Name: studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Katrin Bennewitz и Марлен Hausner данио рерио животноводства и оказания технической помощи. Авторы признают поддержки основной объект Live клеток Imaging Мангейм в центре для биомедицины и медицинской технологии Мангейм (DFG инст 91027/9-1). Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (международного исследования учебные группы 1874/1 «DIAMICOM», проект SP5 и SP9; Совместный исследовательский центр SFB1118, проект B1 и совместный исследовательский центр SFB/TR23 проекта Z5).

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global report on diabetes. , 88 (2016).</li><li>Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+nephropathy+-+complications+and+treatment.">Diabetic nephropathy - complications and treatment.</a> Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).</li><li>Yau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+and+major+risk+factors+of+diabetic+retinopathy.">Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy.</a> Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).</li><li>Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy.">Diabetic retinopathy.</a> The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).</li><li>Raymond, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+prevalence+of+retinopathy+in+diabetic+patients+of+South+Asian+ethnicity+compared+with+white+Europeans+in+the+community:+a+cross-sectional+study.">Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study.</a> Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).</li><li>Heng, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathogenesis,+clinical+grading,+management+and+future+developments.">Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments.</a> Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).</li><li>Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).</li><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Sharma, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELMO1+protects+renal+structure+and+ultrafiltration+in+kidney+development+and+under+diabetic+conditions.">ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions.</a> Sci Rep. 6, 37172 (2016).</li><li>Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ezetimibe+and+simvastatin+reduce+cholesterol+levels+in+zebrafish+larvae+fed+a+high-cholesterol+diet.">Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet.</a> Cholesterol. , 564705 (2012).</li><li>Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+zebrafish+as+a+model+for+glucose+metabolism:+expression+of+phosphoenolpyruvate+carboxykinase+as+a+marker+for+exposure+to+anti-diabetic+compounds.">Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds.</a> J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).</li><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).</li><li>Kasprick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+adult+zebrafish+extraocular+muscles.">Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles.</a> PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+system+of+zebrafish+and+its+use+to+model+human+ocular+diseases.">The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Bell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+of+adult+zebrafish:+in+vivo+imaging+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+function+of+midkine+in+the+vertebrate+retina.">The expression and function of midkine in the vertebrate retina.</a> Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).</li><li>Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+retinal+angiogenesis+in+zebrafish+as+a+model+to+study+retinopathy.">Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy.</a> PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).</li><li>Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+for+understanding+diabetic+complications.">Zebrafish: a model for understanding diabetic complications.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).</li><li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycaemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy.">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).</li><li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+(Danio+rerio)+leads+to+morphological+changes+in+the+retina.">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).