Name: studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature at JoVE.com

लेखक zebrafish पशुपालन और तकनीकी सहायता के लिए Katrin Bennewitz और मार्लिन Hausner का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक जैव चिकित्सा और चिकित्सा प्रौद्योगिकी मैनहेम (DFG 91027/9-1) के लिए केंद्र में कोर सुविधा लाइव सेल इमेजिंग मैनहेम के समर्थन को स्वीकार करते हैं । इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft (अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1874/1 "DIAMICOM", परियोजना SP5 और SP9 द्वारा समर्थित किया गया था; सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB1118, परियोजना B1 और सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB/TR23 परियोजना Z5) ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हाइपोक्सिया-प्रेरित रेटिना neoangiogenesis के मॉडल अंक बंटी की संख्या में वृद्धि दिखाने के लिए, angiogenic अंकुरित, कुल संवहनी क्षेत्र और zebrafish में कम केशिका दूरी20. इन निष्कर्षों zebrafish मधुमेह microvascular जटिलताओं के लिए अतिसंवेदनशील है कि इस विचार का समर्थन21बाद में मधुमेह रेटिनोपैथी के प्रमुख निष्कर्षों के रूप में हाइपोक्सिया मध्यस्थता neoangiogenesis, जो दृढ़ता से वीईजीएफ़ अभिव्यक्ति के लिए जुड़ा हुआ है शामिल हैं. zebrafish रेटिना नेतृत्व में Hyperglycemia-प्रेरित परिवर्तन जहाजों की मोटाई में वृद्धि हुई है, लेकिन समग्र पैटर्न को बनाए रखने के लिए22. 30 दिनों तक ग्लूकोज सॉल्यूशन में अदल-बदल कर विसर्जन करने से आईपीएल की मोटाई भी घट जाती है और23आईएनएल । vasculopathy के चयापचय समर्थकों के रूप में zebrafish में ग्लूकोज चयापचयों का सीधा प्रभाव भी पहले से ही दिखाया गया था । अतिरिक्त संवहनी hyperbranching methylglyoxal24के साथ मशीन के बाद zebrafish भ्रूण के ट्रंक vasculature में मनाया गया । फिलहाल, वहां कोई जानवर मॉडल है जो मधुमेह रेटिनोपैथी के सभी प्रमुख मानदंडों प्रदान करता है । जल्दी परिवर्तन अक्सर पाए जाते हैं, लेकिन प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी करने के लिए प्रगति25लापता है । zebrafish भी इस परिभाषा में गिर जाता है, के रूप में हम केवल या तो हाइपोक्सिया-मध्यस्थता neoangiogenesis या hyperglycemia-प्रेरित परिवर्तन अब तक देखा है । वर्तमान निष्कर्षों zebrafish hyperglycemia-मध्यस्थता संवहनी परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील है कि विचार का समर्थन और एक पशु मॉडल संभावित प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी के लिए एक प्रगति दिखा सकता है के रूप में. शक्ति और hyperglycemia-मध्यस्थता प्रभाव के लिए जोखिम पर निर्भर करता है, सही प्रयोगात्मक मॉडल zebrafish रेटिना के कुछ क्षेत्रों में ischemia के लिए नेतृत्व और प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी के प्रमुख मानदंडों के रूप में neoangiogenesis को बढ़ावा दे सकता है । हालांकि, के रूप में zebrafish लंबी अवधि के microvascular विकृतियों मॉडलिंग के क्षेत्र में एक तुलनात्मक नए खिलाड़ी है, zebrafish में आगामी मधुमेह मॉडल और अधिक जानकारी प्रदान करने और अन्य मॉडलों और उनके विकृतियों के संबंध में इसके महत्व को स्पष्ट करेंगे । उदाहरण के लिए, टीजी (gata1a: DsRed) के एक में-पार zebrafish में लाल लेबल एरिथ्रोसाइट्स के साथ टीजी (fli: EGFP) लाइन के लिए एक साथ एक कारक के रूप में intraocular दिखा भविष्य zebrafish मॉडल में संभावित microaneurysms रक्तस्राव कल्पना किया जा सकता है प्रगती ते पीडीआर.
