Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Karolinska Instituut, het kroonprinses Margareta van Stichting voor de slechtzienden, de Stichting Jordanië Edwin voor uitgevoerd oftalmologisch onderzoek, de Zweedse Eye Foundation, de koning Gustav V Foundation, de ARMEC Lindeberg Foundation, en de Cronqvist Foundation.

Het volgende protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van Karolinska Instituet. Alle dierproeven met behulp van Nieuw-Zeeland albino konijnen (Tabel of Materials) zijn goedgekeurd door het Comité regionale dierenethiek (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (toestaan: dnr 56/15). Het gebruik van hESC (dnr 2011/745-31/3) en de overdracht en de manipulatie van hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) is ook in overeenstemming met de Zweedse wet- en regelgeving van het Karolinska Institutet, en is goedge...

<ol>
	<li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model.">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li><li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit.">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li><li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy.">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li><li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation.">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li><li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats.">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li><li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE:+anatomy+of+cell+genesis,+expansion+and+retinal+transplantation.">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schematic+eye+for+the+rabbit.">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li><li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+retinal+injury.">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li></ol>

In dit protocol, wordt de generatie van een grote-eyed model van GA en het preklinische gebruik voor het evalueren van hESC-RPE integratie in vivo beschreven.
Vertaling van regeneratieve therapieën voor GA en de verwante ziekten in de kliniek7is het belangrijk te ontwikkelen en optimaliseren van methoden die getrouw de klinische methoden voor transplantatie en beeldbewerking vangen. Het konijn is in dit aantrekkelijke aspect: het heeft een relatief grote oog d...

Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed preklinische model van geografische atrofie (GA), waarmee de evaluatie van de integratie van getransplanteerde hESC-RPE in de subretinal ruimte. De in detail hier beschreven methoden zijn gebruikt in 3 recente publicaties die aantonen de productie van een verrijkte, zuivere en functionele bevolking van RPE cellen van hESC1, evenals de oprichting van buitenste retinale schade en een GA-achtige fenotype dat veroorzaakt door subretinal injectie van fysiologische zoutoplossingen (d.w.z., BSS en PBS) of NaIO3 in de konijn eye2,3. We verder aangetoond dat sub retinale schorsing transplantaties van hESC-RPE uitgebreide functionele monolayers met fotoreceptor redding capaciteit2vormen.
Verschillende voordelen vergezeld gaan van het gebruik van het konijn-oog voor de generatie van een GA model van ziekte. Ten eerste, de grootte van het konijn oog, die is 70% van het volume van een volwassen menselijk oog, kan klinisch zinvolle transplantatie met behulp van een celdichtheid die veel lager is dan routinematig gebruikt in kleine knaagdieren ogen (1000 cellen/µL vs. 50.000 cellen/µL)4 , 5. ten tweede chirurgie bij knaagdieren is meestal transscleral via het vaatvlies, die het netvlies barrière in het gedrang brengt en potentieel triggers een ontstekingsreactie en een mogelijke afwijzing6. Beide factoren leiden samen tot multilayering en samendoen van getransplanteerde cellen, en een over het algemeen slechte integratie van de getransplanteerde cellen in een verstoorde inheemse retinale weefsel. Echter kunt het grote-eyed konijn model uitvoeren van een chirurgische techniek met instrumentatie identiek aan een klinische setting. Ten derde, een grote-eyed model tevens in staat hoge resolutie in vivo imaging en bewaking van de getransplanteerde cellen en het bovenliggende netvlies door tijd1,2,3. Dus beschrijven we een klinisch relevante en kosten-efficiënte preklinische model dat een aantrekkelijk alternatief voor knaagdieren voor iedereen met een interesse in onderzoek van het netvlies van normale en zieke en de sub retinale ruimte moet.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >NutriStem hESC XF differentiation medium &#8211;bFGF and &#8211;TGFb</td>
			<td >Biological Industries</td>
			<td >06-5100-01-1A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TrypLE Select 1x</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >12563-011</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td >VWR</td>
			<td >732-2757</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30g 0.5&#8217;&#8217;; 0.3 x 13mm</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >304827</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrodisc 25mm Syringe Filter</td>
			<td >Acrodisc</td>
			<td >PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4 % trypan blue</td>
			<td >ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Use at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaIO3</td>
			<td >Sigma-Aldrich Corp</td>
			<td>S4007</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSS</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >65079550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% Ethanol</td>
			<td >Solveco AB</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketaminol, 100 mg/mL</td>
			<td >Intervet, Boxmeer</td>
			<td >511519</td>
			<td >Use 35 mg/kg ketamine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rompun vet, 20 mg/mL</td>
			<td >Bayer Animal Health</td>
			<td >22545</td>
			<td >Use 5 mg/kg xylazine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triescence, 40 mg/mL</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >412915</td>
			<td >2 mg intraviterial</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5%</td>
			<td >APL</td>
			<td >321968</td>
			<td >Use 1 drop in each eye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Viscotears</td>
			<td>Laboratoires Th&#233;a</td>
			<td >597562</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Topical saline</td>
			<td >Apotea AB</td>
			<td>7053249369080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Allfatal vet. 100 mg/mL</td>
			<td >Omnidea</td>
			<td>77168</td>
			<td >Use 100 mg/mL pentobarbital</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extension tube (Hammer)</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3223</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25G/38G polytip subretinal cannula</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3219</td>
			<td >25G/38G</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Flat Lens</td>
			<td >Volk</td>
			<td >#VWFD10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Barraquer Colibri lid retractor</td>
			<td >AgnTho&#39;s AB</td>
			<td >42-020-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-valved trocars</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td>8065751448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clawed forceps</td>
			<td >Bausch &#38; Lomb Nordic AB</td>
			<td >ET1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065740238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065751493</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-OCT device</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+OCT</td>
			<td>Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 well plates</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer hemocytometer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >New Zealand albino rabbits</td>
			<td>Lidk&#246;pings Rabbit Farm, Sweden</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC-RPE cells</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>See reference number 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy

Geografische atrofie (GA), het late stadium van droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie wordt gekenmerkt door verlies van de retinale pigment epitheliale (RPE) laag, die tot verdere ontaarding van vitale retinale structuren (bijvoorbeeld, researchdieren leidt) veroorzaken ernstige visie bijzondere waardevermindering. Evenzo wordt RPE-verlies en daling van de gezichtsscherpte gezien in de lange termijn volgen omhoog van patiënten met geavanceerde natte leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die intravitreal anti-vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Dus, aan de ene kant, het is van fundamenteel belang voor het efficiënt afleiden RPE cellen uit een oneindige bron, die als substitutietherapie dienen kunnen. Aan de andere kant, het is belangrijk om te evalueren van het gedrag en de integratie van de afgeleide cellen in een model van de ziekte met als gevolg dat chirurgische en beeldvormende methoden als dicht mogelijk bij die worden toegepast bij de mens. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol op basis van onze eerdere publicaties die beschrijft de generatie van een preklinische model voor GA met behulp van het albino konijn oog, voor de evaluatie van de menselijke embryonale stamcellen afgeleid retinale pigment epitheliale cellen (hESC-RPE) in een klinisch relevante instelling. Gedifferentieerde hESC-RPE in naïef ogen of ogen met NaIO3worden getransplanteerd-geïnduceerde GA-achtige Retina degeneratie met behulp van een techniek met 25 G transvitreal pars plana. Beoordeling van gedegenereerd en getransplanteerde gebieden is uitgevoerd door multimodale high-resolution niet-invasieve real-time imaging.

Vertegenwoordiger in vivo afbeeldingen van BAF, IR-cSLO en SD-LGO van een normale albino konijn netvlies zijn afgebeeld in Figuur 2. Opmerking de verschillende retinale lagen met hun kenmerkende licht reflectie gevangen genomen door de SD-OCT-instrument.
In de figuren 1A en figuur 1B, de setup te creëren sub retinale blebs wordt g...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy at JoVE.com

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Tracheotomie: een methode voor de transplantatie van stamcellen voor de Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantatie van menselijke stamcellen in het kippenembryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...