Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00
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Este estudio fue apoyado por becas del Instituto Karolinska, Fundación del Crown Princess Margareta para invidentes, la Fundación de investigación oftalmológica, el rey Gustav V Foundation, la Fundación sueca de ojo, el ARMEC Edwin Jordan Fundación de Lindeberg y la Fundación Cronqvist.

El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Karolinska Instituet. Los experimentos en animales utilizando conejos albinos de Nueva Zelanda (Tabla de materiales) han sido aprobados por el Comité de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permiso: dnr 56/15). El uso de hESCs (dnr 2011/745-31/3) y la transferencia y manipulación de células-RPE (dnr 2013/813-31/2) es también conforme a la legislación sueca y las regulaciones del Karolinska Institut...

<ol>
	<li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model.">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li><li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit.">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li><li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy.">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li><li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation.">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li><li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats.">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li><li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE:+anatomy+of+cell+genesis,+expansion+and+retinal+transplantation.">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schematic+eye+for+the+rabbit.">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li><li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+retinal+injury.">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li></ol>

En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .
Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica7, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente gr...

Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs1, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO3 en el conejo ojo2,3. Hemos demostrado además que trasplantes de sub-retinal de la suspensión de células RPE forman monocapas funcionales extensa con fotorreceptor rescate capacidad2.
Varias ventajas acompañarán el uso del ojo del conejo para la generación de un modelo de GA de la enfermedad. En primer lugar, el tamaño del ojo del conejo, que es el 70% del volumen de un ojo humano adulto, permite trasplante clínicamente significativo con una densidad celular que es mucho más baja que utiliza habitualmente en ojos pequeños roedores (1.000 células/μl frente a 50.000 células/μl)4 , 5. en segundo lugar, la cirugía en roedores suele transscleral a través de la coroides, que compromete la barrera retiniana y potencialmente desencadena una respuesta inflamatoria y un posible rechazo6. Ambos factores juntos pueden conducir a multilayering y aglutinación de las células trasplantadas y una integración general deficiente de las células trasplantadas en un tejido retiniano nativa interrumpido. Sin embargo, el modelo de conejo grande-eyed permite la realización de una técnica quirúrgica con instrumentación idéntica a un ajuste clínico. En tercer lugar, un modelo de grandes ojos también permite alta resolución en vivo la proyección de imagen y control de las células trasplantadas y la retina suprayacente al tiempo1,2,3. Así, describimos un modelo preclínico clínico relevante y rentable que debe ser una alternativa atractiva a los roedores para cualquier persona con un interés en la investigación de la retina normal y enferma y el espacio sub-retinal.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >NutriStem hESC XF differentiation medium &#8211;bFGF and &#8211;TGFb</td>
			<td >Biological Industries</td>
			<td >06-5100-01-1A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TrypLE Select 1x</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >12563-011</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td >Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td >VWR</td>
			<td >732-2757</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30g 0.5&#8217;&#8217;; 0.3 x 13mm</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >304827</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrodisc 25mm Syringe Filter</td>
			<td >Acrodisc</td>
			<td >PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4 % trypan blue</td>
			<td >ThermoFisher Scientific Corp</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Use at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaIO3</td>
			<td >Sigma-Aldrich Corp</td>
			<td>S4007</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSS</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >65079550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70% Ethanol</td>
			<td >Solveco AB</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketaminol, 100 mg/mL</td>
			<td >Intervet, Boxmeer</td>
			<td >511519</td>
			<td >Use 35 mg/kg ketamine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rompun vet, 20 mg/mL</td>
			<td >Bayer Animal Health</td>
			<td >22545</td>
			<td >Use 5 mg/kg xylazine</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triescence, 40 mg/mL</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >412915</td>
			<td >2 mg intraviterial</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5%</td>
			<td >APL</td>
			<td >321968</td>
			<td >Use 1 drop in each eye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Viscotears</td>
			<td>Laboratoires Th&#233;a</td>
			<td >597562</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Topical saline</td>
			<td >Apotea AB</td>
			<td>7053249369080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Allfatal vet. 100 mg/mL</td>
			<td >Omnidea</td>
			<td>77168</td>
			<td >Use 100 mg/mL pentobarbital</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extension tube (Hammer)</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3223</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25G/38G polytip subretinal cannula</td>
			<td >MedOne Surgical Inc</td>
			<td >3219</td>
			<td >25G/38G</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Use Flat Lens</td>
			<td >Volk</td>
			<td >#VWFD10</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Barraquer Colibri lid retractor</td>
			<td >AgnTho&#39;s AB</td>
			<td >42-020-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-valved trocars</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td>8065751448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clawed forceps</td>
			<td >Bausch &#38; Lomb Nordic AB</td>
			<td >ET1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065740238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak</td>
			<td >Alcon Nordic A/S</td>
			<td >8065751493</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-OCT device</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+OCT</td>
			<td>Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 well plates</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer hemocytometer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >New Zealand albino rabbits</td>
			<td>Lidk&#246;pings Rabbit Farm, Sweden</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hESC-RPE cells</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>See reference number 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived-retinal pigment epithelial cells into a large-eyed model of geographic atrophy

Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO3-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.

Representante en vivo imágenes de BAF, cSLO IR y SD-OCT de una retina de conejo albino normal se muestran en la figura 2. Tenga en cuenta las diferentes capas retinianas con sus distintivos niveles de reflexión de la luz capturada por el instrumento de la SD-OCT.
En las figuras 1A y 1B de la figura, se ilustra la configuración p...

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Traqueotomía: Un método para el trasplante de células madre para el pulmón

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Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

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Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

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Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

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Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

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The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...