</li><li>Jorgens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tissue+glucose+alters+intersomitic+blood+vessels+in+zebrafish+via+methylglyoxal+targeting+the+VEGF+receptor+signaling+cascade.">High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade.</a> Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).</li><li>Lai, A. K., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+diabetic+retinopathy:+summary+and+comparison.">Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison.</a> J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Модели гипоксия индуцированной neoangiogenesis сетчатки показывают увеличение числа точек ветвления, ангиогенных ростки, площадь сосудистых и снижение intercapillary расстояние в zebrafish20. Эти выводы поддерживают идею, что данио рерио подвержен21микрососудистых осложнений диабета, как ключевые выводы позднее диабетической ретинопатии включают гипоксия опосредованной neoangiogenesis, который тесно связан с VEGF выражение. Гипергликемия индуцированные изменения в сетчатке данио рерио приводят к увеличению толщины судов, но сохранить общий кучность22. Чередуя погружения в решениях глюкозы для 30 дней также уменьшается толщина IPL и INL23. Также уже было показано непосредственное влияние глюкозы метаболитов в zebrafish как метаболические сторонники заболеванием. Дополнительные сосудистой hyperbranching наблюдалось в багажнике сосудистую zebrafish эмбриона после инкубации с Метилглиоксаль24. На данный момент это не животное модель, которая обеспечивает все основные критерии диабетической ретинопатии. Ранние изменения часто встречаются, но переход в пролиферативной диабетической ретинопатии отсутствует25. Данио рерио также подпадает под это определение, как мы только видели гипоксия опосредованной neoangiogenesis или гипергликемия индуцированных изменений до сих пор. Текущие результаты поддерживают идею, что данио рерио восприимчив к гипергликемии опосредованной сосудистых изменений и как животной модели потенциально может показать прогрессии в пролиферативной диабетической ретинопатии. В зависимости от силы и воздействия гипергликемии опосредованный эффект право Экспериментальная модель может привести к ишемии в некоторых областях данио рерио сетчатки и поощрять neoangiogenesis в качестве ключевых критериев пролиферативной диабетической ретинопатии. Однако как данио рерио — сравнительно новый игрок в области моделирования долгосрочных микрососудистой патологий, предстоящих диабет модели в zebrafish будет предоставить дополнительную информацию и уточнить его значение в отношении других моделей и их патологий. Например в крест tg(gata1a:DsRed) рыбки данио рерио с красной маркировкой эритроцитов в tg(fli:EGFP) линии могут использоваться одновременно визуализировать потенциальных внутриглазных кровотечениях в будущем данио рерио модели показаны микроаневризмы как предсказатель прогрессии в НДР.
Так как сетчатки сосудистую прогрессирует в правопреемства аркады, оценки intervascular расстояние, количество точек ветвления и площадь сосудистых связаны с расстояние от центральной оптической артерии. Чтобы избежать предвзятости в параметрах начисленных сосудов, требуется точка ориентации. МОК является такая структура и является весьма актуальным, поскольку области сосудистой деятельности лежат в прямой пространственной близости. Для постоянной оценки сетчатки сканирования следует разделить на несколько разделов прямоугольное изображение с последовательной расстояние до МОК. Вся Сетчатка должны быть проанализированы и численно симметрично распространены изображения. Данио рерио сетчатки показывает областей с высоким и низким капилляров и неравное распределение участков изображения может привести к дополнительным предвзятости.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
Рисунок 12: пример презентации сосудистой параметров как индикация визуализации сетчатки сосудистую. Измерение intervascular расстояния (красный двойной стрелки) вблизи внутренний оптический круг (МОК) (A). Три точки ветвления (красные круги) вблизи МОК (B). Визуализация сетчатки сосудистую данио рерио с увеличенной области (красный прямоугольник) показаны прорастания судна (C). Диаметр сосуда, измеренным на определенном расстоянии (белый двойной стрелки) от центральной артерии (белый крест) (D). Судно плотность — это процент сетчатки площадь, занимаемая наложение судов (диагональ красные линии) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Для измерения intervascular расстояния, необходимо задать определенное расстояние в МОК в качестве стандарта (Рисунок 12А, белый