Name: a simple cell-based immunofluorescence assay to detect autoantibody against the n-methyl-d-aspartate (nmda) receptor in blood
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי צ'נג קונג רפואי קרן (גרנט מספר CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ו- CMRPG3E0633).

המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים לפי Linkuo, שוויץ (102-2577A3).
1. הכנת פלסמיד ביטוי NR1-GFP
<ol><li>מיקס 10 ng של NR1-GFP פלסמיד עם 100 µL של זן תאים המוסמכת Escherichia coli DH5α ב mL 1.5 סטרילי צנטריפוגה שפופרת, pipet התערובת בעדינות למעלה ולמטה בעיות 4 - 6 פעמים, דגירה הצינ?...

<ol>
	<li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis.">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li><li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis.">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li><li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin.">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li><li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+encephalopathies.">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li><li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA+receptor+encephalitis:+diagnosis,+psychiatric+presentation,+and+treatment.">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li><li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis:+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project.">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li><li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis.">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis:+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes.">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li><li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis:+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay.">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li><li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes.">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li><li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay.">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).</li><li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+a+severe,+multistage,+treatable+disorder+presenting+with+psychosis.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li><li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease.">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li><li>J&#233;z&#233;quel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project.">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li></ol>

ישנם מספר מבוססת תא אימונולוגי מבחני למסך את הנוכחות של עצמיים כנגד קולטן NMDA שדווחו בספרות, כולל חיים מבוססת-תא immunofluorescence assay11, קבוע מבוססת-תא immunofluorescence assay9 , ואת וזמינותו מבוססי cytometry זרימה14. וזמינותו immunofluorescence מבוססת תא חי יש לבצעו מיד לאחר ההכנה של ...

דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA הינה ישות לאחרונה המחלה יכולה להתרחש אצל חולים בכל הגילאים, והוא משפיע בעיקר המטופלות1,2. . זה אחד אנצפליטיס מאובחנים לעתים קרובות ביותר בקרב מטופלים עם אטיולוגיה לא ידועה הראשונית של דלקת קרום המוח3 החולים מושפעים עם אנטי-NMDA קולטן אנצפליטיס בדרך כלל יש prodromal סימפטומים של כאב או חום, ואחריו התפתחות מהירה של התודעה רמת השינוי ומגוון רחב של סימפטומים מנוטלי חריפה, כולל עצבנות, רגזנות , חרדה, נדודי שינה, הזיות, אשליות, תוקפנות, התנהגויות מוזרות, הפרעות התנועה, dysregulation אוטונומי, ותפיסה תוקף4,5. זיהוי מוקדם של תנאי זה במועד טיפול עם חיסוני חשובים תוצאה טובה יותר, החלמה מלאה אפילו חולים מושפעת6. לפיכך, הוא הציע כי דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA צריך להיחשב אבחנה מבדלת חשוב מהחולים בדלקת חריפה או התפרצות חדשה תכונות פסיכוטיות7,8.
מלבד תכונות קליני, זיהוי של נוגדן עצמי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי-שדרתי חיונית לאבחון מדויק של אנטי-NMDA קולטן דלקת אוטואימונית9. רוב הבדיקות אימונולוגי כדי לזהות את נוגדן עצמי קולטן NMDA נגד זמינים כמה מחקר מעבדות10,11, ויש אחד בלבד זמינים מסחרית מבוססת-תא immunofluorescence assay להקרנה אנטי-NMDA קולטן עצמיים12. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה ללא צורך במיקור חוץ immunofluorescence מבוססת תא בנוחות ניתן במעבדה למסך את הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן כדי לקדם את המחקר הקליני של קולטן NMDA-נגד דלקת אוטואימונית. קולטן NMDA הוא heterotetramer יון ערוץ חלבון מורכב הביעו במפורש במוח. הוא עשוי שתי subunits NR1 חובה, ואת השילוב של subunits אחד או שניים של NR2A, NR2B, NR2C או NR2D13. מחקר קודם דיווחו כי epitope הראשי ממוקד על ידי הנוגדנים התחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR15. לפיכך, ב פרוטוקול זה, אנו מבטאים את החלבון NR1-יחידת משנה רקומביננטי האנושי של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשורת תאים אפיתל כליות עובריים אנושיים (HEK293), ולפתח assay מבוססת-תא immunofluorescence כדי לזהות מחלקת IgG של אנטי-NMDA קולטן עצמיים בדם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1</td>
			<td>Origene (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>RG219368</td>
			<td>NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV6-AC-GFP</td>
			<td>Origene (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>PS100010</td>
			<td>mammalian vector with C-terminal tGFP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen (Hilden Germany)</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose, Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)</td>
			<td>Euroimmun AG, L&#252;beck, Germany</td>
			<td>CA 112d-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euroimmun Assay Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple cell-based immunofluorescence assay to detect autoantibody against the n-methyl-d-aspartate (nmda) receptor in blood

הנוכחות של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי יכול לגרום לסימפטומים מנוטלי שונים של חולים מושפעת, כינה דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA. זיהוי נוגדן עצמי ספציפי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי שדרתי (CSF) חיונית לאבחון מדויק של מצב זה. קולטן NMDA הוא יון ערוץ חלבון מורכב המכיל ארבע subunits, כולל שני חובה NMDA קולטן יחידת משנה 1 (NR1), אחד או שניים קולטן NMDA 2A יחידה משנית (NR2A), 2B יחידת משנה של קולטן NMDA (NR2B), יחידת משנה של קולטן NMDA 2C (NR2C), או קולטן NMDA יחידת משנה 2D (NR2D). Epitope של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי נמסר להיות נוכח בכל תחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה מבוססת-תא immunofluorescence יכול לשמש כבדיקת סינון כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA בדם כדי להקל על מחקר קליני ובסיסי של דלקת אוטואימונית קולטן אנטי-NMDA.

בממוצע, אנחנו יכולים להשיג 200-300 µg ביטוי נטולת אנדוטוקסין פלסמיד NR1-GFP GFP מתרבות חיידקי 250 מ ל ביצוע הפרוצדורות המתוארות בסעיף 1 של הפרוטוקול. כמות של 100 ng/טוב של פלסמיד הביטוי שימשה תרביות תאים של תאי HEK293 תרבותי בצלחת 48-ובכן, כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. h 24-30 לאחר תרביות תאים, ה...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood at JoVE.com

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.

וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

אטריה ו בדיקות Capellini טיפול: מדדים כמותיים פשוט פונקציה של מיומנות בכפו אצל חולדות ועכברים

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

דרך פשוטה למדוד את רגישות אתנול זבובים

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...