रेटिना vasculature आर्केड की एक उत्तराधिकार में प्रगति के बाद से, संवहनी दूरी का मूल्यांकन, अंक बंटी की संख्या और कुल संवहनी क्षेत्र केंद्रीय ऑप्टिक धमनी से दूरी से संबंधित हैं. मूल्यांकन संवहनी मापदंडों में पूर्वाग्रह से बचने के लिए, अभिविंयास के एक बिंदु की आवश्यकता है । आईओसी इस तरह के एक संरचना है और संवहनी गतिविधि के क्षेत्रों के बाद से अत्यधिक प्रासंगिक है प्रत्यक्ष स्थानिक निकटता में झूठ । लगातार आकलन के लिए, रेटिना स्कैन आईओसी के लिए एक सुसंगत दूरी के साथ कई आयताकार छवि वर्गों में विभाजित किया जाना चाहिए । पूरे रेटिना का विश्लेषण किया जाना चाहिए और चित्र संख्यात्मक रूप से संतुलित वितरित. zebrafish रेटिना उच्च और कम केशिका घनत्व के साथ क्षेत्रों को दर्शाता है और छवि वर्गों के एक असमान वितरण अतिरिक्त पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
चित्र 12: रेटिना vasculature विज़ुअलाइज़ेशन के readout के रूप में संवहनी मापदंडों का उदाहरण प्रस्तुति. भीतरी ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) के पास संवहनी दूरी (लाल डबल तीर) का मापन (A)। आईओसी (बी)के पास तीन ब्रांचिंग पॉइंट (लाल घेरे) । एक अंकुरित पोत (सी)दिखा एक बढ़े हुए क्षेत्र (लाल बॉक्स) के साथ zebrafish रेटिना vasculature का दृश्य. पोत व्यास एक निश्चित दूरी पर मापा (सफेद डबल तीर) केंद्रीय धमनी (सफेद पार) से (घ)। पोत घनत्व रेटिना जहाजों (तिरछे लाल रेखा) (ई)ओवरले द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र का प्रतिशत है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
संवहनी दूरी को मापने के लिए, एक मानक (चित्रा 12A, सफेद दोहरे तीर) के रूप में आईओसी के लिए एक निश्चित दूरी तय करने की जरूरत है और एक काल्पनिक क्षैतिज रेखा (चित्रा 12A, क्षैतिज सफेद लाइन) आईओसी के समानांतर आकर्षित । इस लाइन पर जहाजों के बीच की दूरी को जोड़ा गया है और गणित औसत संवहनी दूरी बराबर होती है । शाखा अंक प्रत्येक छवि के अंदर गिना जाता है जब भी एक पोत विभाजन और एक से अधिक संवहनी लुमेन मूल के बिंदु से जारी है । इसमें केशिकाओं के बीच क्षैतिज कनेक्शन भी शामिल है । यह विश्लेषण के साथ संगत रहने के लिए महत्वपूर्ण है और तय है जो शाखाओं में अंक की गणना करने के लिए और पूरे प्रयोग भर में इन नियमों को रखने के लिए आवश्यक भिंनता को कम । संवहनी अंकुरण, के रूप में चित्रा 12Cमें प्रदर्शन किया, एक और पैरामीटर है कि प्रत्येक छवि में गिना जा सकता है रेटिना vasculature पर प्रभाव का मूल्यांकन है । Angiogenic स्प्राउट्स केंद्रीय धमनी और आईओसी के बीच की आर्केड की तरह उत्तराधिकार का पालन नहीं करते और रेटिना के बाहरी हिस्सों के पास ध्यान केंद्रित करते हैं । कुछ पोत व्यास का आकलन करने के लिए, अभिविंयास के एक बिंदु हमेशा की जरूरत है, जहां से एक निर्धारित दूरी माप स्थान के निशान । रेटिना के अंदर केंद्रीय धमनी की उत्पत्ति मुख्य स्टेम जहाजों (चित्रा 12D, व्हाइट क्रॉस) के लिए इस तरह के मार्गदर्शन प्रदान करता है । पूरे रेटिना क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में जहाजों (चित्रा 12E, तिरछे लाल लाइनों) द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र संवहनी घनत्व है और परोक्ष रूप से avascular क्षेत्र को संबद्ध ।
एक नमूने का एक पूरा फोकल स्कैन एकाधिक उच्च विस्तार चित्रों से बना होना चाहिए छोटे केशिका hypersprouting के दृश्य की अनुमति है । समय और संसाधनों का इस चरण पर खर्च ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, एक स्वचालित प्रक्रिया तक प्रत्येक टाइल के लिए एक सामान्य स्कैन गहराई के साथ उपयोग किया जाना चाहिए । असमान रेटिना के बढ़ते बहुत समय एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ vasculature स्कैन करने के लिए खर्च में वृद्धि कर सकते हैं । एक इष्टतम दृष्टिकोण में केवल संवहनी परत (चित्रा 13B, सफेद बॉक्स) स्कैन करना चाहते हैं, लेकिन GCL के आंशिक शामिल किए जाने अक्सर आवश्यक है ।जनचेतना के बाद ऑप्टिक तंत्रिका की एक अतिरिक्त लंबाई छोड़ने, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कटौती करने के लिए फ्लैट प्राप्त करने के लिए माउंट भी कम हो रहा है, असमान बढ़ते जा सकता है ।
