Name: percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection and cell delivery in a large preclinical model
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model at JoVE.com

Os autores agradecer Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina excelente apoio prestado durante a coleta de dados e Carlos Bueno para fornecer as células EGFP(+) HEK-293. Este trabalho foi financiado em parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, região de Múrcia, Espanha (JT) (número de concessão: 11935/PI/09); Vermelho de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de eu + D + I 2008-2011 (conceder n. RD12/0019/0001) (JMM), co-financiado com fundos estruturais da União Europeia (FEDER) (GMC); e, a Universidade de Reading, Grã-Bretanha (AG, GB) (financiamento Central). Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de ética pesquisa da Universidade de Múrcia, Espanha e foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE da Comissão Europeia. As etapas descritas foram realizadas sob protocolos operacionais padrão que faziam parte do plano de trabalho e não tem sido realizados exclusivamente com o propósito de filmar o vídeo que acompanha este livro.
1. preparação de células e o vetor de expressão dos mamíferos
<p class="jove...

O objetivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva que pode ser utilizada para a entrega de células-tronco em miocárdio de coelhos (um grande porte pré-clínicos modelo animal)17,18, enquanto aproveitando-se da utilização de um relativamente barato prontamente disponível em muitas clínicas do sistema de imagem e centros de pesquisa. Aqui, mostramos que, usando um sistema de ecocardiografia clínica, e auxiliado por InI, um agente amplam...

Terapias celulares e gene são emocionantes e sempre desenvolvendo estratégias para a regeneração/reparação de miocárdio lesionado em HFrEF. Alguns estudos compararam a eficácia (por exemplo, taxa de retenção de célula) com as diferentes rotas de entrega de celular, que têm consistentemente demonstrado a superioridade do IMI sobre rotas Intracoronário ou intravenosa1,2 , 3 , 4 , 5. assim, não é surpreendente que uma grande proporção de estudos sobre modelos translacionais de terapia com células estaminais do miocárdio lesionado, entregar o injectate através do IMI realizada sob visão direta em um peito aberto procedimento6,7 . No entanto, esta abordagem tem várias limitações, incluindo a natureza invasiva do procedimento, que acarreta o risco de mortalidade peri-processuais (muitas vezes sob-relatado)8. Além disso, um IMI sob visão direta não elimina a possibilidade de injeção inadvertida na cavidade ventricular. Na prática clínica um IMI durante a cirurgia de peito aberto pode ser um método apropriado para a entrega de célula terapêutico, por exemplo, durante a artéria coronária ignorar a cirurgia de enxerto (CABG); no entanto, esta abordagem pode não ser apropriada para a entrega de célula na cardiomiopatia global de origem não-isquêmica (por exemplo, HFrEF secundária à cardiomiopatia induzida pelo regime (AICM)).
Não há dúvida que doença isquêmica do coração (IHD) é a causa mais comum de HFrEF (~ 66%)9,10; no entanto, cardiomiopatia não-isquêmica, incluindo AICM, ainda afeta uma proporção significativa de pacientes com HFrEF (33%)9 . Com efeito, os avanços recentes em oncologia clínica resultaram em mais de 10 milhões de sobreviventes de câncer em os EUA sozinhos11, com estimativas de um número similar na Europa, consistente com uma tendência geral para a sobrevivência melhorada de pacientes com câncer12 ,13. Assim, explorando os benefícios da novela terapias tais como transplante de células estaminais para cardiomiopatia não-isquêmica, bem como a testagem de uma rota eficaz e minimamente invasiva de células-tronco de entrega é de extrema importância, dado o número crescente de pacientes afetados por cardiotoxicidade secundária a drogas anticâncer.
Digno de nota, estudos utilizando a terapia de células-tronco, com o objetivo de reparação/regenerar o miocárdio lesionado frequentemente de testes de hipóteses envolve o uso de pequenos roedores (por exemplo, ratos e ratazanas). Estes modelos, muitas vezes, exigem sistemas de ultra-som caro de alta frequência para avaliação da função miocárdica, geralmente equipada com transdutores de matriz linear que tem algumas limitações inerentes de associado (por exemplo, reverberação)14. No entanto, outros modelos tais como coelhos, representando uma grande maquete pré-clínicos, possuem algumas vantagens para testar a hipótese de terapias de células-tronco em HFrEF. Assim, em contraste com ratos e camundongos, coelhos mantêm um sistema de transporte do Ca+ 2 e Eletrofisiologia celular que se assemelha ao de seres humanos e outros animais de grande porte (por exemplo, cães e porcos)15,16,17 ,18,19. Outra vantagem, é a sua acessibilidade para ultrassom cardíaco de imagem usando relativamente barato e sistemas amplamente disponível ecocardiografia clínica equipados com transdutores array fase relativamente alta frequência, por exemplo, 12 MHz, tais como aqueles usados frequentemente em Cardiologia Pediátrica e neonatal. Estes sistemas permitem excelente imagem ecocardiográfica com tecnologia de ponta, e eles se aproveitam da superioridade da harmônica de imagem20. Além disso, testes de hipóteses extensa do potencial de terapias regenerativas cardíacas (por exemplo, terapia de células-tronco), sua segurança, eficácia, cardiomyogenic potencial, bem como avaliação do destino do injectate uma vez entregaram para o miocárdio, é obrigatório antes de eles podem ser considerados para uso humano, e eles exigem o uso de modelos animais pré-clínicos grandes, tais como o coelho17,19. Aqui, descrevemos uma técnica minimamente invasiva para a entrega do celular através do IMI de contraste-ecocardiografia percutânea guiada usando um sistema de ecocardiografia clínica, que se destina na terapia baseada em transplante de células-tronco para cardiomiopatia não-isquêmica20 . Descrevemos também os benefícios da tinta nanquim (InI, também conhecida como tinta de China) como um traçador ultra-som de agente e em situ de contraste da injectate no centro de coelho.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">HD11 XE Ultrasound System</td>
			<td style="width:131px;">Philips</td>
			<td style="width:183px;">10670267</td>
			<td style="width:259px;">Echocardiography system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">S12-4</td>
			<td style="width:131px;">Philips</td>
			<td style="width:183px;">B01YgG</td>
			<td>4-12 MHz phase array transducer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)</td>
			<td style="width:131px;">Parket laboratories Inc</td>
			<td style="width:183px;">N 01-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vasovet 24G</td>
			<td style="width:131px;">Braun</td>
			<td style="width:183px;">REF 381212</td>
			<td>&#160;over-the-needle catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnifix-F 1 ml syringe</td>
			<td style="width:131px;">Braun</td>
			<td style="width:183px;">9161406V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imalgene (Ketamine)</td>
			<td style="width:131px;">Merial</td>
			<td style="width:183px;">RN 9767</td>
			<td>Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Domtor (Medetomidine)</td>
			<td style="width:131px;">Esteve</td>
			<td style="width:183px;">CN 570686.3</td>
			<td>Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Faber-Castel TG1</td>
			<td style="width:131px;">Faber-Castel</td>
			<td style="width:183px;">16 33 99</td>
			<td style="width:259px;">India (China) Ink</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Holter Syneflash</td>
			<td style="width:131px;">Ela medical</td>
			<td style="width:183px;">SF0003044S</td>
			<td style="width:259px;">24 h Holter ECG system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Electrodes Blue Sensor&#174;</td>
			<td style="width:131px;">Ambu (NUMED)</td>
			<td style="width:183px;">VLC-00-S</td>
			<td style="width:259px;">Holter ECG electrodes.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:319px;">Microtome</td>
			<td style="width:131px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:183px;">RM2155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Olimpus</td>
			<td style="width:183px;">CO11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">ABC Vector Elite</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:183px;">PK-6200</td>
			<td>Avidin Biotin Complex Kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chicken anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;">A10262</td>
			<td>Primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:183px;">BA-9010</td>
			<td>Secondary Antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
			<td style="width:131px;">DAKO (Agilent)</td>
			<td style="width:183px;">S3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss 
			MicroImaging</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss AX10 Axioskop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Holter ECG</td>
			<td>Elamedical</td>
			<td>Syneflash SF0003044S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10% fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:131px;">Calbiochem (MERCK)</td>
			<td style="width:183px;">400051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Xylene (histological)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">X3S-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Pronase</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">53-702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection and cell delivery in a large preclinical model

