Name: collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wird unterstützt vom Anschubfonds College of Veterinary Medicine (WSU), WW. Die Autoren danken Sierra Olsen (WSU) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Tiere und Verfahren, die in dieser Studie wurden nach Washington State University (WSU) Animal Care und Use Committee Richtlinien und unter Einhaltung der WSU zugelassene tierische Protokolle #4702 "und" #4735 bearbeitet.
(1) Mäuse
<ol><li>
Verwenden Sie standard C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen oder anderen Stämmen von Interesse. Tiere unter einer kontrollierter Temperatur und feuchte Umgebung, mit Ad Libitum Zugang von Wasser und Nahrung zu erhalten.</strong...

<ol>
	<li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract.">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li><li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster.">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li><li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+semenogelin.">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li><li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semenogelin,+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa.">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li><li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer:+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches.">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li><li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction.">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li><li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility,+capillary+tube+test,+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program.">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li><li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo.">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).</li><li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+semen+hyperviscosity:+prevalence,+pathogenesis+and+therapeutic+aspects.">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li><li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses.">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li><li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+vaginal+lavage,+crystal+violet+staining,+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification.">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Fundamentals+of+Breeding+and+Weaning.">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases.">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li><li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid.">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li></ol>

Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Ut...

Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix1hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung2gefegt.
Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und3immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)4 ,5,6. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit7bewerten.
Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte8verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer9, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen7konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="571">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Toothpick</td>
			<td style="width:71px;">Diamond</td>
			<td style="width:119px;">750-Flat</td>
			<td style="width:167px;">Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5045</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">25-&#956;L glass capillary tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53432-761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15 media</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415064</td>
			<td style="width:167px;">Supplement with 1% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:71px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">2-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Digital dry block heater</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259-052</td>
			<td style="width:167px;">For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">LSE 6765</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">35-mm culture dish</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10861-656</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">15-mL polypropylene centrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10025-686</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Precision</td>
			<td style="width:119px;">TSGP05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Heated stage stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">MZ10F</td>
			<td style="width:167px;">To keep the tissue warm prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMi8</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Camera</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMC2900</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Coverslip</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393-059</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Bleach</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute in dH2O to 10% concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice

Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.

Sperma wurde von Strg und KO Weibchen ca. 8 h gesammelt, nach der Paarung mit fruchtbaren Strg-Männchen. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) wird durch den Zeitaufwand für die 25 μL Kapillarrohr mit Sperma füllen quantifiziert. Samen gesammelt von Strg Uteri 2.06 ±0.12 min nahm (mean±S.E.M, n = 5), das Kapillarrohr (Abbildung 1) zu füllen. Die Samen gesammelt von KO Uteri dauerte jedoch länger als 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentelle Zeit. Dies...

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Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Orthotopen Eierstock Transplantationsverfahren zu untersuchen, die Gesundheit und Lebensdauer Einfluss der Eierstöcke Seneszenz bei weiblichen Mäusen

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Kombinatorische Behandlung von Trichostatin A und Vitamin C verbessert die Effizienz des Klonens Mäuse durch Kerntransfer somatischer Zellen

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte

Verwendung von Bisektion zur Reduzierung der mitochondrialen DNA in der Rinderzelle

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) may be used to rescue endangered species, but two distinct populations of mitochondrial DNA (mtDNA) ...