двойной стрелки) и нарисуйте Воображаемая горизонтальная линия (Рисунок 12А, горизонтальной белой линии) параллельно с МОК. Расстояние между судов на этой строке суммируются и арифметически в среднем равняется intervascular расстояние. Ветвление очков учитываются внутри каждого изображения, всякий раз, когда судно разбивает и более чем одной сосудистой люмен продолжить с точки зрения происхождения. Это также включает в себя горизонтальных связей между капилляров. Важно оставаться в соответствии с анализом и решить, какие ветвления точки рассчитывать и держать эти правила на протяжении всего эксперимента для уменьшения ненужных вариации. Сосудистые прорастания, как показано на рисунке 12 c, это еще один параметр, который может учитываться в каждом изображении оценить влияние на сосудистую сетчатки. Ростки ангиогенных не следуют аркада как преемственность между центральной артерии и МОК и фокус вблизи наружной части сетчатки. Для оценки определенных судно диаметров, точки ориентации всегда требуется от которого заданное расстояние знаменует измерения пятно. Происхождения центральной артерии сетчатки внутри предоставляет такие руководящие указания для судов главного стебля (12D рис, белый крест). Площадь, занимаемая судов (Рисунок 12E, Диагональ красные линии) в процентах от области всей сетчатки сосудистого плотность и косвенно соотносятся аваскулярный области.
Полный конфокальный сканирования одного образца должен состоять из несколько детализированных изображений позволяет визуализацию мелких капилляров hypersprouting. Чтобы оптимизировать время и ресурсы, затрачиваемые на этот шаг, автоматизированных культиватора процедура должна использоваться с глубиной общего сканирования для каждой плитки. Неравномерным монтажа сетчатки может значительно увеличить время, затраченное для сканирования сосудистую с конфокального микроскопа. Хотелось бы только сканирование сосудов слой (рис. 13B, белый квадрат), но частичное включение GCL оптимальный подход часто необходим.Оставив избыток Длина зрительного нерва после усечения, а также сокращения для достижения плоским гора, будучи слишком коротким, может привести к неравномерным монтажа.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
Рисунок 13: сравнение он окрашивание и аутофлюоресценция в сетчатке взрослых рыбок данио. Сетчатки сосудистую в фокусе выше GCL (A). Сетчатки сосудистую (белая коробка) показаны зеленый сигнал EGFP и слоях сетчатки, экспонируется сильные аутофлюоресценция ((B)). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Как надлежащей подготовки сосудистую данио рерио сетчатки требует предварительной подготовки, небольшой размер выборки с неподготовленных Диссекторы и сильно меняя результаты подготовки являются основным ограничением методики. В то время как подготовка глаза данио рерио tg(fli:EGFP) дает быстрый проницательность в состояние сосудистую, техника по-прежнему использует около 20 минут рабочего времени за сетчатки для опытный исследователь. Все эти шаги подготовки для сетчатки сосудистую должна выполняться под микроскопом рассечения и необходимость Диссекторы остаться сосредоточены все время как небрежно шаг потенциально может вызвать обрыв судна. Диссектор должны практиковать регулярно, как длительное отсутствие от подготовки уменьшает вероятность диссектор сохранения целостности судна.
Кроме того дополнительная индикация через иммуногистохимия (IHC) по-прежнему ограничена, поскольку лишь небольшое количество антител, проверяемый на ткани человека и грызунов работают с данио рерио. Экспериментаторы заинтересованы в ИХС рекомендуется для поиска данио рерио специфические антитела, особенно при работе с новой цели. Кроме того рекомендуется использовать дополнительные данио рерио репортер линии, которые являются полезными для изучения клеток за сосудистую в глаза. Эта стратегия, однако, отнимает много времени, как он занимает несколько месяцев для создания линии взрослых рыбок данио, которые несут несколько трансгенных репортеры.
Тем не менее данио рерио создает уникальный спектр преимуществ. Они являются относительно небольшими и легко воспроизвести. Они могут быстро расти до взрослых этапов и их эмбрионы являются оптимальными для скрининга наркотиков. Поле легко растет и больше литературы становится доступным. С способность генерировать гена нокауты на быстрой скорости и обилие трансген флуоресценции репортер линии выбор для данио рерио сдерживается только выбранных исследований вопрос.