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
चित्र 13: वयस्क zebrafish रेटिना में वह दाग और autofluorescence की तुलना । GCL के ऊपर ध्यान में रेटिना vasculature (A)। रेटिना vasculature (सफेद बॉक्स) हरी दिखा रहा है एक EGFP संकेत और रेटिना परतों का प्रदर्शन मजबूत autofluorescence (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
zebrafish रेटिना vasculature की उचित तैयारी के रूप में पूर्व प्रशिक्षण की जरूरत है, अप्रशिक्षित विक्षेत्र के साथ एक छोटा सा नमूना आकार और दृढ़ता से अलग तैयारी परिणाम तकनीक की एक मुख्य सीमा है । जबकि टीजी की तैयारी (fli: EGFP) zebrafish आंखें vasculature के राज्य में तेजी से अंतर्दृष्टि देता है, तकनीक अभी भी एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए रेटिना प्रति काम समय के 20 मिनट के आसपास का उपयोग करता है । रेटिना vasculature के लिए इन तैयारी चरणों के सभी एक विदारक माइक्रोस्कोप और विच्छेदन के तहत किया जाना चाहिए एक लापरवाह कदम संभावित पोत टूटना प्रेरित कर सकते है के रूप में पूरे समय केंद्रित रहने की जरूरत है । विक्षेत्री नियमित रूप से तैयारी से लंबे समय तक अनुपस्थिति के रूप में अभ्यास करना चाहिए पोत अखंडता को बनाए रखने के एक विक्षेत्र की संभावना कम कर देता है ।
इसके अलावा, immunohistochemistry (आइएचसी) के माध्यम से अतिरिक्त readout अभी भी सीमित है, एंटीबॉडी की एक छोटी संख्या के रूप में मानव और मूषक ऊतक पर मांय zebrafish के साथ काम कर रहे हैं । आइएचसी में रुचि रखने वाले experiments zebrafish-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए खोज करने के लिए सलाह दी जाती है, खासकर जब नए लक्ष्य के साथ काम कर रहे. वैकल्पिक रूप से, यह अतिरिक्त zebrafish रिपोर्टर लाइनों जो आंखों में vasculature से परे कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह रणनीति, तथापि, समय लेने वाली है, क्योंकि यह एक कुछ महीने लगते है वयस्क zebrafish लाइनें जो कई ट्रांसजेनिक पत्रकारों ले उत्पंन करते हैं ।
बहरहाल, zebrafish लाभ की एक अनूठी सरणी बन गया है । वे अपेक्षाकृत छोटे और आसानी से पेश कर रहे हैं । वे वयस्क चरणों के लिए जल्दी से विकसित कर सकते है और उनके भ्रूण दवा स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम हैं । क्षेत्र आसानी से बढ़ रहा है और अधिक साहित्य सुलभ होता जा रहा है । एक तेजी से गति और transgene प्रतिदीप्ति रिपोर्टर लाइनों के एक बहुतायत में जीन नॉकआउट उत्पंन करने की क्षमता के साथ, zebrafish के लिए विकल्प ही चुना अनुसंधान प्रश्न से रोका है ।

मधुमेह एक चयापचय रोग hyperglycemia द्वारा परिभाषित किया जाता है, जो बेकार इंसुलिन स्राव या अपर्याप्त ऊतक प्रतिक्रिया स्रावित इंसुलिन से उत्पन्न होता है । डब्ल्यूएचओ का अनुमान है कि ४२२,०००,००० वयस्कों में २०१४1 मधुमेह के साथ रह रहे थे और दुनिया भर में मधुमेह के प्रसार २०३५2तक जनसंख्या के 8-10% करने के लिए वृद्धि करने के लिए उम्मीद है, मधुमेह में प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों में से एक बनाने अगले दशकों । क्रोनिक उच्च रक्त शर्करा के साथ रहते है दीर्घकालिक microvascular जटिलताओं की ओर जाता है, मधुमेह रेटिनोपैथी, नेफ्रोपैथी सहित, और दर्द । इन जटिलताओं के प्रबंधन और रोकथाम मुश्किल है; दरअसल, मधुमेह अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ESRD), जो डायलिसिस करने के लिए सुराग के सबसे अक्सर कारण होता जा रहा है2, और मधुमेह मध्यम आयु वर्ग के वयस्कों के बीच दृष्टिहीनता का प्रमुख कारण है3.
