Name: a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble gjort mulig takket være støtte av: Universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014, 2016; og Kinesis for å forsyne plasticware nødvendig å gjennomføre denne studien. Vi takker Dr. Shane Windsor (avdeling for ingeniørutdanning, University of Bristol, UK) for å gi Cell_PIV programvaren.

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av de institusjonelle Animal Care og bruk og etiske komiteer på Universitetet i Pavia. Dyrene var holdt under forhold med 22 ° C, 60% luftfuktighet og en lys/mørke syklus av 12:12 h.
1. eggstokk isolasjon
<ol><li>Injiser intraperitoneally 2 fire-til-elleve uke gamle CD1 kvinnelige mus med 10 U av follicle stimulerende hormone med en bakteriefri 1 mL insulinsprøyte.</li>
	<li>Vent 46-48 h.</li>
	<li>Veie musen og bedøve med en intramuskulæ...

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

Det er flere viktige skritt man bør ta vare på mens de utfører denne protokollen med musen oocytes og de andre arter. Isolerte fra deres hårsekker oocytes bør umiddelbart overføres til opptak dråper, som separasjon fra følgesvenn cumulus celler utløsere begynnelsen av GV å MII overgangen. En mulig endring til stede protokollen kan være tillegg av 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) til M2 mediet som brukes for COCs isolasjon. IBMX forhindrer umiddelbar følge av GV å MII overgangen og tillater en synkroniserin...

Kvinnelig ufruktbarhet er en patologi som påvirker et økende antall kvinner. Ifølge Verdens helseorganisasjon er rundt 20% av par ufruktbare, 40% på grunn av kvinnelig ufruktbarhet. I tillegg en tredjedel av kvinner som gjennomgår kreft behandlinger (300.000/år og 30.000 i året i USA eller Italia, henholdsvis) utvikle prematur eggstokksvikt.
En strategi for å hindre ufruktbarhet i kreftpasienter er isolasjon og kryonisk bevaring av eggstokkene follicles før oncological behandling, etterfulgt av i vitro modning (IVM) av GV oocytes til MII scenen (GV å MII overgang). Tilgjengeligheten av ikke-invasiv markører oocyte utviklingsmessige kompetanse ville forbedre befruktning og utviklingsprosesser og generelle graviditet suksess1,2.
Basert på deres chromatin konfigurasjon observert etter farging med den supravital fluorochrome Hoechst 33342, pattedyr fully-grown oocytes klassifiseres enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke omgitt kjerne (NSN)3. Foruten deres ulike chromatin organisasjon vise disse to typer oocytes mange morfologiske og funksjonelle forskjeller3,4,5,6,7,8 ,9, inkludert deres meiotic og utviklingsmessige kompetanse. Når isolert fra eggstokken og modnet i vitro, både type oocytes rekkevidde MII scenen, og etter sperm inseminasjon, utvikle til 2-celle scenen, men bare de med en SN chromatin organisasjon kan utvikle til begrepet9. Selv om det er bra som en klassifisering metode for valg av kompetente vs inkompetente oocytes, er den største ulempen mutagene effekten som fluorochrome seg og, fremfor alt, UV-lyset brukes for oppdagelsen kan ha på cellene.
For alle disse grunner søkte vi på andre ikke-invasiv markører forbundet med SN eller NSN chromatin konformasjon som kan erstatte bruken av Hoechst samtidig opprettholde samme høye klassifisering nøyaktighet. Time-lapse observasjon av cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) fremstår som en funksjon karakteristiske celle status. For eksempel vist studier tilknytningen mellom CMVs registrert på tidspunktet for befruktning og kapasiteten til mus og menneskelig zygotes å fullstendig preimplantation og full sikt utvikling10,11.
Basert på disse tidligere studier, beskriver vi her en plattform for anerkjennelse av developmentally kompetent eller inkompetent musen fully-grown oocytes5,6,7,8. Plattformen er basert på tre hovedtrinn: 1) Oocytes isolert fra Boas follikler klassifiseres først basert på deres chromatin konfigurasjon enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke-omgitt kjerne (NSN); 2) time-Lapse bilder av CMVs forekommer under GV å MII overgangen til hver enkelt oocyte tatt og analysert med partikkel bilde velocimetry (PIV); og 3) innhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige nevrale nettverk (FANN) for blinde klassifisering12,13. Vi gir detaljer om de viktigste trinnene i fremgangsmåten designet for musen for å gjøre den klar tilgjengelig testet og brukes for andre pattedyrarter (f.eks storfe, ape og mennesker).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Folligon</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:157px;">A201A02</td>
			<td style="width:499px;">Hormonal treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">B2261</td>
			<td>For oocyte heterochromatin staining</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:363px;">Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:157px;">430165</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td>
			<td style="width:239px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:157px;">MR-015-D</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M4526</td>
			<td>For oocyte in vitro maturation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&#160;</td>
			<td style="width:239px;">WillCo&#160;</td>
			<td style="width:157px;">GWSt-3522</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">BioStation IM-LM&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">MFA91001</td>
			<td>Live cell screening system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:239px;">Delchimica Scientific Glassware</td>
			<td>6709230</td>
			<td>For follicles manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M8410</td>
			<td>To prevent contamination and medium evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Penicillin / Streptomycin</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">15070063</td>
			<td>To prevent medium contamination&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">ML16141079</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">25030</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T0625</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A3310</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">&#160;P4562</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td>
			<td style="width:239px;">Virbac Srl</td>
			<td style="width:157px;">QN01AX9</td>
			<td>For mice anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:363px;">Cell_PIV sofware&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td style="width:499px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MATLAB</td>
			<td style="width:239px;">The MathWorks, Natick, MA&#160;</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td>For multi-paradigm numerical computing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

