Name: studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature at JoVE.com

המחברים רוצה להודות Katrin בנביץ, מרלן האוזנר עבור גידול דג זברה וסיוע טכני. המחברים להכיר את התמיכה של הליבה מתקן לחיות תא הדמיה מנהיים במרכז וההתערבות, טכנולוגיה רפואית מנהיים (DFG מוסד 91027/9-1). מחקר זה נתמך על ידי פתוח (הבינלאומי למחקר הדרכה קבוצתית 1874/1 "DIAMICOM", פרויקט SP5 ו- SP9; SFB1118 מרכז מחקר שיתופי, פרויקט B1 ופרויקט מחקר מרכז שיתופי SFB/TR23 Z5).

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global report on diabetes. , 88 (2016).</li><li>Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+nephropathy+-+complications+and+treatment.">Diabetic nephropathy - complications and treatment.</a> Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).</li><li>Yau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+and+major+risk+factors+of+diabetic+retinopathy.">Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).</li><li>Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy.">Diabetic retinopathy.</a> The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).</li><li>Raymond, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+prevalence+of+retinopathy+in+diabetic+patients+of+South+Asian+ethnicity+compared+with+white+Europeans+in+the+community:+a+cross-sectional+study.">Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study.</a> Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).</li><li>Heng, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathogenesis,+clinical+grading,+management+and+future+developments.">Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments.</a> Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).</li><li>Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).</li><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Sharma, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELMO1+protects+renal+structure+and+ultrafiltration+in+kidney+development+and+under+diabetic+conditions.">ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions.</a> Sci Rep. 6, 37172 (2016).</li><li>Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+and+simvastatin+reduce+cholesterol+levels+in+zebrafish+larvae+fed+a+high-cholesterol+diet.">Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet.</a> Cholesterol. , 564705 (2012).</li><li>Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+zebrafish+as+a+model+for+glucose+metabolism:+expression+of+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+as+a+marker+for+exposure+to+anti-diabetic+compounds.">Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds.</a> J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).</li><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).</li><li>Kasprick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+adult+zebrafish+extraocular+muscles.">Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles.</a> PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+system+of+zebrafish+and+its+use+to+model+human+ocular+diseases.">The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Bell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+of+adult+zebrafish:+in+vivo+imaging+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+function+of+midkine+in+the+vertebrate+retina.">The expression and function of midkine in the vertebrate retina.</a> Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).</li><li>Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+retinal+angiogenesis+in+zebrafish+as+a+model+to+study+retinopathy.">Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy.</a> PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).</li><li>Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+for+understanding+diabetic+complications.">Zebrafish: a model for understanding diabetic complications.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).</li><li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycaemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy.">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).</li><li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+(Danio+rerio)+leads+to+morphological+changes+in+the+retina.">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).</li><li>Jorgens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tissue+glucose+alters+intersomitic+blood+vessels+in+zebrafish+via+methylglyoxal+targeting+the+VEGF+receptor+signaling+cascade.">High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade.</a> Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).</li><li>Lai, A. K., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+diabetic+retinopathy:+summary+and+comparison.">Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison.</a> J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מודלים של היפוקסיה-induced neoangiogenesis ברשתית הצג מספר רב יותר של נקודות הסתעפות, האנגיוגנזה נבטים, השטח הכולל כלי דם וירידה מרחק intercapillary דג זברה20. ממצאים אלה תומכים לרעיון כי דג זברה היא חשופה סיבוכים microvascular סוכרתית21, הממצאים העיקריים של רטינופתיה סוכרתית מאוחר יותר לכלול בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis, חריפה המקושר לביטוי VEGF. היפרגליקמיה-induced שינויים ברשתית דג זברה להוביל עובי מוגברת של כלי אבל לשמור על הכולל תכנים22. לסירוגין טבילה גלוקוז פתרונות עבור 30 ימים גם מקטין את העובי של IPL ו להיכנס23. השפעת ישירה של מטבוליטים גלוקוז בדג זברה כמו מטבולית חסידי vasculopathy גם כבר הוצגה. Hyperbranching כלי דם נוספות נצפתה ב להערכת תא המטען של דג זברה העוברים לאחר דגירה עם methylglyoxal24. כרגע, יש אין במודל חיה אשר מספקת את כל הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מוקדם נמצאים לעתים קרובות, אך סדר רטינופתיה סוכרתית proliferative חסרה25. דג זברה נופל גם הגדרה זו, כאמור רק בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis או היפרגליקמיה-induced שינויים עד עכשיו. הממצאים הנוכחיים תתמכו כי דג זברה רגישים לשינויים בכלי הדם בתיווך היפרגליקמיה, כמו במודל חיה פוטנציאלי עלול להציג התקדמות כדי proliferative רטינופתיה סוכרתית. בהתאם כוח חשיפה האפקט בתיווך היפרגליקמיה, שהמודל הניסויי נכון יכול להוביל איסכמיה באזורים מסוימים של הרשתית דג זברה ולקדם neoangiogenesis כמו הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית המקדימות. עם זאת, כמו דג זברה הוא שחקן חדש וזהובה בתחום מידול פתולוגיות microvascular לטווח ארוך, סוכרת הקרובה במודלים דג זברה לספק מידע נוסף, להבהיר את החשיבות שלו בכל הנוגע דגמים אחרים, שלהם פתולוגיות. לדוגמה, בצלב של דג זברה tg(gata1a:DsRed) עם אריתרוציטים מתויג אדום לתוך הקו tg(fli:EGFP) יכול לשמש בו זמנית להמחיש לפרקים תוך-עיני פוטנציאלי בעתיד מודלים דג זברה מציג microaneurysms כמו מנבא של סדר PDR.
מאז להערכת ברשתית מתקדמת לתוך רצף של אולמות, הערכת המרחק intervascular, מספר נקודות הסתעפות ואת שטח כלי הדם קשורים המרחק מ העורק המרכזי. כדי למנוע הטיה בפרמטרים של כלי הדם המוערך, נדרשת נקודת אוריינטציה. הוועד האולימפי הוא מבנה כזה והוא רלוונטי מאז תחומי פעילות כלי דם משקרת בסמיכות המרחבית ישירה. להערכת עקבית, הסריקה הרשתית צריך להיות מחולק מספר מקטעים תמונה מלבנית עם מרחק עקבי כדי הוועד האולימפי. הרשתית כולו צריך להיות מנותח ומופץ תמונות מספרית באופן סימטרי. הרשתית דג זברה מציגה אזורים עם צפיפות נימי גבוה ונמוך, שוויונית של התמונה מקטעים יכול להוביל הטיה נוספים.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
איור 12: מצגת דוגמה של פרמטרים וסקולרית readout להדמיות להערכת ברשתית. מדידה של המרחק intervascular (חץ כפול אדום) ליד הראייה הפנימית להקיף בעיגול (IOC) (א). שלוש נקודות הסתעפות (עיגולים אדומים) ליד של הוועד האולימפי הבינלאומי (B). ויזואליזציה של דג זברה להערכת ברשתית עם שטח מוגדלת (התיבה האדומה) מציג כלי נבטי (C). קוטר הכלי מודדים מרחק מסויים (חץ כפול הלבן) של עורק מרכזי (צלב לבן) (D). צפיפות כלי הוא האחוז של אזור ברשתית שנכבשו על ידי בשכבת-על כלי (קווים אדומים אלכסוני) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי למדוד את המרחק intervascular, אחד צריך מוגדר מרחק מסויים הוועד האולימפי כסטנדרט (איור 12A, חץ כפול הלבן), צייר קו אופקי דמיוני (איור 12A, קו לבן אופקי) מקביל הוועד האולימפי. המרחק בין כלי בקו זה הוסיף את, arithmetically בממוצע שווה למרחק intervascular. נקודות הסתעפות נספרים בתוך כל תמונה בכל פעם קיבול מפצלת ולהמשיך לומן כלי דם אחד או יותר מתוך נקודת המוצא. זה כולל גם חיבורים אופקי בין נימים. חשוב להישאר עקבי עם ניתוח ולהחליט אילו נקודות הסתעפות לספור ולשמור על כללים אלה לאורך כל הניסוי כולו כדי להפחית וריאציה מיותרת. לבלוב וסקולרית, כפי שמתואר ב- 12C איור, הינו פרמטר נוסף שאפשר לסמוך על כל תמונה כדי להעריך את ההשפעה על להערכת ברשתית. נבטים אנגיוגנזה לא בצע כמו ארקייד הירושה בין עורק מרכזי, הוועד האולימפי הבינלאומי ונוחות ליד החלקים החיצוניים של הרשתית. כדי להעריך קטרים כלי מסוים, נקודת כיוון שתמיד צריך ממנו מרחק קבוע מסמן את המדידה ספוט. המקור של העורק המרכזי בתוך הרשתית מספק כזה הדרכה עבור כלי גזע הראשי (איור 12D, לבן צלב). האזור שנכבש על ידי כלי (איור 12E, קווים אדומים אלכסוני) כאחוז של האזור ברשתית כל צפיפות כלי הדם, בעקיפין המתייחס לאזור avascular.