Сахарный диабет является метаболические заболевания определяется гипергликемия, результате секреции инсулина неблагополучных или неадекватной ткани ответ выделяется инсулина. ВОЗ считает, что 422 миллиона взрослых, живущих с сахарным диабетом в 20141 и распространенности диабета во всем мире, как ожидается, увеличится до 8-10% населения до 20352, что делает диабет одним из ключевых исследований полей в последующие десятилетия. Жизнь с хроническим высокого сахара в крови приводит к долгосрочным микрососудистых осложнений, в том числе диабетической ретинопатии, нефропатия и полинейропатии. Управления и предупреждения этих осложнений трудны; действительно диабет становится наиболее частой причиной терминальной стадии почечной болезни (ТПН), что приводит к диализа2, и диабет является ведущей причиной слепоты среди middle-aged взрослых3.
Первоначальные причины микрососудистой повреждения в диабетических глазных являются хроническая гипергликемия, метаболические изменения, а также определенные факторы риска (например, артериальной гипертензии, дислипидемии), ведущих к сосудистой эндотелиальная дисфункция, перицит отсева, и капиллярные регрессии, которая приводит к бесклеточной сосудистой рукава. Результате ишемию сетчатки является причиной неоваскуляризации и повышение сосудистой проницаемости, развитие пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR)4. Диабетическая ретинопатия правило был обнаружен в 37% больных диабетом, хотя зрение угрожая диабетической ретинопатии было установлено в 12% отобранных белых европейских когорты в исследовании UKADS5. Текущее лечение можно только предотвратить дальнейшие осложнения и не смогла полностью восстановить уже индуцированных повреждений. Панретинальная фотокоагуляция, помимо гликемического контроля, является стандартной терапии для пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR), но влияет на соседних здоровых тканей, а также. Анти-VEGF вмешательства Показать многообещающие результаты как альтернативы для лазерного лечения6,7, но в конечном итоге, специализированные, целенаправленной терапии и новые препараты необходимые для управления растущее количество пациентов риску потери зрения.
Модели установленного исследования животных диабетической ретинопатии не разделяют каждый аспект человеческой патофизиологии. Использование правильного вида для удовлетворения конкретных потребностей научных исследований вопроса является одним из наиболее существенных частей экспериментальной установки. Zebrafish эмбриона (Danio рерио) уже широко используется в научных исследованиях развития и обеспечивает оптимальные практические фон для специфических генов нокдаун или нокаут через морфолиновая или ТРИФОСФАТЫ/Cas9 техника8. Эти методы могут быть легко использованы в данио рерио расследовать генов, которые были определены на больших масштабах генома всей ассоциации исследований (GWAS), генерации идеи в конкретные механизмы прогрессирования заболевания и подверженность9. Короткие поколений время, большое количество потомства, легко и низкой стоимости обработки и растущая поддержка пробирного повысили актуальность модели данио рерио, особенно с учетом ее большой потенциал для моделирования метаболические болезни. Сохранение биологических механизмов в zebrafish было показано как основы для развития фармакологической терапии. К примеру антидиабетические препарат метформин и холестерина СИМВАСТАТИН показали «лечить» условия в моделях лагерь/дексаметазон индуцированной высокой PEPCK выражения и высоким уровнем холестерина диета индуцированной гиперхолестеринемии10 , 11 , 12. этот продвижение проницательность в общепрограммной сохранены метаболических механизмов подтверждается растущее количество моделей диабет данио рерио, через эксперименты таких как: чередование инкубации в решениях глюкозы, Стрептозотоцин индуцированной абляция бета-клеток, nitroreductase опосредованной бета клеток абляции с помощью пролекарство метронидазол, Моногенные диабет опосредовано через нокдаун гена pdx1 или нокаут, а также модели сопротивление увеличение инсулина в скелетной мышце 12. эти уже созданы протоколы, упомянутые выше особенности видов, и способность эффективно управлять геном в большое количество образцов все продемонстрировать преимущества данио рерио для изучения механизмов вождение сложное заболевание процессов, а также способность к экрану для фармакологического вмешательства.
Общее понимание основных данио рерио анатомии глаза (рис. 1) необходим для диссектор с целью использования данио рерио как модель для ангиопатия сетчатки. Данио рерио глаз имеет шесть экстраокулярные мышцы, четыре прямая и две косые мышцы, которые вставляют на внешней стороне земного шара на склера13. Роговицы является прозрачной ткани, охватывающих объектива и продолжает непосредственно в склеры, который образует внешней оболочки глаза. Склера непрозрачна, имеет частично легкими отражающей поверхности и сильно пигментированы. Объектив, сам более шарообразные чем двойники человека. Сетчатка состоит из трех ядерных слоев нейрональных клеток, в то время как кислород предоставление сетчатки сосудистую тесно связан с внутренней ганглия слоя клеток, но не образуют субретинальное сеть. Хориоидальные сосуды, напротив, лежат между склерой и сетчатки и связанные с пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС). Этот капиллярной сети поставляет кислород к наружной части сетчатки14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
Рисунок 1: схематически глаза взрослых рыбок данио. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Простая визуализация сетчатки сосудистую достигается за счет использования трансгенных tg(fli:EGFP) данио рерио линии15. Зеленый флуоресцентный белок, выразил под контролем fli promotor в эндотелиальных клетках сосудистую является основой для визуализации через лазерный сканирующий микроскоп на более поздних этапах. Это достигается через рассечение данио рерио сетчатки и целом монтаж ткани. Эта трансгенных модель обеспечивает быстро сосудистой индикация без любое применение внутрисосудистых маркировки или целое гора иммуногистохимия. Для анализа диабетической ретинопатии в данио рерио, шаг за шагом и стандартизированной подготовки рутины должен использоваться каждый диссектор.Следующий протокол подготовки обеспечивает других исследовательских групп возможность легко оценить сосудистые изменения в открытых судов взрослых рыбок данио глаза и дать руководящие указания для создания оптимизированного рассечение обычной для данио рерио сетчатки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6771.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*6H20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05886.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2370.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plate</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>BD 300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Scissor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>H872.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 22mmx22mm</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>103512222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>MSG Praxisbedarf</td>
			<td>FEA111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-Illumination</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope MZ10 F</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope SP5 DS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope M80</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>see Reference 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hematoxylin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>0088663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% eosin</td>
			<td>Dr. K. Hollborn &#38; S&#246;hne</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99,9% ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,501,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Emsure</td>
			<td>606-001-00-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome RM 2165</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying diabetes through the eyes of a fish: microdissection, visualization, and analysis of the adult tg(fli:egfp) zebrafish retinal vasculature

