Name: inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation at JoVE.com

著者らは、ジェームズ ・ マディソン大学生物教室・ ジェームズ ・ マディソン大学光顕微鏡イメージング施設の寛大なサポートをありがとうございます。夫妻ジャスティン ・ w ・ ブラウンとコーリー ・ l ・ クレランド手術材料と空間の寛大な調整のために博士マーク ・ l ・ ガブリエレ若い生後ティッシュの準備、に関する有益な助言を。この研究はだった 4-バージニア州、連邦のバージニア州 (G.S.V.) を推進するための共同パートナーシップとによってバージニア州アカデミーの科学小プロジェクト研究助成金 (G.S.V.) 共同研究助成金によって一部で賄われて。学部研究生奨学金 (K.M.B.) に、ファレル夏研究奨学金 (K.M.B.) をジェームズ ・ マディソン大学第 2 世紀への奨学金 (K.M.B.)、寛大サポート ベティ Jo 愛するバトラー 58年基金によって提供されているジェームズマディソン大学百周年記念奨学金 (C.J.H.) に、ジェームズ ・ マディスン大学ルーシー ロビンソン検索 30年記念奨学金 (Z.L.H.) に、科学と数学教員援助交付金 (G.S.V.) にジェームズ ・ マディソン大学。

ここで説明する方法は、やすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守動物ケアおよび使用委員会 (ACUC) のジェームズ ・ マディソン大学によって承認されています。
1. マウスのセットアップ
<ol><li>若者の家 (> P60) ブリーダー ペア25を設定する一緒に男性と女性のホモ floxed マウス。 注: 良いネガティブ コントロールする Cre リコンビナーゼ式...

<ol>
	<li>Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+plasticity+induced+by+inhibitory+neuron+transplantation.">Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation.</a> Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Target+Cell-Specific+Role+for+Presynaptic+Fmr1+in+Regulating+Glutamate+Release+onto+Neocortical+Fast-Spiking+Inhibitory+Neurons.">A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons.</a> J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Copy+Number+Variation+in+Human+Neurons.">Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons.</a> Science. 342 (6158), 632-637 (2013).</li><li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersection+of+diverse+neuronal+genomes+and+neuropsychiatric+disease:+The+Brain+Somatic+Mosaicism+Network.">Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network.</a> Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).</li><li>Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+a+DNA+polymerase+beta+gene+segment+in+T+cells+using+cell+type-specific+gene+targeting.">Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting.</a> Science. 265 (5168), 103-106 (1994).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Contributions+to+Synaptic+and+Learning+Abnormalities+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).</li><li>Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+Double+Markers+in+Mice.">Mosaic Analysis with Double Markers in Mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+dissection+of+Lis1+and+Ndel1+in+neuronal+migration.">Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration.</a> Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).</li><li>De la Rossa, A., Jabaudon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+rapid+gene+delivery+into+postmitotic+neocortical+neurons+using+iontoporation.">In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation.</a> Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).</li><li>Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-autonomous+role+of+excitatory+synaptic+transmission+in+the+regulation+of+neuronal+structure+and+function.">The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function.</a> Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+5A+inhibits+synaptogenesis+in+early+postnatal-+and+adult-born+hippocampal+dentate+granule+cells.">Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells.</a> eLife. 3, 1-24 (2014).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+Approaches+to+Study+the+Excitability+of+Neuronal+Subpopulations+and+Single-cell+Connectivity.">In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+In+utero+Electroporation.">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-Regulated+Dynamics+of+Layer+4+Neuronal+Dendrites+during+Thalamocortical+Reorganization+in+Neonates.">NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 35747 (2016).</li><li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice.">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).</li><li>Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ars2+maintains+neural+stem-cell+identity+through+direct+transcriptional+activation+of+Sox2.">Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2.</a> Nature. 481, 195-198 (2011).</li><li>Scotto-Lomassese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+new+neuron+differentiation+in+the+adult+olfactory+bulb.">Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmids 101: A Desktop Resource. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook. , (2015).</li><li>Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+of+the+Cotton+Rat+in+Studies+for+the+Pre-clinical+Evaluation+of+Oncolytic+Viruses.">Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses.</a> J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+Migration+from+Basal+Forebrain+to+Neocortex:+Dependence+on+Dlx+Genes.">Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes.</a> Science. 28 (5337), 474-476 (1997).</li><li>Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Multimodal+Analgesia+on+the+Success+of+Mouse+Embryo+Transfer+Surgery.">Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).</li><li>Kim, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li></ol>

モザイク脳組織を生成する floxed マウスにおける Cre リコンビナーゼとエレクトロポレーションの子宮内の組み合わせを紹介します。このアプローチの利点は、新しいマウス行が異なる細胞サブタイプが対象とするたびに生成する必要はありません: 興奮性ニューロン、抑制ニューロンまたは時間によってグリア細胞を対象に子宮内でエレクトロポレーションを使用できますエレ?...