צריך להיות מורכבת קונאפוקלית סריקה מלאה של דוגמא אחת מהתמונות גבוהה לפרטים מרובים כדי לאפשר ויזואליזציה של hypersprouting נימי קטן. כדי למטב את זמן ומשאבים על שלב זה, יש להשתמש בהליך tilling אוטומטי עם עומק הסריקה כללי עבור כל אריח. הרכבה לא אחידה של הרשתית ניתן להגדיל באופן משמעותי את הזמן כדי לסרוק את להערכת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בגישה אופטימלי אחד רוצה לסרוק רק את שכבת כלי הדם (איור 13 ב', לבנה), אבל חלקית הכללת שזכתה יש לעיתים קרובות צורך.עוזבים את אורך עודף של עצב הראייה אחרי חיתוך, כמו גם את הקיצוצים כדי להשיג את שטוח-הר נמוך מדי, יכול להוביל הרכבה לא אחידה.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
איור 13: השוואה של הוא מכתים autofluorescence ברשתית דג זברה בוגרת. להערכת ברשתית בפוקוס מעל שזכתה (א). להערכת ברשתית (לבנה) מראה ירוק אות EGFP, רשתית שכבות המציגות ביריד חזקה autofluorescence (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
הכנת להערכת רשתית דג זברה תקין צריך הכשרה מוקדמת, גודל מדגם קטן עם dissectors מיומנת ותוצאות הכנה חריפה משתנות הם מגבלה הראשי של הטכניקה. בזמן הכנת tg(fli:EGFP) דג זברה העיניים מעניק תובנה מדינת להערכת מהר, הטכניקה עדיין משתמשת בסביבות 20 דקות של זמן עבודה לכל הרשתית עבור חוקר מנוסה. כל השלבים האלה הכנה עבור להערכת ברשתית חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ ויבתר, dissectors הצורך להישאר מרוכז כל הזמן כמו צעד זהיר פוטנציאלי יכול לגרום לכלי שבירה. בניתוח צריך להתאמן באופן קבוע כמו העדרות ממושכת מן הכנה מפחיתה את הסבירות של בניתוח שמירה על תקינות כלי השיט.
יתר על כן, הבדיקה נוספים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא עדיין מוגבלת, שכן רק מספר קטן של נוגדנים על רקמת מכרסמים ואנושי עובדים עם דג זברה. ניסויים מעוניין IHC מומלץ לחפש נוגדנים ספציפיים דג זברה, במיוחד כאשר עובדים עם מטרות חדשות. לחילופין, מומלץ להשתמש קווי כתב דג זברה נוספים אשר שימושיים ללמוד תאי מעבר להערכת בעיניים. אסטרטגיה זו, אולם, הוא זמן רב, כמו זה לוקח כמה חודשים כדי ליצור קווים דג זברה בוגרת הנושאות כתבים הטרנסגניים מרובים.
בכל זאת, דג זברה מהווה מערך ייחודי של יתרונות. הם קטנים יחסית, לשחזר בקלות. הם יכולים לגדול בשלבים למבוגרים במהירות, העוברים שלהם אופטימלי והתרופות הקרנה. השדה ברצון גדל והופך להיות ספרות יותר נגיש. עם היכולת ליצור הסתרה ג'ין-מהירות מהירה, שפע של transgene קרינה פלואורסצנטית כתב שורות, הבחירה עבור דג זברה רק מרוסנת על ידי שאלת המחקר שבחרת.