Диабетическая ретинопатия является ведущей причиной слепоты среди middle-aged взрослых. Рост распространенности диабета во всем мире будет сделать профилактики диабетической микрососудистых осложнений одним из ключевых исследований полей следующих десятилетий. Для управления все большее количество пациентов риску потери зрения необходимы специализированные, целенаправленной терапии и роман терапевтических препаратов. Данио рерио является установленным животной модели для развития исследований вопросов с увеличением значимости для моделирования процессов метаболизма многофакторных заболеваний. Преимущества данного вида позволяют для оптимальной визуализации и высокая пропускная способность наркотиков скрининг подходы, в сочетании с сильной способностью выбить гены интереса. Здесь мы описываем протокола, который позволит легко анализ сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP) как быстрое считывание в настройках долгосрочных сосудистых патологий, связанных с neoangiogenesis или судна повреждения. Это достигается через рассечение данио рерио сетчатки и целом монтаж ткани. Визуализация судов подвергаются затем достигается через конфокальная микроскопия зеленый репортер EGFP, выраженные в взрослых сетчатки сосудистую. Правильная обработка ткани приведет к лучшим результатам и менее поломки внутреннего сосуда для обеспечения визуализации неизмененном сосудистые структуры. Этот метод может быть использован в zebrafish модели заболеванием сетчатки, связаны с изменениями в архитектуре судна, а также neoangiogenesis.

