239px;">The MathWorks, Natick, MA&#160;</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td>For multi-paradigm numerical computing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

Infertilitet klinikker ville drage fordel af muligheden for at vælge udviklingshæmmede kompetente vs inkompetente oocyter ved hjælp af ikke-invasive procedurer, dermed forbedre det samlede graviditet resultatet. Vi har for nylig udviklet en klassificeringsmetode baseret på mikroskopiske levende observationer af musen oocyter under deres i vitro modning fra den germinale vesikel (GV) metafase II scenen, efterfulgt af en analyse af cytoplasmatisk bevægelser forekommende i denne time-lapse periode. Vi præsenterer her, detaljerede protokoller af denne procedure. Oocytter er isoleret fra fuldt udvokset antral follikler og kulturperler for 15 h inde i et mikroskop udstyret for time-lapse analyse ved 37 ° C og 5% CO2. Billederne er taget med 8 min. mellemrum. Billederne er analyseret ved hjælp af metoden partikel billede Velocimetri (PIV), der beregnes for hver oocyt profil af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) forekommer i hele perioden kultur. Endelig, CMVs af hver enkelt oocyt fodres gennem en matematisk klassificering værktøj (Feed-forward kunstige neurale netværk, FANN), der forudsiger sandsynligheden for en gamet udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente med en nøjagtighed på 91.03%. Denne protokol, sat op til musen, kan nu blive testet på oocytter af andre arter, herunder mennesker.

Figur 2 viser en repræsentativ udviklingshæmmede kompetente og inkompetente oocyt, henholdsvis i begyndelsen (GV) og på IVM procedurens afslutning (MII). IVM af fuldt udvokset mus oocyter opstår under 15 h kultur. Time-Lapse observation registrerer progression af meiose og registrerer store meiotiske begivenheder, herunder GVBD og ekstrudering af første polar kroppen.
Analyse og sammenligning a...

Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Vi præsenterer her, en protokol for non-invasiv vurdering af oocyt udviklingsmæssige kompetence udført under deres i vitro modning fra den germinale vesikel metafase II scenen. Denne metode kombinerer time-lapse imaging med partikel billede Velocimetri (PIV) og neurale netværk analyse.

En neurale netværk-baseret identifikation af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differentiering af Mouse Embryonale stamceller i Serumfrit monolagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering og karakterisering af muse Antral Oocyter Baseret på nucleolar chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolering og Udvidelse af Voksen Canine Hippocampale Neural Forstadier

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse af retinoidsyre-induceret Neural Differentiation af muse embryonale stamceller i to og tre-dimensionelle embryoide legemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generering af genetisk modificerede mus gennem mikroinjektion af oocytter

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissektion, kultur og analyse af primær kranie neurale crest celler fra mus til studiet af Neural Crest celle delaminering og migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulær støbning af voksne og tidlige postnatal mus lunger til Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Differentiering og karakterisering af neurale forfædre og neuroner fra museembryst stamceller

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...