मधुमेह आंख में microvascular क्षति के प्रारंभिक कारणों क्रोनिक hyperglycemia, चयापचय परिवर्तन, साथ ही कुछ जोखिम कारकों (जैसे, उच्च रक्तचाप, डिसलिपिडेमिया), संवहनी endothelial रोग, pericyte छोड़ने के लिए अग्रणी हैं, और केशिका प्रतिगमन कि acellular संवहनी आस्तीन में परिणाम है । परिणामस्वरूप रेटिना ischemia neovascularization और वृद्धि हुई संवहनी पारगम्यता के विकास को बढ़ावा देने के कारण है प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर)4। मधुमेह रेटिनोपैथी आम तौर पर मधुमेह रोगियों का ३७% में पता चला था, जबकि दृष्टि धमकी मधुमेह रेटिनोपैथी UKADS अध्ययन में दिखलाई सफेद यूरोपीय पलटन के 12% में पता लगाया गया था5. वर्तमान उपचार केवल आगे की जटिलताओं को रोका जा सकता है और पूरी तरह से पहले से ही प्रेरित नुकसान बहाल करने में सक्षम नहीं है । Panretinal फोटोकोगुलेशन, glycemic नियंत्रण के अलावा, प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर) के लिए मानक चिकित्सा है, लेकिन साथ ही आसंन स्वस्थ ऊतक को प्रभावित करता है । विरोधी वीईजीएफ़ हस्तक्षेप लेजर उपचार के लिए विकल्प के रूप में आशाजनक परिणाम दिखाने के6,7, लेकिन अंततः, विशेष, लक्षित चिकित्सा और नई दवाओं के लिए दृष्टि-हानि के जोखिम में रोगियों की बढ़ती संख्या का प्रबंधन करने की जरूरत है ।
डायबिटिक रेटिनोपैथी के स्थापित एनिमल रिसर्च मॉडल्स ह्यूमन pathophysiology के हर पहलू को शेयर नहीं करते । सही प्रजातियों के उपयोग के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान प्रश्न की विशिष्ट आवश्यकताओं का पता प्रयोगात्मक सेटअप का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक है । zebrafish भ्रूण (ढाणियो rerio) पहले से ही व्यापक रूप से विकासात्मक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है और morpholinos या CRISPR/Cas9 तकनीक8के माध्यम से पछाड़ना या पीटकर विशिष्ट जीनों के लिए एक इष्टतम व्यावहारिक पृष्ठभूमि प्रदान करता है । इन तरीकों को आसानी से zebrafish में उपयोग किया जा सकता है जीन है, जो बड़े पैमाने पर जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (GWAS), रोग प्रगति और संवेदनशीलता9के विशेष तंत्र में अंतर्दृष्टि सृजन द्वारा की पहचान की जांच करने के लिए । लघु पीढ़ी के समय, वंश की बड़ी मात्रा में, आसान और कम लागत से निपटने, और बढ़ती परख समर्थन zebrafish मॉडल की प्रासंगिकता बढ़ गई है, विशेष रूप से चयापचय रोग मॉडलिंग के लिए अपनी महान क्षमता दी । zebrafish में जैविक तंत्र का संरक्षण औषधीय चिकित्सा विकास के लिए एक आधार के रूप में दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, मधुमेह दवा मेटफार्मिन और कोलेस्ट्रॉल कम simvastatin "इलाज" के लिए शिविर के मॉडलों में शर्तों दिखाया गया है डेक्समेतएसॉनी-प्रेरित उच्च PEPCK अभिव्यक्ति और उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्रेरित विटिलिगो10 , 11 , 12. व्यापक के संरक्षण में यह आगे अंतर्दृष्टि चयापचय तंत्र आगे zebrafish मधुमेह मॉडल की बढ़ती संख्या द्वारा समर्थित है, जैसे प्रयोगों के माध्यम से: ग्लूकोज समाधान में बारी मशीन, बीटा कोशिकाओं के Streptozotocin-प्रेरित पृथक, nitroreductase-मध्यस्थता बीटा सेल पृथक दवा metronidazole का उपयोग, monogenic जीन pdx1 या नॉकआउट के माध्यम से मध्यस्थता मधुमेह, साथ ही कंकाल की मांसपेशी में वृद्धि हुई इंसुलिन प्रतिरोध के मॉडल 12. ये पहले से ही स्थापित प्रोटोकॉल, प्रजातियों में से ऊपर उल्लेख विशेष, और कुशलता से नमूनों की एक बड़ी संख्या में जीनोम में हेरफेर करने की क्षमता सभी तंत्र का अध्ययन करने के लिए zebrafish के लाभों को प्रदर्शित जटिल रोग प्रक्रियाओं के साथ ही औषधीय उपायों के लिए स्क्रीन करने की क्षमता ड्राइविंग ।
