Name: a protocol for real-time 3d single particle tracking
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124868 altında ve Duke Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Kur düzeni ve uyum
<ol>
	<li>Lazer yükleme ve kolimasyon izleme uyarma<ol>
		<li>Lazer optik tabloda bir ev inşa bağlama yoluyla yapıştırmayın. Montaj delikleri lazer baş ve optik tablo için montaj ile basit alüminyum plakadır. Lazer sıkıca istikrar ve ısı dağıtımı için metal bir takma iliştirilmesi gerekir. Dalga boyu belirli bir fluorophore uygun veya deneme için seçilmiş olsa bu iş için 488 nm katı hal lazer aydınlatma (şekil 1) için kullanın. Lazer da...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

3D tek parçacık yöntemleri izleme birçok çeşidi son yıllarda ortaya çıkan, yüksek hızlı 3D Difüzyon düşük foton sayısı hesaplı basit bir kurulum ile sağlam gerçek zamanlı izleme hala önemli biyolojik onun uygulamaya sınırlayan bir meydan okuma olsa da sorunları. 3D-DyPLoT yöntemi bu iletişim kuralı adreslerini bu sorunlar çeşitli yollarla nitelendirdi. İlk olarak, uyarma ve algılama yolları büyük ölçüde basit ve sağlam hizalama yapma diğer uygulamaları ile karşılaştırıldığ...

