Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Karolinska-Institut, die Kronprinzessin Margareta Stiftung für Sehgeschädigte, Edwin Jordan Foundation für ophthalmologische Forschung, die schwedische Eye Foundation, der König Gustav V Foundation, der ARMEC Lindeberg Stiftung und die Stiftung Cronqvist.

Das folgende Protokoll folgt die Tierbetreuung Richtlinien des Karolinska Instituet. Alle Tierversuche mit Neuseeland Albino Kaninchen (Table of Materials) von der regionalen Tier Ethikkommission (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) genehmigt worden (zulassen: Dnr 56/15). Die Verwendung von hESC (Dnr 2011/745-31/3) und die Übertragung und Bearbeitung von hESC-RPE (Dnr 2013/813-31/2) steht auch im Einklang mit den schwedischen Gesetzen und Vorschriften des Karolinska Institutet und genehmigt wur...

<ol>
	<li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model.">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li><li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit.">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li><li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy.">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li><li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation.">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li><li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats.">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li><li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE:+anatomy+of+cell+genesis,+expansion+and+retinal+transplantation.">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schematic+eye+for+the+rabbit.">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li><li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+retinal+injury.">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li></ol>

In diesem Protokoll wird die Generation eines großen Augen Modells der GA und den präklinischen Einsatz für die Bewertung der hESC-RPE Integration in Vivo beschrieben.
Für die Übersetzung der regenerative Therapien für GA und damit verbundenen Krankheiten in die Klinik-7ist es wichtig, Entwicklung und Optimierung von Methoden, die die klinischen Methoden für Transplantation und Imaging treu zu erfassen. Das Kaninchen ist in dieser Hinsicht attraktiv: Es ...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen präklinischen Modell der geografischen Atrophie (GA), die die Auswertung der Integration von transplantierten hESC-RPE in den subretinalen Raum ermöglicht. Die hier ausführlich beschriebenen Methoden wurden in 3 neueren Publikationen verwendet, die die Produktion einer angereicherten, rein und funktionale Bevölkerung von RPE-Zellen aus hESC1sowie die Schaffung der äußeren Netzhaut Schaden und ein GA-ähnlichen Phänotyp zeigen induziert durch die subretinale Injektion von physiologischen Salzlösungen (d.h., BSS und PBS) oder NaIO3 im Kaninchen Auge2,3. Wir zeigten weiter, dass subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE umfangreiche funktionale Monolagen mit Photorezeptor Rettung Kapazität2 bilden.
Mehrere Vorteile begleiten den Einsatz von Kaninchenauge zur Erzeugung von einem GA-Modell der Krankheit. Erstens, die Größe der Kaninchenauge, die 70 % das Volumen eines Erwachsenen menschlichen Auges, können klinisch bedeutsamen Transplantation mit einer Zelldichte, die viel niedriger als in kleinen Nagetier Augen (1.000 Zellen/µL vs. 50.000 Zellen/µL)4 routinemäßig eingesetzt , 5. Zweitens Chirurgie bei Nagetieren ist in der Regel Transscleral durch die Aderhaut, die Kompromisse der retinalen-Schranke und potenziell löst eine Entzündungsreaktion und eine mögliche Ablehnung-6. Beide Faktoren können zu Ölpauseverfahren und Verklumpung der transplantierten Zellen und einer insgesamt schlechten Integration der transplantierten Zellen in einem gestörten native Netzhautgewebe zusammen führen. Die großen Augen Kaninchen-Modell ermöglicht jedoch eine Operationstechnik mit Instrumentierung identisch mit einer klinischen Umgebung durchführen. Drittens ermöglicht eine große-Augen-Modell auch mit hoher Auflösung in Vivo imaging und Überwachung der transplantierten Zellen und der darüberliegenden Netzhaut durch Zeit1,2,3. So beschreiben wir eine klinisch relevante und kosteneffiziente präklinische Modell, die eine attraktive Alternative zu Nagetiere für jedermann mit einem Interesse in der Forschung der normalen und krankhaften Netzhaut und subretinalen Raum sein sollte.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >NutriStem hESC XF differentiation medium &#8211;bFGF and &#8211;TGFb</td>
			<td >Biological Industries</td>
			<td >06-5100-01-1A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TrypLE Select 1x</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >12563-011</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td >VWR</td>
			<td >732-2757</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30g 0.5&#8217;&#8217;; 0.3 x 13mm</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >304827</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrodisc 25mm Syringe Filter</td>
			<td >Acrodisc</td>
			<td >PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4 % trypan blue</td>
			<td >ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Use at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaIO3</td>
			<td >Sigma-Aldrich Corp</td>
			<td>S4007</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSS</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >65079550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% Ethanol</td>
			<td >Solveco AB</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketaminol, 100 mg/mL</td>
			<td >Intervet, Boxmeer</td>
			<td >511519</td>
			<td >Use 35 mg/kg ketamine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rompun vet, 20 mg/mL</td>
			<td >Bayer Animal Health</td>
			<td >22545</td>
			<td >Use 5 mg/kg xylazine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triescence, 40 mg/mL</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >412915</td>
			<td >2 mg intraviterial</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5%</td>
			<td >APL</td>
			<td >321968</td>
			<td >Use 1 drop in each eye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Viscotears</td>
			<td>Laboratoires Th&#233;a</td>
			<td >597562</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Topical saline</td>
			<td >Apotea AB</td>
			<td>7053249369080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Allfatal vet. 100 mg/mL</td>
			<td >Omnidea</td>
			<td>77168</td>
			<td >Use 100 mg/mL pentobarbital</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extension tube (Hammer)</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3223</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25G/38G polytip subretinal cannula</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3219</td>
			<td >25G/38G</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Flat Lens</td>
			<td >Volk</td>
			<td >#VWFD10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Barraquer Colibri lid retractor</td>
			<td >AgnTho&#39;s AB</td>
			<td >42-020-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-valved trocars</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td>8065751448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clawed forceps</td>
			<td >Bausch &#38; Lomb Nordic AB</td>
			<td >ET1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065740238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065751493</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-OCT device</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+OCT</td>
			<td>Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 well plates</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer hemocytometer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >New Zealand albino rabbits</td>
			<td>Lidk&#246;pings Rabbit Farm, Sweden</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC-RPE cells</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>See reference number 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy

Geografischen Atrophie (GA), die späte Phase der trockene altersbedingte Makuladegeneration zeichnet sich durch Verlust der retinalen Pigment (RPE) Epithelschicht, führt zu einer nachfolgenden Degeneration des lebenswichtigen retinalen Strukturen (z.B. Photorezeptoren) verursacht schwere Sehbehinderung. Ebenso ist RPE-Verlust und Abnahme der Sehschärfe in langfristigen Folgen oben gesehen von Patienten mit fortgeschrittenen Feuchte altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die intravitreale Anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) Behandlung. Daher ist es auf der einen Seite grundlegende effizient RPE-Zellen aus einer unbegrenzten Quelle abgeleitet, die als Ersatz-Therapie dienen könnte. Auf der anderen Seite, es ist wichtig, das Verhalten und die Integration der abgeleiteten Zellen in einem Modell der Krankheit mit chirurgischen bewerten und bildgebende Verfahren wie nah wie möglich an die beim Menschen angewendet. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll basierend auf unseren bisherigen Veröffentlichungen, die die Generation der präklinischen Modell GA beschreibt mit Albino Kaninchenauge für Bewertung der menschlichen embryonalen Stammzellen retinalen Pigment Epithelzellen (hESC-RPE) abgeleitet in eine klinisch relevante Einstellung. Differenzierte hESC-RPE werden verpflanzt in naiven Augen oder mit NaIO3-GA-Like Netzhautdegeneration mit einer 25 G Transvitreal Pars Plana Technik induziert. Bewertung der degenerierten und transplantierten Gebieten erfolgt durch multimodale hochauflösende nichtinvasive Echtzeit-Bildgebung.

Vertreter in Vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT der normalen Albino Kaninchen Netzhaut sind in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie die verschiedenen Schichten der Netzhaut mit ihrer markanten Ebenen der Lichtreflexion von der SD-OCT Instrument erfasst.
In Abbildungen 1A und 1 b Abbildung, wird das Setup erstellen subretinalen...

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Tracheotomie: Eine Methode zur Transplantation von Stammzellen in die Lunge

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantation von menschlichen Stammzellen in die Hühnerembryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...