बुनियादी zebrafish नेत्र शरीर रचना विज्ञान के एक सामान्य समझ (चित्रा 1) रेटिना angiopathy के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के क्रम में विरूपण के लिए आवश्यक है. zebrafish नेत्र छह extraocular मांसपेशियों, चार rectus, और दो परोक्ष मांसपेशियों कि श्वेतपटल13पर दुनिया के बाहर पर डालने है । कॉर्निया पारदर्शी लेंस को कवर ऊतक है और श्वेतपटल है, जो आंखों के बाहरी कवच रूपों में सीधे जारी है । श्वेतपटल गैर पारदर्शी है, एक आंशिक रूप से सतह को दर्शाती प्रकाश है, और दृढ़ता से pigmented है । लेंस ही मानव समकक्ष से अधिक गेंद के आकार का है । रेटिना के तीन परमाणु परतों के होते हैं, जबकि ऑक्सीजन प्रदान रेटिना vasculature निकट भीतरी नाड़ीग्रंथि कोशिका परत के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन एक उप रेटिना नेटवर्क फार्म नहीं है. धमनियां वाहिकाओं, इसके विपरीत, श्वेतपटल और रेटिना के बीच में झूठ और रेटिना pigmented उपकला (RPE) के साथ जुड़े रहे हैं । इस केशिका नेटवर्क रेटिना14के बाहरी हिस्सों को ऑक्सीजन की आपूर्ति ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
चित्रा 1: वयस्क zebrafish नेत्र का योजनाबद्ध चित्रण. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
रेटिना vasculature का सीधा दृश्य ट्रांसजेनिक टीजी (fli: EGFP) zebrafish लाइन15के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है । हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन vasculature के endothelial कोशिकाओं में fli मोटर के नियंत्रण में व्यक्त की बाद के चरणों में एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के माध्यम से दृश्य के लिए आधार है । यह zebrafish रेटिना और पूरे-ऊतक के बढ़ते के विच्छेदन के माध्यम से प्राप्त की है । इस ट्रांसजेनिक मॉडल intravascular लेबलिंग या पूरे माउंट immunohistochemistry के किसी भी आवेदन के बिना एक तेजी से संवहनी readout प्रदान करता है । zebrafish में मधुमेह रेटिनोपैथी का विश्लेषण करने के लिए, कदम से एक कदम और मानकीकृत तैयारी दिनचर्या हर विक्षेत्र द्वारा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.निंनलिखित तैयारी प्रोटोकॉल अंय अनुसंधान समूहों को आसानी से वयस्क zebrafish नेत्र के उजागर जहाजों में संवहनी परिवर्तन का मूल्यांकन और मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए zebrafish रेटिना के लिए एक अनुकूलित विच्छेदन दिनचर्या स्थापित प्रदान करता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6771.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*6H20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2370.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>BD 300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Scissor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>H872.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 22mmx22mm</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>103512222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>FEA111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-Illumination</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope MZ10 F</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope SP5 DS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope M80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>see Reference 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hematoxylin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>0088663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% eosin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99,9% ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,501,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Emsure</td>