Terapia celular e gene são emocionantes e reduziram de promissoras para efeitos de regeneração cardíaca no cenário de insuficiência cardíaca com fração de ejeção (HFrEF). Antes que possam ser considerados para uso e implementados nos seres humanos, estudos pré-clínicos extensivos são necessárias em grandes modelos animais para avaliar a segurança, eficácia e destino do injectate (por exemplo, as células-tronco), uma vez entregado para o miocárdio. Pequenos roedores modelos oferecem vantagens (por exemplo, custo-eficácia, acessibilidade para manipulação genética); no entanto, tendo em conta as limitações inerentes destes modelos, estas conclusões raramente traduzem para a clínica. Por outro lado, grandes modelos animais como coelhos, têm vantagens (por exemplo, eletrofisiologia cardíaca semelhante em relação aos seres humanos e outros animais de grandes porte), mantendo um bom equilíbrio de custo-benefício. Aqui, demonstramos como executar uma técnica de injeção (IMI) contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica, que é minimamente invasiva, segura, bem tolerada e muito eficaz na entrega alvo de injectates, incluindo as células, em vários locais dentro do miocárdio de um modelo de coelho. Para a execução desta técnica, podemos também aproveitaram de um sistema de ecocardiografia clínica amplamente disponível. Depois de colocar em prática o protocolo descrito aqui, um pesquisador com conhecimento básico de ultra-som irá tornar-se competente no desempenho desta técnica minimamente invasiva e versátil para uso rotineiro em experiências, destinadas a testes de hipóteses do capacidades de terapêuticas regenerativas cardíaca no modelo de coelho. Uma vez que a competência é alcançada, todo o processo pode ser realizado em 25 min depois anestesiando o coelho.

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com InI:
Usando o protocolo descrito acima, e uma vez que o posicionamento ideal da ponta da agulha foi confirmado pela ecocardiografia e iniciada a injeção, transmural hyperechogenicity foi observada durante a entrega do InI (10% v/v na PBS) (Figura 2E) , bem como logo após o IMI para a região de destino (<strong class="x...

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Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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