Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממכון קרולינסקה הרישמי של Margareta נסיכת הכתר לקויי ראייה, הקרן ירדן אדווין מחקר Ophthalmological, קרן עין שוודית, קרן המלך גוסטב החמישי, את ARMEC Lindeberg קרן, קרן cronqvist ב.

להלן כללי התנהגות בעקבות הנחיות טיפול בבעלי חיים קרולינסקה Instituet. כל הניסויים באמצעות ניו זילנד לבקן ארנבים (טבלה של חומרים) אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים אזוריות (ל"ואסה Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (היתר: להחיות 56/15). השימוש hESC (לא להחיות 2011/745-31/3) ואת העברת מניפולציה של hESC-RPE (לא להחיות 2013...

<ol>
	<li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model.">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li><li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit.">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li><li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy.">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li><li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation.">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li><li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats.">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li><li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE:+anatomy+of+cell+genesis,+expansion+and+retinal+transplantation.">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schematic+eye+for+the+rabbit.">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li><li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+retinal+injury.">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li></ol>

ב פרוטוקול זה, מתואר הדור של מודל גדול-עיניים של GA ושימוש בו פרה להערכת hESC-RPE אינטגרציה ויוו .
לתרגום של טיפולים משובי עבור GA ומחלות קשורות לתוך המרפאה7, חשוב לפתח, לייעל שיטות בנאמנות ללכוד שיטות קליניות השתלת והדמיה. הארנב הוא בהיבט הזה אטרקטיבי: יש לו עין ג?...

פרוטוקול זה מתאר את הדור של דגם פרה עם עיניים גדולות של אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי) המאפשר את ההערכה של אינטגרציה של hESC-RPE המושתלים במרחב subretinal. השתמשו בשיטות המתוארות כאן בפירוט בפרסומים האחרונים 3 הממחישים את הייצור של אוכלוסיה מועשר, טהור, פונקציונלי תאי RPE hESC1, כמו גם היצירה של נזק הרשתית החיצונית הפנוטיפ GA דמוי המושרה על ידי הזרקה subretinal של פתרונות מלח הפיזיולוגיות (קרי, BSS ו- PBS) או NaIO3 הארנב עיניים2,3. אנחנו עוד הוכיח כי ההשעיה תת ברשתית השתלות של hESC-RPE טופס monolayers תפקודית מקיפה עם קולט אור הצלה קיבולת2.
מספר יתרונות מלווים את השימוש של העין ארנב לדור של דגם GA של המחלה. קודם כל, הגודל של העין ארנב, אשר הוא 70% הנפח של עין אנושיים בוגרים, מאפשר השתלת משמעותיים קלינית באמצעות צפיפות התאים כי הוא נמוך בהרבה מאשר בשימוש שגרתי עיניים קטנות מכרסמים (1,000 תאים/µL נ' 50,000 תאים/µL)4 , 5. שנית, ניתוח בחולדות הוא בדרך כלל transscleral דרך דמית, אשר פוגעת המכשול ברשתית, שעשוי להיות מפעיל לתגובה דלקתית, דחייה אפשרית6. שני גורמים ביחד עלול להוביל multilayering הצליעה של התאים המושתלים, ושילוב כללי ירוד של התאים המושתלים ברקמת הרשתית יליד שיבשו. עם זאת, המודל ארנב גדול-עיניים מאפשר ביצוע טכניקה כירורגית עם מכשור זהה להגדרה הקלינית. שלישית, מודל עם עיניים גדולות מאפשרת גם ברזולוציה גבוהה ויוו הדמיה וניטור של התאים המושתלים, הרשתית שמעליה עד זמן1,2,3. לפיכך, אנו מתארים דגם פרה קליניות הרלוונטיים, חסכוניים שאמורים להיות חלופה אטרקטיבית מכרסמים לכל בעל עניין במחקר של הרשתית נורמלי וחולים ובשטח תת ברשתית.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >NutriStem hESC XF differentiation medium &#8211;bFGF and &#8211;TGFb</td>
			<td >Biological Industries</td>
			<td >06-5100-01-1A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TrypLE Select 1x</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >12563-011</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td >VWR</td>
			<td >732-2757</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30g 0.5&#8217;&#8217;; 0.3 x 13mm</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >304827</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrodisc 25mm Syringe Filter</td>
			<td >Acrodisc</td>
			<td >PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4 % trypan blue</td>
			<td >ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Use at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaIO3</td>
			<td >Sigma-Aldrich Corp</td>
			<td>S4007</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSS</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >65079550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% Ethanol</td>
			<td >Solveco AB</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketaminol, 100 mg/mL</td>
			<td >Intervet, Boxmeer</td>
			<td >511519</td>
			<td >Use 35 mg/kg ketamine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rompun vet, 20 mg/mL</td>
			<td >Bayer Animal Health</td>
			<td >22545</td>
			<td >Use 5 mg/kg xylazine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triescence, 40 mg/mL</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >412915</td>
			<td >2 mg intraviterial</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5%</td>
			<td >APL</td>
			<td >321968</td>
			<td >Use 1 drop in each eye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Viscotears</td>
			<td>Laboratoires Th&#233;a</td>
			<td >597562</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Topical saline</td>
			<td >Apotea AB</td>
			<td>7053249369080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Allfatal vet. 100 mg/mL</td>
			<td >Omnidea</td>
			<td>77168</td>
			<td >Use 100 mg/mL pentobarbital</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extension tube (Hammer)</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3223</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25G/38G polytip subretinal cannula</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3219</td>
			<td >25G/38G</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Flat Lens</td>
			<td >Volk</td>
			<td >#VWFD10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Barraquer Colibri lid retractor</td>
			<td >AgnTho&#39;s AB</td>
			<td >42-020-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-valved trocars</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td>8065751448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clawed forceps</td>
			<td >Bausch &#38; Lomb Nordic AB</td>
			<td >ET1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065740238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065751493</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-OCT device</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+OCT</td>
			<td>Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 well plates</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer hemocytometer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >New Zealand albino rabbits</td>
			<td>Lidk&#246;pings Rabbit Farm, Sweden</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC-RPE cells</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>See reference number 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy

אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי), בשלב מאוחר של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש מאופיין על ידי אובדן הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) השכבה, מה שמוביל ניוון עוקבות של מבנים חיוניים ברשתית (למשל, photoreceptors) גורם ליקוי ראייה חמור. באופן דומה, RPE- ואובדן של ירידה חדות הראייה נתפסת ב מעקב ארוך טווח למעלה של חולים עם מתקדמות הקשורות לגיל ניוון מקולרי רטוב (AMD) טיפול אנטי-כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) intravitreal. לכן, מצד אחד, זה היסוד להפיק ביעילות תאי RPE ממקור בלתי מוגבל העשויה לשמש כטיפול חלופי. מצד שני, זה חשוב להעריך את התנהגות ושילוב של התאים נגזר במודל של המחלה פרוגרמה כירורגי, שיטות הדמיה כמו קרוב ככל האפשר לאלה חלה אצל בני אדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המבוסס על פרסומים קודמים המתארת את הדור של דגם פרה של GA באמצעות העין ארנב לבקן, עבור הערכה של תאי גזע עובריים אדם נגזר בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (hESC-RPE) ב ההגדרה הרלוונטית קלינית. HESC הבדיל-RPE מושתלים לתוך העיניים תמים או עיניים עם NaIO3-induced GA כמו ניוון הרשתית בטכניקה 25 גרם transvitreal pars plana. הערכה של אזורי מנוונת המושתלים מתבצע על ידי עם מודאלים מרובים ברזולוציה גבוהה הדמיה בזמן אמת לא פולשנית.

נציג ויוו תמונות של BAF, IR-cSLO ו- SD-אוקטובר של הרשתית ארנב רגיל לבקן מוצגים באיור2. שימו לב לשכבות הרשתית השונות עם רמות ייחודי של השתקפות אור שנתפסו על ידי המכשיר SD-אוקטובר.
דמויות 1A , איור 1B</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy at JoVE.com

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

הקנה: שיטה להשתלת בתאי גזע כדי ריאות

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Generation of Human CD40-activated B cells

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...