			<td>606-001-00-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM 2165</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature

मधुमेह रेटिनोपैथी मध्य आयु वर्ग के वयस्कों के बीच अंधापन का प्रमुख कारण है । दुनिया भर में मधुमेह की बढ़ती व्यापकता मधुमेह microvascular जटिलताओं की रोकथाम अगले दशकों के प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों में से एक कर देगा । विशेष, लक्षित चिकित्सा और उपंयास चिकित्सकीय दवाओं के लिए दृष्टि-हानि के जोखिम में रोगियों की बढ़ती संख्या का प्रबंधन करने की जरूरत है । zebrafish चयापचय multifactorial रोग प्रक्रियाओं मॉडलिंग के लिए बढ़ती प्रासंगिकता के साथ विकासात्मक अनुसंधान सवालों के लिए एक स्थापित पशु मॉडल है । प्रजातियों के लाभ इष्टतम दृश्य और उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, ब्याज की जीन बाहर दस्तक करने के लिए मजबूत क्षमता के साथ संयुक्त के लिए अनुमति देते हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जो वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature का आसान विश्लेषण की अनुमति देगा का वर्णन एक तेजी से पढ़ने के रूप में लंबी अवधि के नाड़ी neoangiogenesis या पोत क्षति से जुड़े विकृतियों की सेटिंग्स में । यह zebrafish रेटिना और पूरे-ऊतक के बढ़ते के विच्छेदन के माध्यम से प्राप्त की है । उजागर जहाजों के दृश्य तो ग्रीन EGFP रिपोर्टर वयस्क रेटिना vasculature में व्यक्त की फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त की है । ऊतक के सही हैंडलिंग बेहतर परिणाम और कम आंतरिक पोत टूटना करने के लिए अनछुए संवहनी संरचना के दृश्य को आश्वस्त करने के लिए नेतृत्व करेंगे । विधि रेटिना vasculopathy के zebrafish मॉडल में पोत वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neoangiogenesis में परिवर्तन से जुड़े उपयोग किया जा सकता है ।

यहां हम वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish में रेटिना vasculature के दो ठेठ रूपात्मक उदाहरण प्रदर्शित: एक बार एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना (चित्रा 9A) और एक बार एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (चित्रा 9B) के साथ । प्रगट रेटिना संरचना एक उच्च संगठित पैटर्न से पता चलता है । मजबूत autofluorescence zebrafish रेटिना में देखा जाता है, जब एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ visualized. इस प्रकार, एक फोकल स्कैन के माध्यम से केवल संवहनी परत के एक दृश्य के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने और इसके विपरीत वृद्धि की सलाह दी है । तेजी से तस्वीर अधिग्रहण या स्थितियों जहां गुणात्मक डेटा के लिए पर्याप्त हैं, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक आकर्षक विकल्प है ।
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
चित्र 9: वयस्क टीजी की प्रतिनिधि तस्वीरें (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature. रेटिना vasculature के दो ठेठ रूपात्मक उदाहरण दिखाए जाते हैं: केंद्रीय ऑप्टिक धमनी 5-7 मुख्य जहाजों, जो आर्केड के उत्तराधिकार में तो शाखा में फैलता है । सभी आगे जहाजों circumferential नस में नाली (CV) प्रत्येक पत्ती के बाहरी हिस्से को सीमित । 2.5 x आवर्धन पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन (A)। एक संयुक्त 5x5 एकल छवि टाइल स्कैन के माध्यम से फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा रेटिना vasculature के दृश्य (ख)। <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