Здесь мы показываем две типичные примеры морфологических сетчатки сосудистую в zebrafish взрослых tg(fli:EGFP): однажды визуализированы с флуоресцентным микроскопом (рис. 9а) и один раз с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (рис. 9B). Выявлены сетчатки структура показывает шаблон высоко организованной. Сильный аутофлюоресценция наблюдается в данио рерио сетчатки, когда визуализированы с флуоресцентным микроскопом. Таким образом визуализация только сосудистой слоя через конфокальный сканирования рекомендуется снизить фон флуоресценции и увеличить контрастность. Для быстрее картина приобретения или ситуаций, которых достаточно качественных данных флуоресцентным микроскопом является привлекательной альтернативой.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
Рисунок 9: представитель фотографии взрослых tg(fli:EGFP) данио рерио сетчатки сосудистую. Показаны два типичных морфологических примеры сетчатки сосудистую: центральной артерии оптические распространяется в 5-7 магистральных сосудов, которые затем филиала в правопреемства аркад. Все дальнейшие судов слейте в продольных Вену (CV) ограничение внешней части каждого лепестка. Визуализация через микроскопии флуоресцирования 2,5 x увеличение (A). Визуализация сетчатки сосудистую Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия через комбинированные плитка сканирования одного изображения 5 x 5 (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Оптоволоконный артерии проникает сетчатки на головку зрительного нерва и, в большинстве проб, распространяется в 5-7 магистральных сосудов (Рисунок 10А). Магистральных сосудов затем филиала в правопреемства аркады и подключиться к внутренний оптический круг (МОК), также называется продольных вен (CV), обводить диск зрительного нерва на периферии плоский навесные сетчатки (см. рис. 10б). МОК является венозная судна, что стоки артериальной крови на внутренний край глазной глобус (bulbus oculi). Данио рерио сетчатки сосудистую также показывает области деятельности высоких сосудов с разветвлением капилляров и ангиогенных прорастания (рис. 10 c). Эта сосудистая деятельность основном расположен в ближайшем близости к МОК. Важно заметить, что тот же глаз может продемонстрировать обеих высоких и низких сосудистой деятельности в различных регионах сетчатки (Сравните Рисунок 10B и рис. 10 c). В общем сетчатки сосудистую данио рерио показывает больше аваскулярный пространства и меньшее количество капилляров между основной ветви, если по сравнению с, например, сетчатки мышей17. Оба глаза каждой пробы должны быть проанализированы, потому что сосудистую может варьироваться между ними и сингулярных инспекции может привести к смещению.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
Рисунок 10: увеличенное области визуализации сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP). Оптоволоконный артерии, ветвящимся магистральных сосудов (A). Сетчатки капилляров в области сосудистой низкой активности, соединяющий внутренний оптический круг (МОК) в нижней части изображения (B). Сетчатки капилляров в области сосудистой высокой активности, подключение к МОК (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Хорошо сохранились архитектура нейрональных слоёв уже присутствует в zebrafish от приблизительно 72 h сообщение оплодотворение (hpf) начиная18. Взрослый данио рерио сетчатки показывает следующие слои от изнутри наружу (рис. 11): слоя клеток ганглия (GCL), внутренний сплетениевидный слой (IPL), внутренний ядерный слой (INL), внешний сплетениевидный слой (ОБН), ядерный слой (ONL), слой фоторецептор (PL), и пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС). Оценка сосудистой параметров от сетчатки сосудистую визуализации показан на рисунке 12. Внутренняя сетчатки сосудистую расположен на слоя клеток ганглия (GCL) (Рисунок 13B, белая коробка) во время хориоидеи капилляров будет связан с пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
Рисунок 11: он пятнать глаза взрослых рыбок данио. Поперечного сечения обзор весь глаз после снятия линз (A). Слоях сетчатки взрослых рыбок данио глаз19 (B). Индикация (черная стрелка) естественных переломный момент в PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature at JoVE.com

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Здесь мы рассмотрим метод протокола, который позволит легко анализ сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP) как быстрое считывание в настройках долгосрочных сосудистых патологий, связанных с neoangiogenesis и структурные изменения.

Изучая диабет глазами рыбы: Microdissection, визуализации и анализа взрослых tg(fli:EGFP) сетчатки сосудистую данио рерио

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Данио рерио модели сахарного диабета и метаболических памяти

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Осмотическое доставки лекарств к ишемическим задних конечностей и перфузии сосудистого с Microfil для микро-компьютерной томографии

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Техники обработки глаз имплантировали протез для сетчатки Локализованные Гистопатологический анализ

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Методы обработки глаз имплантировали сетчатки протезирования для локализованных гистопатологического анализа: Часть 2 Epiretinal Имплантаты с сетчатки гвозди

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; ДБ</sup&gt; Мышь Модель сахарного диабета 2 типа: поджелудочной Островок изоляции и живых клеток 2-Фотон изображений интактных островков

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Хирургическое Травма поджелудочной железы мыши через перевязка панкреатического протока в качестве модели для эндокринной и экзокринной перепрограммирования и распространения

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Визуализация эндогенных митофагных комплексов на месте в бета-клетках поджелудочной железы человека, используя асссы Лигации близости

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...