Name: whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance
Uploaded: 2017-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance at JoVE.com

इस कार्य में संक्रामक रोगों एवं माइक्रोबायोलॉजी, जन स्वास्थ्य के लिए केंद्र का सहयोग लिया गया । इस अध्ययन के लिए लेखकों को कोई अन्य फंडिंग नहीं मिली है । लेखक डीआरएस एलिसिया Arnott, नातान Bachmann और रंजीता मेनन उनके विशेषज्ञ सलाह और सहायता के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रयोग के साथ धंयवाद ।

इस अध्ययन के लिए कोई नैतिक अनुमोदन आवश्यक नहीं था ।
1. Candida glabrata के लिए उपसंस्कृति और इनोक्युलम तैयारी
<ol><li>C. glabrata के एक पैनल का चयन करने के लिए अलग से अध्ययन किया जा करने के लिए जो भी शामिल होना...

<ol>
	<li>Beyda, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKS+mutant+Candida+glabrata:+risk+factors+and+outcomes+in+patients+with+candidemia.">FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia.</a> Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).</li><li>Chapeland-Leclerc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+flucytosine,+azole,+and+caspofungin+resistance+in+Candida+glabrata.+bloodstream+isolates+serially+obtained+from+a+hematopoietic+stem+cell+transplant+recipient.">Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).</li><li>Glockner, A., Cornely, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata-unique+features+and+challenges+in+the+clinical+management+of+invasive+infections.">Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections.</a> Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).</li><li>Pfaller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+decreased+susceptibility+and+resistance+to+echinocandins+among+fluconazole-resistant+bloodstream+isolates+of+Candida+glabrata.">Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata.</a> J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).</li><li>Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+emergence+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata+resulting+in+clinical+and+microbiologic+failure.">Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).</li><li>Klevay, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+and+outcome+of+Candida+glabrata+versus+Candida+albicans+bloodstream+infection.">Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).</li><li>Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCAST+technical+note+on+the+EUCAST+definitive+document+EDef+7.2:+method+for+the+determination+of+broth+dilution+minimum+inhibitory+concentrations+of+antifungal+agents+for+yeasts+EDef+7.2+(EUCAST-AFST).">EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST).</a> Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+Method+for+Broth+Dilution+Antifungal+Susceptibility+Testing+of+Yeasts.">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.</a> Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).</li><li>Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danish+Fungaemia+Study,+G.+Caspofungin+Etest+susceptibility+testing+of+Candida+species:+risk+of+misclassification+of+susceptible+isolates+of+C.+glabrata+and+C.+krusei+when+adopting+the+revised+CLSI+caspofungin+breakpoints.">Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).</li><li>Singh-Babak, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+evolution+and+mechanism+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata.">Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata.</a> PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).</li><li>Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+perspectives+on+echinocandin+resistance+among+Candida+species.">Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species.</a> Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).</li><li>Dudiuk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+of+classical+PCRs+for+detection+of+mutations+in+Candida+glabrata+FKS.+genes+linked+with+echinocandin+resistance.">Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).</li><li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>Barzon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+technologies+in+diagnostic+virology.">Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology.</a> J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).</li><li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing.">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).