סוכרת היא מחלה מטבולית שהוגדרו על-ידי היפרגליקמיה הנובע הפרשת האינסולין לקוי או לקוי רקמת תגובה לאינסולין המופרש. העולמי מעריך כי מבוגרים 422 מיליון היו לחיות עם סוכרת 20141 , השכיחות של סוכרת ברחבי העולם צפוי לגדול ל 8-10% מהאוכלוסייה עד מלאך2, הפיכת סוכרת אחד של השדות המחקר מפתח במשך עשרות שנים. לחיות עם סוכר דם גבוה כרוני מוביל microvascular סיבוכים ארוכי טווח, כולל רטינופתיה סוכרתית, כלייתית פולינוירופתיה. הניהול ואת מניעת סיבוכים אלה קשים; אכן, סוכרת הופך להיות הגורם השכיח ביותר של קצה הבמה מחלת כליות (ESRD), מה שמוביל דיאליזה2, וסוכרת היא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה3.
הסיבות הראשונית של נזק microvascular בעין סוכרתית הן היפרגליקמיה כרונית, שינויים מטבוליים, כמו גם גורמי סיכון מסוימים (למשל, יתר לחץ דם, dyslipidemia), המוביל אל תפקוד אנדותל כלי הדם, pericyte הנשירה, ו רגרסיה נימי שתוצאתו שרוולים כלי הדם acellular. איסכמיה ברשתית וכתוצאה מכך הוא הגורם כורוידאלית, חדירות כלי דם מוגברת קידום התפתחות proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR)4. רטינופתיה סוכרתית זוהה בדרך כלל 37% של חולי סוכרת, בעוד סכנת הראייה רטינופתיה סוכרתית היה לקביעה 12% ממוסך עוקבה אירופאי לבן המחקר UKADS5. הטיפול הנוכחי יכולים רק למנוע סיבוכים, והוא לא מסוגל לשחזר במלואה את הנזק כבר המושרה. Photocoagulation Panretinal, בנוסף הבקרה הגליקמית, הוא הטיפול הסטנדרטי עבור proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR) אבל משפיע גם הרקמה הבריאה סמוכים. אנטי-VEGF התערבויות מראים תוצאות מבטיחות כחלופות לייזר טיפול6,7, אבל בסופו של דבר, טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות חדשות יש צורך לנהל את המספר הגדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה.
הדגמים מבוססת מחקר בבעלי חיים של רטינופתיה סוכרתית אופטימיים כל היבט של פתופסיולוגיה אנושי. ניצול של המין הנכון כדי לטפל הדרישות הספציפיות של שאלת המחקר המדעי הוא אחד החלקים הכי משמעותי של ההתקנה ניסיוני. העובר דג זברה (רזבורה rerio) כבר נעשה שימוש נרחב מחקר התפתחותי ומספק את הרקע המעשי אופטימלית של תמונות ציפורים או נוקאאוט גנים ספציפיים באמצעות morpholinos או טכניקה CRISPR/Cas98. ניתן להשתמש בשיטות אלה בקלות דג זברה לחקור גנים, אשר זוהו על ידי מחקרים האגודה ברמת הגנום בקנה מידה גדול (GWAS), יצירת תובנות מנגנון מסוים של התקדמות המחלה, הרגישות9. בזמן קצר דורי כמויות גדולות של הצאצאים, קל ו טיפול בעלות נמוכה, גוברת התמיכה assay הגדילו את הרלוונטיות של המודל דג זברה, במיוחד לאור הפוטנציאל הגדול עבור מידול המחלה המטבולית. שימור מנגנונים ביולוגיים דג זברה הוכח כבסיס לפיתוח טיפול תרופתי. לדוגמה, antidiabetic התרופה מטפורמין ו סימבסטטין להורדת כולסטרול הוכחו "לטפל" תנאים במודלים של מחנה/דקסמתזון-induced גבוהה PEPCK כולסטרול וביטוי היפרכולסטרולמיה דיאטה-induced10 , 11 , 12. זו תובנה לקידום מקיף שנשמרת מנגנונים מטבוליים נוספים נתמך על ידי המספר הגדל והולך של מודלים סוכרת דג זברה, באמצעות ניסויים כגון: לסירוגין הדגירה בפתרונות גלוקוז, Streptozotocin-induced אבלציה של תאי הבטא, בתיווך nitroreductase תאי בטא אבלציה באמצעות של מטרונידזול prodrug, סוכרת monogenic מתווכת באמצעות נוקאאוט גנטי pdx1 או נוקאאוט, כמו גם מודלים של עמידות לאינסולין מוגבר בשרירי השלד 12. אלה כבר הקים פרוטוקולים, הפרטים שהוזכרו לעיל של המין, ומדגימים היכולת לטפל ביעילות את הגנום במספר רב של דוגמאות כל היתרונות דג זברה לימוד המנגנון נהיגה מחלות מורכבות, כמו גם היכולת עבור התערבויות תרופתי מסך.