ऑप्टिक धमनी ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर रेटिना प्रवेश और, ज्यादातर नमूनों में, 5-7 मुख्य जहाजों में फैलता है (चित्रा 10A) । मुख्य जहाजों तो आर्केड के उत्तराधिकार में शाखा और इनर ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) से कनेक्ट, भी circumferential नस (CV) कहा जाता है, फ्लैट घुड़सवार रेटिना की परिधि में ऑप्टिक डिस्क घेरना ( चित्रा 10Bदेखें) । आईओसी शिरापरक पोत है कि नेत्र ग्लोब (bulbus oculi) के भीतर के रिम पर धमनी रक्त नालियों है । zebrafish रेटिना vasculature भी केशिकाओं और angiogenic अंकुरण (चित्रा 10C) की शाखाओं के साथ उच्च संवहनी गतिविधि के क्षेत्रों से पता चलता है. इस संवहनी गतिविधि ज्यादातर आईओसी के पास निकटता में स्थित है । यह सूचना है कि एक ही आंख रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों में दोनों उच्च और निम्न संवहनी गतिविधियों को प्रदर्शित कर सकते हैं महत्वपूर्ण है (तुलना चित्रा 10B और चित्रा 10C). सामांय में, zebrafish की रेटिना vasculature अधिक avascular स्थान और मुख्य शाखाओं के बीच में कम केशिकाओं से पता चलता है अगर की तुलना में, उदाहरण के लिए, चूहों के रेटिना17. प्रत्येक नमूने के दोनों आंखों का विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि vasculature के बीच में भिंन हो सकते है और एकवचन निरीक्षण पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
चित्रा 10: वयस्क टीजी के क्षेत्रों बढ़ाया (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature दृश्य. ऑप्टिक मुख्य जहाजों में बंटी धमनी (क)। कम संवहनी गतिविधि के एक क्षेत्र में भीतरी ऑप्टिक सर्कल (आईओसी) को जोड़ने के चित्र के तल पर रेटिना केशिकाओं (B)। उच्च संवहनी गतिविधि आईओसी से जोड़ने के एक क्षेत्र में रेटिना केशिकाओं (C)। <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
एक उच्च-संरक्षित वास्तुकला के ंयूरॉन परतों पहले से ही मौजूद है zebrafish से लगभग ७२ एच पोस्ट निषेचन (hpf) के बाद18। वयस्क zebrafish रेटिना निम्नलिखित परतों को अंदर से बाहर दिखाता है (चित्र 11): नाड़ीग्रंथि सेल लेयर (GCL), इनर plexiform लेयर (आईपीएल), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल), आउटर plexiform लेयर (OPL), आउटर न्यूक्लियर लेयर (केव), photoreceptor लेयर (पीएल), और रेटिना pigmented उपकला (RPE). रेटिना vasculature दृश्य से संवहनी मापदंडों का आकलन चित्र 12में दिखाया गया है । भीतरी रेटिना vasculature नाड़ीग्रंथि कोशिका परत पर स्थित है (GCL) (चित्रा 13B, सफेद बॉक्स) जबकि धमनियां केशिकाओं के साथ जुड़े होंगे रेटिना pigmented उपकला (RPE).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
चित्र 11: वह वयस्क zebrafish आंख के दाग । लेंस को हटाने के बाद पूरी आंख का क्रॉस-सेक्शनल ओवरव्यू (A)। वयस्क zebrafish आंख की रेटिना परतें19 (ख)। संकेत (काला तीर) PL में प्राकृतिक तोड़ने बिंदु के (C)। <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

यहां, हम एक विधि प्रोटोकॉल जो वयस्क टीजी (fli: EGFP) zebrafish रेटिना vasculature का एक आसान विश्लेषण की अनुमति देगा चर्चा के रूप में एक तेजी से पढ़ने के लिए लंबी अवधि के नाड़ी neoangiogenesis और संरचनात्मक परिवर्तन से जुड़े विकृतियों की सेटिंग्स में ।

एक मछली की आंखों के माध्यम से मधुमेह का अध्ययन: Microdissection, दृश्य, और वयस्क टीजी (fli: EGFP) Zebrafish रेटिना Vasculature का विश्लेषण

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Research

JoVE Journal

Medicine

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

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