Gelişmiş görüntüleme teknikleri ortaya çıkması tüm yol aşağı moleküler seviyede hücresel olayların her zamankinden daha detaylı yapısını görmek için bir pencere açtı. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)1,2,3, fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM)4,5,6,7 gibi yöntemleri , yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8,9,10,11ve uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED)12,13, 14 kadar yapısı ve fonksiyonu canlı hücre benzersiz detay sunmak için kırınım sınırını aşan gitti. Ancak, nasıl bu sistemlerinden davranır tam anlayış dinamik bilgi hem de yapısal bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen süper çözünürlük yöntemleri Uzaysal çözünürlük ve zamansal çözünürlük, hangi ile dinamik süreçler probed zamansal hassas sınırlama arasında bir denge içerir. Sağlar yüksek uzaysal duyarlık ve zamansal çözünürlük RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20bir yöntem 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Burada, bir ayrım çizmek arasında geleneksel 3D-SPT30 ve RT-3D-SPT. geleneksel 3D-SPT sadece (ve ya kullanarak confocal mikroskop ya da bir epifluorescence mikroskobu alınan üç boyutlu görüntü verilerini bir saat serisi gerektirir «««verilir) doğru yapılandırma. Geleneksel 3D SPT içinde parçacık koordinatlarını veri toplama sonra parçacık her görüntü yığınında bulma ve art arda gelen birimler yerlerde birleştirerek oluşan bir yörünge oluşturmak için belirler. Bu yöntemler için nihai zamansal çözünürlük hacimsel görüntüleme hızı tarafından belirlenir. Kolayca saniye saniye onlarca ölçekte bu confocal mikroskoplar için. Neyin Aksiyel konum bilgileri elde edilebilir böylece optik yol manipüle, epifluorescence yöntemleri için zamansal çözünürlük fotoğraf makinesi Pozlama veya okuma zaman sınırlıdır. Bu epifluorescent yöntemler üzerinde eksenel bilgiler toplanabilir aralığında sınırlıdır, Fourier uçak aşamasında son ilerleme maskeleri rağmen tasarım ve adaptif optik uzanan bu aralıklar 10 µm veya daha fazla31,32 , 33 , 34.
Buna ek olarak, RT-3D-SPT bir 3D görüntü yığını edinme ve parçacıklar aslında sonra bulma dayanmaz. Bunun yerine, gerçek zamanlı konum bilgileri tek nokta dedektörleri ile elde edilir ve geri bildirim için etkili bir şekilde "kullanımı ile bir yüksek hızlı piezoelektrik sahne objektif lens odak hacmine parçacık kilit" uygulanır. Bu parçacığın konum sınırlı sürekli ölçümü sadece kaç fotonlar toplanabilir tarafından sağlar. Ayrıca, uzun aralıklarında hareket ederken bu yöntem parçacık spektral sorgulama sağlar. RT-3D-SPT etkin inşaat benzer-e doğru neyin parçacık sürekli probed ve büyük lazer gücü gerek kalmadan gerçek zamanlı veya optik ölçülen Nano nesneleri, kuvvet-Alerjik optik tuzak zorlar. Verilen bu RT-3D-SPT hızlı diffusive nesneleri (ilâ 20 µm2/s)25,29 düşük foton sayısı oranları20,29üç boyutlu olarak sürekli sorgulama için bir araç sağlar, 35, bunu sağlamak bir pencere içine hızlı veya geçici biyolojik süreçlerin hücre içi kargo taşımacılığı, ligand-reseptör bağlama ve tek virions ekstrasellüler dinamikleri gibi. Ancak, şu ana kadar RT-3D-SPT uygulanması bu teknoloji ilerlemek için çalışma grupları avuç sınırlı olmuştur.
Çeşitlidir RT-3D-SPT yöntemler tarafından gerekli optik düzen karmaşıklığı bir engeldir. En yöntemleri için optik görüş piezoelektrik bir sahne ile sağlanır. İçinde X, Y veya Z, dökümanları tek nokta dedektörleri üzerinden hata işlevleri için dönüştürülür ve de beslenen parçacık yapar küçük hareketleri olarak piezoelektrik nanopositioner için yüksek hızlı içinde açmak parçacığın hareketi, etkili bir şekilde karşı koymak için örnek taşır yerde objektif lens göreli kilitleme. X, küçük pozisyonel hareketleri ölçmek için Y ve Z, birden çok Dedektörler (4 veya 5 uygulama bağlı olarak)15,18,21 ya da birden çok uyarma noktalar (2-4, hangi daha düşük eğer uygulanabilir bir amplifikatör kilit-in X ayıklamak için kullanılır ve bir döner kullanarak Y konumunu lazer nokta)25,28 uygulanır. Bu birden fazla algılama ve emisyon noktalarından örtüşme sistemleri hizalayın ve korumak zor yapmak.
Burada, biz 3D-DyPLoT29denen bir basitleştirilmiş optik tasarımı ile yüksek hızlı hedefe kitlendik 3D-SPT yöntemi mevcut. 3D-DyPLoT dinamik olarak odaklı lazer nokta yüksek bir oranı (50 kHz XY, 70 kHz Z) objektif odak seste aracılığıyla taşımak için bir 2D EOD ve etiket objektif36,37,38 kullanır. Lazer odak konumu ve foton varış saati birleştiren parçacığın 3B konumlandırma hızla bile düşük foton sayısı oranları elde edilecek sağlar. 1 x 1 µm X-Y düzlemde bir kare boyutu ile bir şövalyenin Tur Model39 ' lazer odak 2D EOD sürücüler ve etiket objektif lazer odak aralığı 2-4 µm ile eksenel yönde hareket eder. 3D parçacık pozisyon bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması29,40 3D ile elde edilir. Çığ fotodiyot (APD), gerçek zamanlı parçacık pozisyonu hesaplama, piezoelektrik sahne geri bildirim ve veri kayıt sayma 3D dinamik olarak hareketli lazer nokta, foton kontrolünü bir alan programmable gate array (FPGA) yapılmaktadır.Bu iletişim kuralı, biz 3D-DyPLoT mikroskop optik uyum, kalibrasyon ile sabit parçacıklar, dahil olmak üzere adım adım inşa etmek nasıl açıklar ve nihayet parçacık izleme ücretsiz. Bir gösteri 110 nm floresan boncuk sürekli suda dakika bir anda için takip.
Burada açıklanan yöntemi nerede sürekli virüsler, nano tanecikleri ve veziküller gibi endosomes gibi düşük seviyelerde hafif, hızlı hareket eden floresan sonda izlemek için istenen herhangi bir uygulama için ideal bir seçim var. Önceki yöntemler aksine, yalnızca bir tek uyarma ve tek algılama yolu, hizalama ve bakım basit yapma işte. Ayrıca, kolayca düşük sinyal seviyeleri (aşağı 10 kHz), izleme özelliği bu yöntem düşük ışık uygulamaları29için ideal yapar iken hızlı parçacıklar, difüzyon kadar almak bu mikroskop büyük algılama alanı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Gerçek zamanlı üç boyutlu tek parçacık (RT-3D-SPT) izleme hücresel sistemlerinde hızlı, 3D işlemler ışık potansiyeline sahiptir. Her ne kadar son yıllarda çeşitli RT-3D-SPT yöntemler ileri koymak, yüksek hızlı izleme düşük foton sayısı oranları parçacıklar Difüzyon 3D bir meydan kalır. Ayrıca, RT-3D-SPT kurulumları genellikle biyolojik ilgili sorunların yaygın uygulama sınırlama uygulamak, zor ve karmaşık. Bu iletişim kuralı düşük foton sayısı hesaplı (aşağı 10 kHz) 3D dinamik foton yerelleştirme hangi parçacıklar (en fazla 20 µm2/s) yüksek diffusive hız ile izleyebilirsiniz izleme (3D-DyPLoT), adlı bir RT-3D-SPT sistemi sunar. Akort akustik degrade (TAG) objektif bir tek odaklı sürücü lazer nokta dinamik olarak 3D ve 3D-DyPLoT bir 2D elektro-optik saptırıcı (2D-EOD) istihdam. Bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması ile birlikte, 3D-DyPLoT yüksek izleme hız ve yüksek yerelleştirme hassasiyet ile tek parçacıklar üzerine kilitleyebilirsiniz. Tek uyarma ve tek algılama yol yerleşim nedeniyle, 3D-DyPLoT sağlam ve kurulumu kolay. Bu iletişim kuralı, 3D-DyPLoT adım adım inşa anlatılmaktadır. İlk olarak, optik düzen açıklanmıştır. Ardından, sistemi kalibre edilmiş ve 190 nm floresan boncuk piezoelektrik nanopositioner ile tarama raster tarafından optimize edilmiştir. Son olarak, gerçek zamanlı 3D yetenek izleme göstermek için 110 nm floresan boncuk suda izlenir.

Sabit parçacık (şekil 4) tarama ve izleme serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık (şekil 5) Yukarıdaki protokol sonrası yapıldı. Parçacık tarama tarama, her bir noktada pozisyon aynı anda parçacığın hesaplama tahmini piezoelektrik nanopositioner ve depo gözü fotonlar hareket tarafından gerçekleştirildi. Bir kare bile yoğunluk (şekil 4a) tarama görüntü gösterir ve ...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Nafion kaplı imalatı, mikrobiyal fermantasyon sırasında gerçek zamanlı monitör pH grafen oksit/Polyaniline Chemiresistive sensör azaltılmış

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...