興味の遺伝子の機能を理解するための古典的な実験パラダイムは、遺伝のモザイクを生成します。遺伝子は細胞の表現型に必要なかどうかを決定するには、最も簡単な方法は有機体 (例えばノックアウト) を通して遺伝子の機能の損失を引き起こしています。ただし、遺伝子が特定の細胞型で特に必要なかどうかを決定、生物全体の遺伝子のノックアウトは有効なアプローチではありません。代わりに、メソッドが必要なしの野生型 (すなわち遺伝的摂動) 組織に囲まれている間特定のセルに遺伝子の機能の損失と、-つまり、モザイク組織を作成します。突然変異体の細胞が突然変異体の表現型を示していますが、周囲の野生型細胞は、細胞自律的方法で遺伝子機能。解析モザイク組織、変異細胞が野生型組織に囲まれているは、遺伝子、特にニューロンとグリア細胞が組織の広大な相互接続ネットワークを形成する脳の細胞の自律的機能の理解に最適です。
モザイク脳組織のいくつかのフォームは、遺伝子の細胞の自律的機能を調べるための強力なモデルを提供しています。神経移植1、女性 X-リンクされてモザイク2,3,4に焦点を当てた研究とモザイクに基づいて彼らの結論を描画している内因性の体細胞モザイク5,6脳組織。Cre lox 組換えシステムを介して遺伝子の条件削除は、トランスジェニック マウス線の偉大な可用性を最大限に活用する方法です。このメソッドは、loxP サイト同じ方向 ("floxed") の両方の顔が並ぶそれを残して (エクソン) など遺伝子の必要なシーケンスのいずれかの側で 2 つの loxP サイトを紹介しています。Cre リコンビナーゼ loxP サイト7間のシーケンスを切り取る。Cre を介する組み換えは、セル (「Cre 記者ライン」) のサブセットに蛍光マーカーと一緒に Cre リコンビナーゼを表現する別のマウス線横断 floxed マウスで実現できます。これは、さまざまな興奮性神経細胞やアストロ サイト8などの細胞のサブセットの遺伝子の機能を明らかにする方法で実証されています。Cre 記者行クレエT2 (単一ニューロン誘導 Cre を介したノックアウトまたは滑らかでラベル付け) という薬物誘導する Cre を介した結合を許可するを表すことができます9。ダブル マーカー (MADM)10,11モザイク解析と呼ばれる別の戦略、Cre を介した染色体間組換えホモ接合体変異ヘテロ接合体組織と一緒に作成することができます。これらのアプローチのマウスの新しい行は各候補遺伝子またはテストされる細胞のサブタイプのたびに生成される必要があります。イオントフォレシス12通したり、ウイルスのベクトル (例えばアデノ随伴ウイルス13またはレンチ14細胞サブタイプに固有を運ぶ Cre リコンビナーゼを後天的導入できる代わりに、発起人)。この戦略は、強いと生後のラベルを作成します。まばらと胎生期大脳皮質ニューロンの開発を対象とするには、理想的な戦略は蛍光マーカーで Cre リコンビナーゼのエレクトロポレーション子宮内です。
体内組織モザイク エレクトロポレーション子宮内で生成する Cre lox 再結合を結合することに加えて、その他公開プロトコルから15,16、手順にいくつかの適応を紹介 17,18,19,20,21。繁殖タイミング妊娠した女性の成功を改善するために情報を提供いたします。我々 はまた、大脳皮質組織の神経細胞の疎と明るいラベリングを導入する我々 の 2 つの戦略を概説: Cre リコンビナーゼの蛍光マーカー22single コンストラクト コーディングのレベルを滴定する戦略の 1 つです。別の戦略は、心23,24でこれらのパラメーターを具体的に設計された「超新星」システムを使用することです。さらに、一貫性のあるマイクロインジェクション ピペットと子宮の穿孔手術を簡素化の生産の改善を提供しています。最後に、我々 はさらに汚れるか、または免疫組織化学を樹状突起スパインの樹状突起と軸索のアーバー、分析できる簡易組織の準備で重要な手順を概説します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>See &#34;1. Mouse set-up&#34; (step 1.1, &#34;wildtype mice&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP.Cre empty vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#20781</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker&#34;). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69138</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69136</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#85006</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12362</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.3 &#34;endotoxin-free plasmid purification kit&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue powder, BioReagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146-5G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;trypan blue&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-2.5KG</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;NaCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, ACS, 500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#97061-566</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;Na2HPO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KH2PO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;HCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.0 mm wide trough filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FT330B</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries, 4&#34;, 1 / 0.75 OD/ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1.1 &#34;glass capillary&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5&#34;</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>LW-8148</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.2.1 &#34;single-ply task wipe&#34;); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#14140</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Graefe forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503708-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;iris scissors&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503728-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Hartman mosquito forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Non-Woven Sponges, 2&#34; x 2&#34;, 4-ply</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>#2204-c</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;non-woven gauze sponges&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503203</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;ring-tipped forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes complete, O.D. &#215; H 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3160102-12EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Petri dishes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8&#34; x 9-3/4&#34; x 5/8&#34;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B007SHGAHA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;stainless steel tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0489</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.16 &#34;tweezer-type electrodes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Foot Pedal</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0211</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.17 &#34;foot pedal&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Generator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0052</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 &#34;generator&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>#72-6468</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.4 and 4.6 &#34;nose cone&#34;, step 4.4 &#34;induction chamber&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td>
			<td>#0536108691</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.7 &#34;veterinary ophthalmic ointment&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Space Gel (AIMS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#95059-640</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.8 &#34;sealed pouch filled with supersaturated salt solution&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula</td>
			<td>Veet</td>
			<td>#062200809951</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.9 &#34;depilatory cream&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>TSP-10LKIT</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.12 &#34;sterile 10 &#181;L micropipette tip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.15 &#34;aspirator tube assembly&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27&#34;</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>MV-J397</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.19 &#34;absorbable sutures&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;LiquiVet Rapid&#8221; Tissue Adhesive</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>VG3</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.20 &#34;tissue adhesive&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;1 mL syringe&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192392-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;26G, &#189;&#8221; needle&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets Nesting Material</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>NES3600</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;nesting materials&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile</td>
			<td>Bio-Serv</td>
			<td>S5137</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;sunflower seeds&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.1.1 &#34;PFA&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#501976</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.5 &#34;tweezers&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#10752</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.8.1 &#34;agar&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edge razor blades, #9 blade</td>
			<td>Stanley Tools</td>
			<td>#11-515</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;single-edge razor blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc S D 50 mm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046327404</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;vibrating microtome specimen disc&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer tray S assembly</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#1404630132</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;buffer tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1000 S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14047235612</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;vibrating microtome&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife Holder S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046230131</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;knife holder&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0089KU6XE</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;fine tipped paintbrush&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>#71869-11</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;microscope slide&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.3-5.12.4 &#34;mountant&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS1415-10</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.4 &#34;coverslip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.13.1 &#34;DAPI&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;light microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000/C2si</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;confocal microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective, NA = 0.20</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;low-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective, NA = 0.75</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;medium-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x objective, NA = 1.40</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;high-power objective&#34;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation

遺伝子の細胞自律神経機能の損失を引き起こすことによって明らかになることやニューロンの小さく、まばらな人口の遺伝子の機能を得る。そうニューロンの損失または遺伝子の機能のゲインが遺伝的摂動組織に囲まれているモザイクを生成する必要があります。ここでは、我々 はニューロンの遺伝子の細胞の自律的機能を研究するために使用できるモザイク脳組織を生成するために子宮内でエレクトロポレーションと Cre lox 組換えシステムを組み合わせます。DNA コンストラクト (リポジトリを通じて利用可能)、蛍光ラベルと Cre リコンビナーゼのコーディングが両脇に loxP サイトで子宮を用いたマウス胚の脳における遺伝子を含む皮質ニューロンの開発に導入します。エレクトロポレーション。さらに、子宮内でエレクトロポレーション法の存続性と再現性を向上させる様々 な適応について述べる。このメソッドはまた、ニューロンのスパースまたは密な人口の Cre 介する組み換え価を確立します。ラベル付けされた脳組織の組織学的準備を必要としない (しかしに合わせることができる) の免疫組織化学。使用構造を保証する蛍光ニューロン キャリー Cre リコンビナーゼの遺伝子に分類します。組織学的準備は、アーバーの樹状突起と軸索と樹状突起スパインの共焦点イメージングによるニューロンの形態素解析を許可します。損失または利得関数のスパース モザイク組織で実現するため、このメソッドは、遺伝子製品生体内での細胞の自律的必要性の検討とを許可します。

シングルは、GFP を構築します。Cre は E15.5 で electroporated をされ、P14 の可視化 (材料の一覧を参照してください)。コンストラクトの濃度や注入量、に応じてスパースまたは高密度の結果22,26を取得できます。たとえば、2 mg/mL GFP の 1 μ l 注入。明るい (図 1 a)、および、ローカライズされた層 II/III (<strong...

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Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre リコンビナーゼを提供する子宮内エレクトロポレーションについて述べる。

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

子宮内エレクトロポレーションマウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。