Ufruktbarhet klinikker ville ha nytte av muligheten til å velge developmentally kompetent vs inkompetente oocytes bruker ikke-invasiv prosedyrer, dermed forbedre den generelle svangerskapsutfall. Vi har nylig utviklet en klassifisering metode basert på mikroskopisk live observasjoner av musen oocytes under deres i vitro modning fra germinal vesicle (GV) til metaphase II scenen, etterfulgt av analyse av cytoplasmatiske bevegelser forekommer i denne time-lapse perioden. Her presenterer vi detaljerte protokoller av denne prosedyren. Oocytes er isolert fra fully-grown Boas follicles og kultivert 15 h i mikroskop utstyrt for time-lapse analyse på 37 ° C og 5% CO2. Bildene er tatt på 8 min intervaller. Bildene analyseres ved hjelp av metoden partikkel bilde Velocimetry (PIV) som beregner, for hver oocyte, profilen til cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) oppstår i hele kultur perioden. Til slutt, CMVs av hver enkelt oocyte fôres gjennom en matematisk klassifisering verktøyet (Feed-forward kunstige nevrale nettverk, FANN), som anslår sannsynligheten for en Kjønnscelle developmentally kompetent eller inkompetente med en nøyaktighet på 91.03%. Denne protokollen, satt opp for musen, kan nå testes på oocytes av andre arter, inkludert mennesker.

Figur 2 viser et representativt developmentally kompetente og inkompetente oocyte, henholdsvis i begynnelsen (GV) og slutten (MII) av IVM prosedyren. IVM av fully-grown musen oocytes oppstår under 15t kultur. Time-Lapse observasjon registrerer progresjon av meiose og oppdager store meiotic arrangementer, inkludert GVBD og byggesystemer i første polar kroppen.
Analyse og sammenligning av mer enn to...

Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Her presenterer vi en protokoll for ikke-invasiv vurdering av oocyte utviklingsmessige kompetanse utført under deres i vitro modning fra germinal vesicle på metaphase II scenen. Denne metoden kombinerer tidsinnstilt bildebehandling med partikkel bilde velocimetry (PIV) og nettverk analyser.

En nevrale nettverk-basert identifikasjon av Developmentally kompetent eller inkompetent musen Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder for Nettopp Lokalisert Overføring av celler eller DNA i Early fostertap Mouse Embryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering og karakterisering av Mouse Antral Oocytter Basert på nukleolært Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolering og Utvidelse av Voksen Canine Hippokampale Neural Prekursorer

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse av retinsyre-indusert Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i to og tre-dimensjonale embryoidlegemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generering av genetisk modifiserte mus gjennom mikroinjeksjon av oocytter

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Disseksjon, kultur og analyse av primær skallen neural Crest celler fra mus for studiet av Neural Crest Cell delaminering og migrasjon

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulær støping av voksne og tidlige postnatale muslunger for micro-CT-bildebehandling

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Differensiering og karakterisering av nevrale forfedre og nevroner fra musens embryonale stamceller

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...