Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

El autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) para su discusión útil. wyIs251 fue un generoso regalo del Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 fue proporcionado por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 y #16 H 06536 y Daiichi Sankyo Fundación, Brain Science Foundation y la Fundación de Naito.

1. preparación de la muestra <ol><li>generar un transgénico C. elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas 18. Por otra parte, obtener cepas adecuadas desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC). Para visualizar el transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica, utilice la línea transgénica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar el IFT, obtener la línea transgénica mnIs1...

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

Limitación con respecto a los métodos existentes El método descrito aquí está optimizado para observar eventos rápidas como transporte axonal y IFT. Así, la inmovilización se priorice más de incubación más largo. Aunque hemos podido observar eventos de tráfico por al menos 20 min sin perturbación significativa, este método no sea siempre conveniente observar eventos lentos que requieren más observaciones, como la elongación del axón y migración celular. Para más observaciones, es ne...

Proyección de imagen de células vivas es una herramienta esencial para el análisis de transporte intracelular. En biología de la célula neuronal, análisis de transporte axonal con proyección de imagen de células vivas son esenciales para la comprensión de la función y la morfogénesis neuronal1. Defectos en el transporte axonal subyacen varios neurodegenerativas trastornos2. Dynein y proteínas de Kinesin Superfamilia realicen transporte axonal anterogradely y retrogradely, respectivamente1,2.
Cilios son otro compartimento celular en el que la red de microtúbulos y tráfico de maquinaria son altamente desarrollada3. Maquinaria de síntesis de proteína no se localiza en los cilios, lo que significa que deberán transportarse ciliares proteínas desde el citoplasma a las puntas de los cilios. Cilios específicos quinesina y dineína, llamado kinesin-2 y citoplásmica dineína-2, respectivamente, el transporte de los componentes de los cilios4, en un fenómeno llamado Transporte intraflagelar (IFT)5. Deterioro de IFT causa un espectro de enfermedades llamadas ciliopathies6. Así, análisis del mecanismo IFT por proyección de imagen de células vivas es necesaria para entender los mecanismos básicos de formación ciliar y patogenia.
Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal y IFT7,8,9. Para observar el IFT, Chlamydomonas se ha utilizado ampliamente como un organismo modelo5,6. Chlamydomonas es un organismo unicelular, la relación de IFT con el envejecimiento, la función neuronal y comportamiento serían difícil de analizar. Además, no han aplicado técnicas genéticas esenciales como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. En organismos más altos del modelo, tales como ratones y Drosophila, interrupción del transporte axonal y IFT a menudo causa fenotipos letal transporte axonal y IFT son esenciales para la morfogénesis y la homeostasis de los animales 10, 11. En el caso de ratones, transfección y el cultivo celular se necesita generalmente para observar el transporte axonal y IFT, que requiere muchas habilidades y tiempo extenso12,13. Además, se puede perder mucho del contexto fisiológico importante en líneas celulares y células cultivadas. Porque el sistema nervioso no es esencial para la supervivencia de las lombrices, se interrumpen los mutantes de C. elegans transporte axonal o IFT no son a menudo letales7,9,14. Transporte axonal y IFT pueden observarse directamente en vivo sin la disección ya que C. elegans es transparente y por lo tanto es fácil observar los marcadores etiquetados de GFP.
Hay varios protocolos para inmovilizar, C. elegans, como el uso de un dispositivo de microfluidos15, cojines de agarosa con anestesia16o17de microesferas. La inclusión de la anestesia puede inhibir los trata de personas eventos en neuronas15. Un claro inconveniente del método dispositivo de microfluidos es que preparar un dispositivo de microfluidos no siempre es fácil. En cambio, inmovilización por pastillas de agarosa y microesferas es una manera conveniente y fácil para realizar imágenes de lapso de tiempo en C. elegans. Aquí describo este protocolo básico para inmovilizar C. elegans y visualizar el transporte axonal y IFT en vivo en C. elegans. En comparación con los otros métodos, el método descrito aquí no requiere equipo especial y es mucho más barato y más fácil de realizar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Transporte axonal y el Transporte intraflagelar (IFT) son esenciales para la función y la morfogénesis axon y cilios. Proteínas del superfamilia de quinesina y dineína son motores moleculares que regulan anterograde y retrógrada transporte, respectivamente. Estos motores utilizan redes de microtúbulos como rieles. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para estudiar transporte axonal y IFT en vivo. Aquí describo un protocolo para observar el transporte axonal y IFT en la vida del C. elegans. Transporte de carga puede visualizarse por selección de proteínas de carga utilizando proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans es transparente y proteínas GFP-tagged carga pueden expresarse en células específicas bajo promotores específicos de la célula. Gusanos vivos pueden ser fijos por microesferas en gel de agarosa de 10% sin matar o anestesiar los gusanos. En estas condiciones, movimiento de carga se puede observar directamente en los axones y cilios de la vida de C. elegans sin disección. Este método puede ser aplicado a la observación de cualquier molécula de carga en las células mediante la modificación de las proteínas de la blanco o las células que expresan. Proteínas básicas como motores moleculares y proteínas adaptadoras que intervienen en el transporte axonal y IFT se conservan en C. elegans. Comparado con otros organismos modelo, mutantes pueden ser obtenidos y mantiene más fácilmente en C. elegans. Combinando este método con varios mutantes de C. elegans puede aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT.

Transporte axonal de neuronas DA9 Utilizando la línea de wyIs251 , la anterógrada y el transporte axonal retrógrado de GFP::RAB-3 se puede grabar simultáneamente en la neurona de motor DA9. La velocidad media de anterograde y transporte retrógrado en el axón proximal dorsal de la neurona DA9 es aproximadamente 1,8 y 2,6 μm/s, respectivamente22. El número de vesículas móviles es 0.03 y 0.018 por μm del axón por s. Así, para ...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...