הבנה כללית של האנטומיה עין דג זברה בסיסי (איור 1) יש צורך בניתוח על מנת לנצל את דג זברה כמודל עבור angiopathy ברשתית. העין דג זברה יש שישה extraocular השרירים rectus ארבע, שני השרירים המלוכסן להוסיף בצד החיצוני של כדור הארץ-sclera13. הקרנית רקמה שקופה מכסה העדשה, ממשיך ישירות לתוך בסקלרה, המהווה את המעטפת החיצונית של העין. Sclera שאינם שקופים, יש משטח המשקף האור באופן חלקי, הוא פיגמנט חזק. העדשה עצמה היא יותר בצורת כדור מאשר המקבילה האנושית. הרשתית מורכב משלוש שכבות הגרעין של תאים עצביים בזמן מתן חמצן להערכת ברשתית קשורה קשר הדוק השכבה תא גנגליון הפנימית אבל לא בצורת רשת subretinal. כלי חיבור, לעומת זאת, לשקר sclera ועד רשתית, משויכים ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE). רשת הנימים זו מספקת חמצן החלקים החיצוניים של הרשתית14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
איור 1: תיאור סכמטי של העין דג זברה בוגרת. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
פשוט ויזואליזציה של להערכת ברשתית יכולה להיות מושגת על ידי ניצול של קו דג זברה מהונדס tg(fli:EGFP)15. חלבון פלואורסצנטי ירוק, הביע תחת השליטה promotor כאשר שגיא בתאי האנדותל של להערכת הוא הבסיס עבור הפריט החזותי באמצעות מיקרוסקופ בשלבים מאוחר יותר סורק לייזר. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. מודל הטרנסגניים זה מספק readout וסקולרית מהר ללא כל יישום של תיוג קרישה תוך-כלית או אימונוהיסטוכימיה כולה-הר. כדי לנתח רטינופתיה סוכרתית, דג זברה, תרגיל הכנה צעד אחר צעד, מתוקננת אמור להיות בשימוש בכל בניתוח.פרוטוקול הכנה הבאים מספק קבוצות מחקר אחרים את האפשרות בקלות להעריך שינויים בכלי הדם בכלי חשוף של העין דג זברה בוגרת ולספק הדרכה להקים ברוטינת לנתיחה ממוטב עבור הרשתית דג זברה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6771.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*6H20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2370.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>BD 300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Scissor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>H872.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 22mmx22mm</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>103512222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>FEA111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-Illumination</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope MZ10 F</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope SP5 DS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope M80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>see Reference 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hematoxylin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>0088663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% eosin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99,9% ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,501,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Emsure</td>
			<td>606-001-00-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM 2165</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature

רטינופתיה סוכרתית הוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה. השכיחות העולה של סוכרת ברחבי העולם יגרום למניעת סיבוכים microvascular סוכרתית אחד משדות המחקר מפתח של העשורים הבאים. טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות טיפוליות חדישות נדרשים לנהל את מספר גדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה. דג זברה היא מודל חיה הוקמה לשאלות מחקר התפתחותי עם הגדלת רלוונטיות עבור מידול תהליכי מחלה מטבולית multifactorial. היתרונות של המין מאפשרים ויזואליזציה אופטימלית וסמים תפוקה גבוהה הקרנת גישות, בשילוב עם יכולת חזקה לדפוק את הגנים של עניין. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה לנזק neoangiogenesis או כלי קיבול. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. ויזואליזציה של כלי חשוף ואז מבוצעת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הכתב EGFP ירוק לידי ביטוי להערכת ברשתית למבוגרים. הטיפול הנכון של הרקמה יוביל לתוצאות טובות יותר ופחות שבירה כלי פנימי כדי להבטיח את הפריט החזותי של מבנה כלי הדם שההודעה. יכול להיות מנוצל השיטה במודלים דג זברה של הרשתית vasculopathy קשורה לשינויים כלי האדריכלות, כמו גם neoangiogenesis.