</li><li>Koser, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+use+of+microbial+whole+genome+sequencing+in+diagnostic+and+public+health+microbiology.">Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology.</a> PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).</li><li>Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+pathogen+discovery+and+surveillance.">The changing face of pathogen discovery and surveillance.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).</li><li>Sintchenko, V., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pathogen+genomics+in+assessing+disease+transmission.">The role of pathogen genomics in assessing disease transmission.</a> BMJ. 350, 1314 (2015).</li><li>Garnaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+offers+new+insights+into+the+resistance+of+Candida+spp.+to+echinocandins+and+azoles.">Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles.</a> J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).</li><li>Sanmiguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+potential+applications+in+fungal+genomics.">Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics.</a> Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).</li><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).</li><li>Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+in+the+mycology+lab.">Next-Generation Sequencing in the mycology lab.</a> Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).</li><li>Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+as+a+diagnostic+test:+challenges+and+opportunities.">Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities.</a> Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).</li><li>Biswas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genetic+markers+of+resistance+to+echinocandins,+azoles+and+5-fluorocytosine+in+Candida+glabrata+by+next-generation+sequencing:+a+feasibility+study.">Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study.</a> Clin Microbiol Infect. , (2017).</li><li>Glasel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+nucleic+acid+purities+monitored+by+260nm/280nm+absorbance+ratios.">Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios.</a> BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).</li><li>Cannon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-mediated+antifungal+drug+resistance.">Efflux-mediated antifungal drug resistance.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+mutations+in+CgPDR1.+of+Candida+glabrata+not+only+mediate+antifungal+resistance+but+also+enhance+virulence.">Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence.</a> PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).</li><li>Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata:+a+review+of+its+features+and+resistance.">Candida glabrata: a review of its features and resistance.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).</li><li>Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Candida+glabrata+FKS1+and+FKS2+mutations+on+echinocandin+sensitivity+and+kinetics+of+1,3-beta-D-glucan+synthase:+implication+for+the+existing+susceptibility+breakpoint.">Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).</li><li>Arendrup, M. C., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandin+resistance:+an+emerging+clinical+problem.">Echinocandin resistance: an emerging clinical problem.</a> Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).</li><li>Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Mechanisms+of+Flucytosine+Resistance+in+C.+glabrata+Unveiled+by+a+Chemogenomics+Analysis+in+S.+cerevisiae.">New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).</li><li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+in+human+fungal+pathogens:+glue+with+plenty+of+stick.">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).</li><li>de Groot, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+wall+of+the+human+pathogen+Candida+glabrata:+differential+incorporation+of+novel+adhesin-like+wall+proteins.">The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins.</a> Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).</li><li>Vale-Silva, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+adhesin+gene+EPA1+mediated+by+PDR1+in+Candida+glabrata+leads+to+enhanced+host+colonization.">Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li></ol>

