Name: a protocol for real-time 3d single particle tracking
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health award nummer R35GM124868 och av Duke University.

1. Konfigurera Layout och anpassning
<ol>
	<li>Installation och collimationen av spårning magnetiseringen laser<ol>
		<li>Anbringa lasern till tabellen optiska använder en hembyggda mount. Fästet är en enkel aluminiumplåt med monteringshål för laserhuvudet och tabellen optiska. Lasern ska sättas fast ett metallfäste för stabilitet och värmeavledning. För detta arbete, använda en 488 nm halvledar-laser för belysning (figur 1), även om våglängden kan väljas för att passa e...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Även om många sorter av 3D enda partikel spårning metoder har dykt upp under de senaste åren, är robust realtidsspårning av hög hastighet 3D diffusion på låg fotonen räkna priser med en enkel inställning fortfarande en utmaning, vilket begränsar dess tillämpning på viktiga biologiska problem. 3D-DyPLoT metoden beskrivs i detta protokolladresser dessa utmaningar i en flera sätt. Först, excitation och upptäckt vägar förenklas avsevärt jämfört med andra implementeringar som gör anpassningen enkel och ...

Uppkomsten av avancerade bildgivande tekniker har öppnat ett fönster för att se allt mer detaljerad struktur av cellulära fenomen, ända ner till molekylnivå. Metoder såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)1,2,3, Foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (PALM)4,5,6,7 , strukturerade belysningen mikroskopi (SIM)8,9,10,11och stimulerat utsläpp utarmning mikroskopi (STED)12,13, 14 har gått långt utöver den diffraktionsgränsen att leverera oöverträffad detaljrikedom i struktur och funktion av levande celler. Fullständig förståelse av hur dessa system beter sig kräver dock dynamisk information samt strukturell information. De super-upplösning metoderna ovan innebära en kompromiss mellan rumslig upplösning och temporal upplösning, att begränsa den tidsmässiga precision som dynamiska processer kan bli utforskad. En metod som ger både hög rumsliga och temporal upplösning är RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Här, vi göra en åtskillnad mellan traditionella 3D-SPT30 och RT-3D-sömlösa rör traditionell 3D-SPT kräver helt enkelt en tidsserie av tredimensionell bilddata (som kan förvärvas antingen med en confocal Mikroskop eller ett epifluorescensmikroskop ges rätt konfigurationen). I traditionella 3D-SPT bestäms koordinaterna för partikeln efter insamling av data genom att lokalisera partikeln i varje bildstapel och sammanfoga platserna i successiva volymer att skapa en bana. För dessa metoder bestäms den ultimata temporal upplösningen av den volymetriska imaging hastigheten. För confocal Mikroskop är detta enkelt på skalan av sekunder till tiotals sekunder. För epifluorescence metoder, vari den optiska vägen är manipulerad så att axiell platsinformation kan utvinnas, begränsas den temporal upplösningen kamera exponering eller avläsning tiden. Dessa epifluorescerande metoder är begränsade i intervallet över vilka axiella information kan samlas in, även om nyare framsteg i Fourier planet fas masker design och adaptiv optik är att utvidga dessa spänner till 10 µm eller mer31,32 , 33 , 34.
RT-3D-SPT förlitar sig däremot inte på att förvärva en 3D bildstapel och hitta partiklar i efterhand. Istället realtid platsinformation utvinns via enda punktdetektorer och feedback tillämpas effektivt ”låsa” partikeln i focal volymen av objektivets mål med hjälp av en highspeed piezoelektriska scenen. Detta tillåter kontinuerlig mätning av den partikelns position begränsas endast av hur många fotoner kan samlas. Dessutom kan denna metod spektrala förhör av partikel när den rör sig över långa spänner. RT-3D-SPT i kraft verk liknar en tvinga-fria optiska svällning för nanoskala objekt, vari partikeln kontinuerligt utforskad och mätas i realtid utan behov av stora laser befogenheter eller optiska styrkor. Med tanke på att RT-3D-SPT ger möjlighet att fortlöpande förhör av snabbt diffus objekt (upp till 20 µm2/s)25,29 i tre dimensioner låg fotonen räkna priser20,29, 35, bör det ge ett fönster in i snabb eller övergående biologiska processer såsom intracellulära frakttransporter, ligand-receptorbindning och enda virioner extracellulära dynamik. Dock till denna punkt, har tillämpningen av RT-3D-SPT begränsats till handfull grupper som arbetar för att främja denna teknik.
Ett hinder är komplexiteten i den optiska layout som krävs av RT-3D-SPT metoder, som är varierande. För de flesta metoder ges den optiska feedbacken av en piezoelektrisk scenen. Som gör små partikelförehavanden i X, Y, eller Z, avläsning från enda punktdetektorer konverteras till fel funktioner och utfodras på höghastighetståg till en piezoelektriska nanopositioner, som i sin tur flyttar provet att motverka den partikelns rörelse, effektivt låsa den på plats i förhållande till objektivet. Att mäta små positionella rörelser i X, Y och Z, antingen flera detektorer (4 eller 5 beroende på genomförandet)15,18,21 eller flera excitation ställen (2-4, lägre som kan tillämpas om en låsa in förstärkaren används för att extrahera X och Y-position med hjälp av en roterande laser spot)25,28 tillämpas. Överlappningen av dessa flera upptäckt och utsläpp fläckar göra systemen svårt att justera och underhålla.
