Name: collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00
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Este trabajo es apoyado por el fondo de puesta en marcha de Universidad de medicina veterinaria (WSU) a WW. Los autores agradecen Sierra Olsen (WSU) la lectura crítica de este manuscrito.

Todos los animales y los procedimientos utilizados en este estudio se manejaron según las directrices de la Comisión de uso y cuidado de animales de la Universidad de estado de Washington (WSU) y en cumplimiento de protocolos de animales aprobado WSU #4702 y #4735.
1. ratones
<ol><li>
Uso estándar C57BL/6J ratones machos adultos u otras cepas de interés. Mantener los animales bajo un ambiente controlado de temperatura y humedad, con acceso ad libitum de agua y alimentos....

<ol>
	<li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract.">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li><li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster.">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li><li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+semenogelin.">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li><li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semenogelin,+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa.">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li><li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer:+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches.">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li><li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction.">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li><li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility,+capillary+tube+test,+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program.">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li><li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo.">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).</li><li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+semen+hyperviscosity:+prevalence,+pathogenesis+and+therapeutic+aspects.">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li><li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses.">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li><li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+vaginal+lavage,+crystal+violet+staining,+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification.">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Fundamentals+of+Breeding+and+Weaning.">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases.">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li><li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid.">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li></ol>

Recogida de semen de úteros de ratón puede proporcionar ventajas sobre el análisis de semen en vitro como la anterior puede ilustrar las interacciones fisiológicas entre el semen y las secreciones del tracto reproductivo femenino. Las técnicas presentadas en este estudio permiten a los investigadores a determinar la calidad del semen así como viabilidad espermática y la motilidad en condiciones fisiológicas ideales. Además, hay varios análisis posteriores que se pueden realizar utilizando el e...

El tracto reproductor femenino se compone de los tractos superiores e inferiores. El tracto reproductivo superior incluye las trompas de Falopio, el útero y el endocervix. El tracto reproductivo inferior incluye el exocérvix y la vagina. En los seres humanos, el eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina, junto al ectocérvix1. En ratones, sin embargo, el semen se barre en el útero dentro de minutos después del acoplamiento2.
Semen contiene gel seminal que se solidifica dentro de segundos de la eyaculación, causando el esperma para ser atrapados e inmovilizados3. Licuefacción libera el esperma inmovilizado cambiando semen de un tipo de gel con una consistencia acuosa. Este proceso es esencial para la motilidad espermática y la reproducción mamífera. Conocimiento de licuefacción del semen se basa sobre todo en vitro estudios donde se convierte en licuado de semen en una placa de cultivo. En los seres humanos, la actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA (peptidasa también conocido como relacionadas con la calicreína 3 o KLK3) es el principal para la licuefacción a través hidrólisis de semenogelins (gelificante proteínas presentes en el semen)4 ,5,6. Degradación de semenogelins libera el esperma del coágulo seminal, aumento de la movilidad del esperma. Liberado el nado de espermatozoides hacia la trompa de Falopio para fertilizar el huevo. Licuefacción (o viscosidad del semen) las pruebas son una de las proyecciones iniciales estándar para el análisis de semen en las clínicas de fertilidad para evaluar la fertilidad masculina7.
Un artículo recientemente publicado muestra que se pueden usar análisis de fluido seminal de la hembra del ratón tracto reproductivo postnupcial para ilustrar una deficiencia en licuefacción que posteriormente puede causar fertilidad defectos8. Licuefacción defectuoso como semen hiperviscosidad contribuye a 11.8 32.3% de los casos estériles en hombres9, sugiriendo que la licuefacción normal es indispensable para la reproducción de mamífero. Sin embargo, estudios y tratamiento de los defectos de licuefacción se han centrado exclusivamente en el hombre7. No se ha explorado la posibilidad de que el tracto reproductor femenino desempeña un papel en la licuefacción del semen. Por lo tanto, los métodos de colección de semen y medir el tiempo de licuefacción proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción puede ser una de las causas de la infertilidad en el organismo modelo de interés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="571">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Toothpick</td>
			<td style="width:71px;">Diamond</td>
			<td style="width:119px;">750-Flat</td>
			<td style="width:167px;">Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5045</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">25-&#956;L glass capillary tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53432-761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15 media</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415064</td>
			<td style="width:167px;">Supplement with 1% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:71px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">2-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Digital dry block heater</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259-052</td>
			<td style="width:167px;">For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">LSE 6765</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">35-mm culture dish</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10861-656</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">15-mL polypropylene centrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10025-686</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Precision</td>
			<td style="width:119px;">TSGP05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Heated stage stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">MZ10F</td>
			<td style="width:167px;">To keep the tissue warm prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMi8</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Camera</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMC2900</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Coverslip</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393-059</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Bleach</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute in dH2O to 10% concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice

En ratones, el eyaculado se deposita en el útero. Después de la eyaculación, el semen cambia de consistencia de gel-como acuosa, un proceso llamado licuefacción. En este estudio, se muestra cómo recoger el post eyaculado en el aparato reproductor femenino en un modelo murino. Ratones hembra en primer lugar, adulto en la etapa de estro se alojaron en la jaula del macho durante la noche. A la mañana siguiente, la cópula fue confirmada por la presencia de copula tapón en la abertura vaginal. Ratones hembra con enchufes copulador fueron sacrificados, y cada tracto reproductivo fue recogido como un todo (vagina, útero, oviductos, ovarios), asegurando un sistema cerrado para contener el semen. El tracto reproductivo fue colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y la vagina fue cortada para liberar el semen en el tubo. Para asegurar el volumen de semen máximo para el análisis, pinzas sin dientes se utilizan para exprimir los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal expulsando el semen restante. El tracto reproductivo entero luego fue descartado. El tubo que contiene el semen brevemente fue hecho girar hacia abajo. Una pipeta capilar de 25 μL se colocó en el tubo en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Se registró la cantidad de tiempo usada para llenar el tubo capilar hasta la 25 μL. Semen de un criador macho probado generalmente toma aproximadamente 60-180 s para llenar un tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de recogida de semen también puede ser utilizada en otras aplicaciones posteriores como el análisis de la proyección de imagen y de la motilidad de esperma.

Semen se recolectó de CTRL y KO hembras aproximadamente 8 h después de aparearse con los machos fértiles de CTRL. Licuefacción (o viscosidad del semen) se cuantifica por el tiempo necesario para llenar el tubo capilar de 25 μL de semen. Asumió el esperma recogido de úteros CTRL 2.06 min ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) para llenar el tubo capilar (figura 1). Sin embargo, el esperma recogido de úteros KO tomó más de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) de tiempo expe...

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Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

Licuefacción del semen es necesario para liberarse del gel seminal de los espermatozoides. Este estudio proporciona los procedimientos para la recogida de semen del coito posterior al tracto reproductor femenino y medir el tiempo de licuefacción del semen.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Ortotópico trasplante ovárico procedimientos para investigar la influencia de la vida y salud de la senescencia ovárica en ratones hembra

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Tratamiento combinacional de tricostatina A y la vitamina C mejora la eficiencia de la clonación de ratones por transferencia Nuclear de células somáticas

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

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Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte

Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) may be used to rescue endangered species, but two distinct populations of mitochondrial DNA (mtDNA) ...