इस अध्ययन में व्यवहार्यता निर्धारित, अनुमानित समय और WGS की परिशुद्धता- C. glabrataमें दवा प्रतिरोध का मार्गदर्शन का पता लगाने । पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए बदलाव समय (जैसे) चार दिन और विश्लेषण पर...

Candida glabrata एक तेजी से एक प्रजाति है कि azoles के लिए प्रतिरोध के रूप में के रूप में अच्छी तरह से और अधिक हाल ही में प्रदर्शन के रूप में महत्व के साथ रोगज़नक़ है, echinocandins1,2,3। द्विगुणित सी. albicansके विपरीत, सी. glabrata के अगुणित जीनोम यह उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण और बहु दवा प्रतिरोध और अधिक आसानी से विकसित करने के लिए अनुमति दे सकता है । दोनों दवा वर्ग के सह-विरोध को भी4बताया गया है । इसलिए, रोधी संवेदनशीलता के प्रारंभिक मूल्यांकन और सी. glabrata में दवा प्रतिरोध का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है सही, लक्षित चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोधी प्रबंध के संदर्भ में रोगाणुरोधी प्रतिरोध के ड्राइवरों की सीमा1 , 5 , 6. एक कुशल कार्यप्रवाह की स्थापना के लिए तेजी से प्रतिरोधी पुष्टि में प्रतिरोध से जुड़े उत्परिवर्तनों की उपस्थिति का पता लगाने के अलग भी निर्णय विहित और नैदानिक परिणामों में सुधार करने में मदद मिलेगी ।
रोधी संवेदनशीलता आमतौर पर ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) जो सबसे कम दवा एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है मापने के द्वारा मूल्यांकन है कि एक सूक्ष्मजीवों के विकास में एक महत्वपूर्ण कमी में एक दवा मुक्त विकास के साथ तुलना में परिणाम नियंत्रण. नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (CLSI) और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (EUCAST) पर यूरोपीय समिति MIC निर्धारण अधिक सटीक और लगातार7बनाने के क्रम में मानकीकृत संवेदनशीलता परीक्षण तरीकों है, 8. हालांकि, रोधी MIC की उपयोगिता विशेष रूप से echinocandins के लिए सीमित रहता है, के साथ विशेष रूप से अंतर-प्रयोगशाला तुलना करने का संबंध है जहां अलग तरीके और शर्तों के उपयोग कर रहे है9। echinocandin उपचार और WT भेद अक्षमता (या अतिसंवेदनशील) उन FKS उत्परिवर्तनों बंदरगाह (echinocandin प्रतिरोधी उपभेदों)10,11से अलग करने के लिए प्रतिक्रिया के साथ MICs के भी अनिश्चित सहसंबंध है । पुष्टि एकल जीन पीसीआर और रोधी प्रतिरोध मार्करों के सैंज अनुक्रमण की उपलब्धता के बावजूद, परिणाम की प्राप्ति अक्सर कई प्रतिरोध मार्करों5,12के एक साथ का पता लगाने की कमी के कारण देरी है । इसलिए, प्रतिरोध के समवर्ती का पता लगाने-जीनोम में विभिन्न स्थानों में उत्परिवर्तनों को प्रदान, पूरे जीनोम अनुक्रमण आधारित विश्लेषण द्वारा सक्षम, वर्तमान दृष्टिकोण पर महत्वपूर्ण लाभ देता है ।
पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) सफलतापूर्वक फैलने के दौरान रोग संचरण ट्रैक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीनोम व्यापक जोखिम मूल्यांकन और बैक्टीरिया और वायरस में दवा प्रतिरोध परीक्षण के लिए एक दृष्टिकोण13लागू किया गया है । न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के हाल ही में अग्रिमों दोनों तकनीकी और आर्थिक रूप से व्यवहार्य एक चिकित्सकीय कार्रवाई बारी में रोगजनकों के पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) बना दिया है । डीएनए अनुक्रमण रोगज़नक़ की पहचान के अन्य तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है और14,15,16सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में कार्यरत लक्षण वर्णन. सबसे पहले, यह उच्च प्रवाह, गति और गुणवत्ता के साथ एक सार्वभौमिक समाधान प्रदान करता है । sequencing सूक्ष्मजीवों के किसी भी करने के लिए लागू किया जा सकता है और स्थानीय या क्षेत्रीय प्रयोगशालाओं में पैमाने की अर्थव्यवस्थाओं की अनुमति देता है । दूसरा, यह एक ' भविष्य प्रूफ ' प्रारूप में डेटा का उत्पादन राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय स्तर पर तुलना के लिए उत्तरदायी । अंत में, चिकित्सा में WGS की संभावित उपयोगिता संदर्भ जीनोम युक्त सार्वजनिक डेटा ठिकानों की तेजी से वृद्धि के द्वारा संवर्धित किया गया है, जो समकक्ष डेटा ठिकानों है कि अतिरिक्त नैदानिक और महामारी विज्ञान मेटाडाटा शामिल करने के लिए जोड़ा जा सकता है17 ,18.
हाल के अध्ययनों से नैदानिक Candida एसपीपीके अलग से रोधी प्रतिरोध मार्करों की पहचान के लिए WGS की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है । 10 , 19 , 20. यह ज्यादातर उच्च प्रवाह benchtop sequencers की उपलब्धता के कारण है, bioinformatics पाइपलाइन की स्थापना की और अनुक्रमण की लागत कम21,22। एक ही रन पर कई जीनोम के अनुक्रमण WGS की अनुमति देता है कि सैंज sequencing पर कवक WGS का लाभ यह है । इसके अलावा, Candida जीनोम के WGS दवा के लक्ष्यों में उपंयास उत्परिवर्तनों की पहचान कर सकते है आनुवंशिक विकास ट्रैक, और चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुक्रम के उद्भव-प्रकार20,22,23। सबसे महत्वपूर्ण बात, आंतरिक बहुऔषध प्रतिरोध के मामलों में, WGS प्रतिरोध का जल्दी पता लगाने में सहायता कर सकते है-उत्परिवर्तनों इलाज के चयन से पहले22,24।