כאן נדגים שתי דוגמאות להערכת רשתית בדג זברה tg(fli:EGFP) למבוגרים מורפולוגי טיפוסי: פעם דמיינו עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 9 א) ופעם אחת עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (איור 9B). מבנה הרשתית חשף מציג תבנית מאורגן. Autofluorescence חזק נתפסת ברשתית דג זברה, כאשר visualized עם מיקרוסקופ זריחה. לפיכך, ויזואליזציה של רק את שכבת כלי הדם באמצעות סריקת קונאפוקלית מומלץ להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע ולהגדיל את הניגודיות. עבור רכישת התמונות מהר יותר או מצבים נתונים איכותי איפה מספיק, הוא המיקרוסקופ פלורסצנטיות חלופה אטרקטיבית.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
איור 9: תמונות נציג של tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית. שתי דוגמאות להערכת ברשתית מורפולוגי טיפוסי מוצגים: העורק המרכזי מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7, אשר הסניף ואז לתוך רצף של אולמות. כל כלי נוסף לנקז לתוך הווריד במבניו (CV) מגביל את החלק החיצוני של כל עלה כותרת. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 2.5 x הגדלה (א). ויזואליזציה של להערכת הרשתית על ידי לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ דרך בשילוב 5 x 5 תמונה בודדת אריח סריקה (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
העורק חודר הרשתית בראש עצב הראייה, רוב דגימות, מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7 (איור 10A). כלי ראשי אז הסניף לתוך רצף של אולמות ולהתחבר למעגל הפנימי אופטיים (IOC), המכונה גם את הווריד במבניו (CV), המקיפות את הדיסק אופטיים בפריפריה של הרשתית הנטען שטוח (ראה איור 10 ב'). הוועד האולימפי הוא הכלי ורידים זה מנקז דם עורקי על השפה הפנימית של כדור הארץ עינית (bulbus החוגי). להערכת רשתית דג זברה מציגה גם תחומי פעילות כלי הדם גבוהה עם הסתעפות של נימים, האנגיוגנזה הלבלוב (איור 10C). זו פעילות כלי הדם בעיקר ממוקם בסמיכות ליד הוועד האולימפי. חשוב לשים לב כי אותה העין יכולים להדגים שתי פעילויות גבוה ונמוך כלי הדם באזורים שונים של הרשתית (השווה איור 10 ב' ואת דמות 10C). באופן כללי, להערכת רשתית של דג זברה מראה יותר מקום avascular נימים פחות בין הענפים העיקריים אם בהשוואה, לדוגמה, הרשתית של עכברים17. צריך להיות מנותח בשתי העיניים של כל מדגם כי להערכת עשויים להשתנות בין פיקוח יחיד יכול להוביל הטיה.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
איור 10: יוגדל תחומי tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית ויזואליזציה. העורק הסתעפות לתוך כלי הראשי (א). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם נמוך חיבור למעגל אופטיים הפנימי (IOC) בחלק התחתון של התמונה (B). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם גבוהה מתחבר הוועד האולימפי (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ארכיטקטורת והתפאורה מאוד של שכבות עצביים כבר נמצא דג זברה מ כ 72 h פוסט הפריה (hpf)18ואילך. הרשתית דג זברה בוגרת מציג את השכבות הבאות מבפנים החוצה (איור 11): שכבת תאים גנגליון (שזכתה), השכבה הפנימית plexiform (IPL), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), השכבה החיצונית plexiform (OPL), השכבה החיצונית גרעינית (גרת), שכבה קולט אור (PL), רשתית פיגמנט האפיתל (RPE). הערכת פרמטרים כלי הדם של הרשתית להערכת ויזואליזציה מוצג באיור12. להערכת ברשתית הפנימי ממוקם על הרובד תא גנגליון (שזכתה) (איור 13 ב', לבנה) בעת חיבור נימים יהיה משוייך ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
איור 11: הוא מכתים של העין דג זברה בוגרת. סקירה כללית של חתך הרוחב של העין כל לאחר הסרת העדשה (א). שכבות הרשתית של דג זברה למבוגרים העין19 (B). חיווי (חץ שחור) נקודת השבירה טבעי ב- PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature at JoVE.com

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

משלוח סמים האוסמוטי לhindlimbs איסכמי וטפטוף של כלי דם עם Microfil למייקרו-טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

פגיעה כירורגית ללבלב העכבר באמצעות קשירת של צינור הלבלב כמודל להאנדוקרינית ואקסוקרינית תכנות מחדש והפצה

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...