Häri, presenterar vi en höghastighets mål-låst 3D-SPT metod med en förenklad optisk design som kallas 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT använder en 2D-EOD och en TAG linsen36,37,38 dynamiskt flytta en fokuserad laser plats genom objektiva fokal volymen i hög hastighet (50 kHz XY, 70 kHz Z). Att kombinera laser fokus position och photon ankomsttid kan partikelns 3D-position att erhållas snabbt även vid låga fotonen räkna priser. Den 2D-EOD driver laser fokus i en riddares tur mönster39 med en kvadrat med storleken 1 x 1 µm i X-Y-planet och TAG linsen flyttas laser fokus i axiell riktning med en rad 2-4 µm. 3D partikel position erhålls med en optimerad position uppskattning algoritm29,40 i 3D. Kontroll av 3D dynamiskt rörliga laser plats, fotonen räkna från avalanche fotodiod (APD), realtid partikel ställning beräkningen, piezoelektriska scen feedback och dataregistrering utförs på en field programmable gate array (FPGA).I detta protokoll, vi beskriver hur man bygger en 3D-DyPLoT Mikroskop steg för steg, inklusive optisk justering, kalibrering med fasta partiklar, och slutligen gratis partikel spårning. Som en demonstration spårades 110 nm fluorescerande pärlor kontinuerligt i vatten för minuter i taget.
Den metod som beskrivs häri är ett idealiskt val för alla program där det är önskvärt att kontinuerligt övervaka en snabbrörliga fluorescerande sond vid låga ljusnivåer, inklusive virus, nanopartiklar och blåsor som endosomes. Till skillnad från tidigare metoder finns det bara en enda excitation och enda upptäckt väg, att göra justering och underhåll enkelt. Dessutom kan stort detekteringsområdet detta Mikroskop för att enkelt plocka upp snabbt sprida partiklar, medan förmågan att spåra på låga signalnivåer (ned till 10 kHz) gör denna metod idealisk för svagt ljus program29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Realtid tredimensionella enda partikel spårning (RT-3D-SPT) har potential att belysa snabb, 3D processer i cellulära system. Även om olika RT-3D-SPT metoder har föreslagits under de senaste åren, fortfarande spårning hög hastighet 3D sprida partiklar vid låg fotonen räkna priser en utmaning. Dessutom är RT-3D-SPT uppställningar i allmänhet komplexa och svåra att genomföra, att begränsa deras utbredd tillämpning på biologiska problem. Detta protokoll presenterar ett RT-3D-SPT-system som heter 3D dynamiska Photon lokalisering spårning (3D-DyPLoT), som kan spåra partiklar med hög diffus hastighet (upp till 20 µm2/s) vid låg fotonen räkna priser (ned till 10 kHz). 3D-DyPLoT sysselsätter en 2D Elektro-optisk deflektor (2D-EOD) och en avstämbara akustiska gradient (TAG) lins att köra en enda fokuserad laser plats dynamiskt i 3D. I kombination med en optimerad position uppskattning algoritm, kan 3D-DyPLoT låsa på enstaka partiklar med hög avläsningshastighet och hög lokalisering precision. På grund av den enda excitation och enda upptäckt sökväg layout är 3D-DyPLoT robust och lätt att ställa in. Detta protokoll diskuterar hur man bygger 3D-DyPLoT steg för steg. Först beskrivs den optiska layouten. Nästa, systemet är kalibrerad och optimerad av raster skanning en 190 nm fluorescerande pärla med den piezoelektriska nanopositioner. Slutligen, för att visa realtids-3D spårning förmåga, 110 nm fluorescerande pärlor spåras i vatten.

Fast partikel scanning (figur 4) och fritt diffuserande 110 nm fluorescerande partikel spårning (figur 5) utfördes efter protokollet ovan. Partikel skanning utfördes genom att flytta den piezoelektriska nanopositioner och bin fotoner medan samtidigt beräkna partikeln Beräknad position vid varje punkt i genomsökningen. Skannar bilden visar en kvadrat med jämn intensitet (figur 4a) och beräknad...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Detta protokolldetaljer byggande och drift av ett realtid 3D enda partikel spårning Mikroskop kan spårning nanoskala fluorescerande sonder på höga diffus hastigheter och låga fotonen räkna priser.

Ett protokoll för realtid 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Längsgående Mätning av extracellulär matrix Stelhet i 3D tumörmodeller Använda Partikel-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In situ Kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos Biofilmer av Partikel-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi för real tids bestämning av encellig morfologi i bioprocesser

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Tillverkning av en Nafion-belagd, minskad grafen oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor för att övervaka pH i realtid under mikrobiell fermentering

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Upptag av nya Lipid-belagd nanopartiklar som innehåller Falcarindiol av humana mesenkymala stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...