यहां, हम रोधी एजेंटों के विभिंन वर्गों के लिए दवा प्रतिरोध के साथ जुड़े उत्परिवर्तनों के लिए WGS सक्षम स्क्रीनिंग की व्यवहार्यता की जांच की । हम अंत उपयोगकर्ता और नैदानिक कवक प्रयोगशाला के दृष्टिकोण से WGS के कार्यांवयन के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं । हम तीन अलग नैदानिक मामलों जिसमें इन विट्रो में echinocandins और 5 के लिए प्रतिरोध-रोधी उपचार के बाद समय के साथ विकसित flucytosine से प्रसंस्कृत जोड़े को अलग इस विश्लेषण में शामिल थे ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:991px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">DensiCHECK Plus</td>
			<td style="width:183px;">BioM&#233;rieux Inc</td>
			<td style="width:151px;">K083536</td>
			<td style="width:383px;">Densitometer used for McFarland readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Sensititre YeastOne</td>
			<td style="width:183px;">TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">YO10</td>
			<td style="width:383px;">Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">22-363-605</td>
			<td style="width:383px;">Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich, Merck</td>
			<td style="width:151px;">T2795&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:383px;">Volume 2.0 mL, natural 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td style="width:183px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:151px;">8320921</td>
			<td style="width:383px;">Used for cell wall lysis of fungal isolate before 
			DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:151px;">A1120</td>
			<td>Does 100 DNA extractions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">P7589</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. 
			Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-1096</td>
			<td style="width:383px;">Includes Box 1 and Box 2&#160; reagents for 96 samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Nextera XT Index Kit v2</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-2001, 
			FC-131-2002, 
			FC-131-2003, 
			FC-131-2004</td>
			<td style="width:383px;">Index set A 
			Index set B 
			Index set C 
			Index set D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500/550 High Output Kit v2&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2004</td>
			<td>300 cycles, More than 250 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500 Mid Output v2 Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2003</td>
			<td>300 cycles, More than 130 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">PhiX Control Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-110-3001</td>
			<td style="width:383px;">To arrange indices from Index kit in order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">TruSeq Index Plate Fixture Kit</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:151px;">FC-130-1005</td>
			<td>&#160;2 Fixtures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">KAPA Library Quantification Kit 
			for Next-Generation Sequencing</td>
			<td style="width:183px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:151px;">KK4824</td>
			<td>Includes premade standards, primers and MasterMix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Janus NGS Express Liquid handling system&#160;</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:151px;">YJS4NGS</td>
			<td>Used for DNA dilutions during sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#160;0.8 mL Storage Plate</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AB0765B</td>
			<td style="width:383px;">MIDI Plate for DNA Library cleanup and 
			normalisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:151px;">A63881</td>
			<td>&#160;Magnetic beads in solution for library purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AM10027</td>
			<td>Used for magnetic bead based DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">OrbiShaker MP&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BT1502</td>
			<td>96-well plate shaker with 4 platforms</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hard Shell PCR Plate</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">HSP9601</td>
			<td>Thin Wall, 96 Well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LightCycler 480 Instrument II&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:151px;">5015278001</td>
			<td>Accomodates 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">&#160;MSB1001</td>
			<td>Clear 96-well plate sealers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">CLCBio</td>
			<td>Software for data analysis, Version 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq500 instrument</td>
			<td style="width:183px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Illumina&#160;</td>
			<td>Benchtop Sequencer used for next generation sequencing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance

Candida glabrata तेजी से उत्परिवर्तनों कि दवा प्रतिरोध में परिणाम प्राप्त कर सकते हैं, विशेष रूप से azoles और echinocandins के लिए । आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान आवश्यक है, के रूप में इन विट्रो में पाया प्रतिरोध अक्सर नैदानिक विफलता के साथ संबद्ध किया जा सकता है । हम C. glabrataमें रोधी दवा प्रतिरोध के जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) का उपयोग करने की व्यवहार्यता की जांच की । उद्देश्य torecognize सक्षमीकरण और कार्यांवयन WGS में बाधाओं और इसके प्रभाव को मापने था । यह कागज कुंजी गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों और WGS पद्धति के आवश्यक घटकों की रूपरेखा के लिए आनुवंशिक मार्कर रोधी एजेंटों को कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े जांच । यह भी डेटा विश्लेषण और बारी-परीक्षण के आसपास के समय की सटीकता का अनुमान है ।
12 नैदानिक की Phenotypic संवेदनशीलता, और सी. glabrata के एक ATCC तनाव रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के माध्यम से निर्धारित किया गया था । ये तीन अलग जोड़े शामिल, तीन रोगियों से, कि दवा ंयूनतम निरोधात्मक सांद्रता में वृद्धि विकसित की है । दो जोड़े में, प्रत्येक जोड़ी के दूसरे अलग echinocandins के लिए प्रतिरोध विकसित की है । दूसरी तीसरी जोड़ी के अलग प्रतिरोध विकसित 5-flucytosine । अतिसंवेदनशील और अज़ोल प्रतिरोधी अलग शामिल शेष । echinocandin, अज़ोल और 5-flucytosine प्रतिरोध से जुड़े जीन में सिंगल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके WGS के माध्यम से अलग किया गया प्रतिरोधी में पुष्टि की गई । FKS1, FKS2,   CgPDR1, CgCDR1 और FCY2 जैसे रोधी प्रतिरोधक जीन में गैर-पर्यायवाची SNPs की पहचान की गई. कुल मिलाकर, WGS के ९८% की एक औसत सी. glabrata के बारे में ७५ के साथ संदर्भ जीनोम के लिए बदलाव समय और लागत सैंज अनुक्रमण के लिए तुलनीय थे ।
अंत में, सी glabrata के WGS नैदानिक महत्वपूर्ण जीन कई पीसीआर/डीएनए अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना विभिंन रोधी दवा वर्गों के विरोध में शामिल उत्परिवर्तनों खुलासा में संभव था । इस नैदानिक प्रयोगशाला में WGS क्षमता की स्थापना की दिशा में एक साथ रोधी प्रतिरोध का पता लगाने के लिए एक सकारात्मक कदम का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिस्थापन ।

तेरह सी. glabrata में शामिल सी. glabrata ATCC ९००३० और 12 को नैदानिक कवक संदर्भ प्रयोगशाला (अलग CMRL1 से CMRL12) से अलग किया गया है, Westmead अस्पताल, सिडनी (तालिका 1) अध्ययन किए गए. ये अलग CMRL के तीन जोड़े-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 और CMRL-5/C...

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Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

इस अध्ययन के Candida glabrataमें रोधी दवा प्रतिरोध को प्रदान जीन में उत्परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण लागू किया । C. glabrata echinocandins, azoles और 5-flucytosine के लिए प्रतिरोधी अलग, पद्धति को वर्णन करने के लिए अनुक्रम थे । अलग की संवेदनशीलता प्रोफाइल की उपस्थिति या जीन में विशिष्ट उत्परिवर्तन पैटर्न के अभाव के साथ संबंधित ।

रोधी दवा प्रतिरोध के मार्करों का पता लगाने के लिए Candida glabrata के पूरे जीनोम अनुक्रमण

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

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