Name: whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance
Uploaded: 2017-12-28T15:00:00
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이 작품 전염병 및 미생물학, 보건 센터에 의해 지원 되었다. 저자는 어떤 다른 자금 조달이 연구에 대 한 받지. 저자는 그들의 전문가 조언 및 지원 전체 게놈 시퀀싱 실험에 대 한 Drs 엘리샤 Arnott, 네이 선 Bachmann 및 Ranjeeta Menon을 감사합니다.

윤리적인 승인을이 연구를 위해 필요 했다.
1. 서브 컬쳐와 inoculum Candida glabrata 에 대 한 준비
<ol><li>또한 적어도 하나의 C. glabrata 미국 유형 문화 수집 (ATCC) 알려진된 민감성 패턴을 포함 해야 공부를 해야 C.glabrata 분리의 패널을 선택 합니다.</li>
	<li>Subculture 단일 식민지 만져 격리 멸 균 일회용 플라스틱 루프를 사용 하 여 및 Sabouraud의 포도 당 한 천 (SDA)?...

<ol>
	<li>Beyda, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKS+mutant+Candida+glabrata:+risk+factors+and+outcomes+in+patients+with+candidemia.">FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia.</a> Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).</li><li>Chapeland-Leclerc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+flucytosine,+azole,+and+caspofungin+resistance+in+Candida+glabrata.+bloodstream+isolates+serially+obtained+from+a+hematopoietic+stem+cell+transplant+recipient.">Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).</li><li>Glockner, A., Cornely, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata-unique+features+and+challenges+in+the+clinical+management+of+invasive+infections.">Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections.</a> Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).</li><li>Pfaller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+decreased+susceptibility+and+resistance+to+echinocandins+among+fluconazole-resistant+bloodstream+isolates+of+Candida+glabrata.">Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata.</a> J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).</li><li>Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+emergence+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata+resulting+in+clinical+and+microbiologic+failure.">Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).</li><li>Klevay, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+and+outcome+of+Candida+glabrata+versus+Candida+albicans+bloodstream+infection.">Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).</li><li>Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCAST+technical+note+on+the+EUCAST+definitive+document+EDef+7.2:+method+for+the+determination+of+broth+dilution+minimum+inhibitory+concentrations+of+antifungal+agents+for+yeasts+EDef+7.2+(EUCAST-AFST).">EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST).</a> Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+Method+for+Broth+Dilution+Antifungal+Susceptibility+Testing+of+Yeasts.">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.</a> Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).</li><li>Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danish+Fungaemia+Study,+G.+Caspofungin+Etest+susceptibility+testing+of+Candida+species:+risk+of+misclassification+of+susceptible+isolates+of+C.+glabrata+and+C.+krusei+when+adopting+the+revised+CLSI+caspofungin+breakpoints.">Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).</li><li>Singh-Babak, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+evolution+and+mechanism+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata.">Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata.</a> PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).</li><li>Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+perspectives+on+echinocandin+resistance+among+Candida+species.">Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species.</a> Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).</li><li>Dudiuk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+of+classical+PCRs+for+detection+of+mutations+in+Candida+glabrata+FKS.+genes+linked+with+echinocandin+resistance.">Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).</li><li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pathogen+genomics+in+assessing+disease+transmission.">The role of pathogen genomics in assessing disease transmission.</a> BMJ. 350, 1314 (2015).</li><li>Garnaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+offers+new+insights+into+the+resistance+of+Candida+spp.+to+echinocandins+and+azoles.">Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles.</a> J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).</li><li>Sanmiguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+potential+applications+in+fungal+genomics.">Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics.</a> Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).</li><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).</li><li>Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+in+the+mycology+lab.">Next-Generation Sequencing in the mycology lab.</a> Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).</li><li>Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+as+a+diagnostic+test:+challenges+and+opportunities.">Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities.</a> Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).</li><li>Biswas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genetic+markers+of+resistance+to+echinocandins,+azoles+and+5-fluorocytosine+in+Candida+glabrata+by+next-generation+sequencing:+a+feasibility+study.">Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study.</a> Clin Microbiol Infect. , (2017).</li><li>Glasel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+nucleic+acid+purities+monitored+by+260nm/280nm+absorbance+ratios.">Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios.</a> BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).</li><li>Cannon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-mediated+antifungal+drug+resistance.">Efflux-mediated antifungal drug resistance.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+mutations+in+CgPDR1.+of+Candida+glabrata+not+only+mediate+antifungal+resistance+but+also+enhance+virulence.">Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence.</a> PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).</li><li>Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata:+a+review+of+its+features+and+resistance.">Candida glabrata: a review of its features and resistance.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).</li><li>Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Candida+glabrata+FKS1+and+FKS2+mutations+on+echinocandin+sensitivity+and+kinetics+of+1,3-beta-D-glucan+synthase:+implication+for+the+existing+susceptibility+breakpoint.">Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).</li><li>Arendrup, M. C., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandin+resistance:+an+emerging+clinical+problem.">Echinocandin resistance: an emerging clinical problem.</a> Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).</li><li>Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Mechanisms+of+Flucytosine+Resistance+in+C.+glabrata+Unveiled+by+a+Chemogenomics+Analysis+in+S.+cerevisiae.">New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).</li><li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+in+human+fungal+pathogens:+glue+with+plenty+of+stick.">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).</li><li>de Groot, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+wall+of+the+human+pathogen+Candida+glabrata:+differential+incorporation+of+novel+adhesin-like+wall+proteins.">The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins.</a> Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).</li><li>Vale-Silva, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+adhesin+gene+EPA1+mediated+by+PDR1+in+Candida+glabrata+leads+to+enhanced+host+colonization.">Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li></ol>

이 연구는 타당성, 대략적인 일정 및 C. glabrata에서 약물 저항의 WGS 기반 검출의 정밀도 결정 했다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 처리 시간 (TAT) 4 일 되었고 분석된 결과 1-2 일의 보고. 이것은 적어도 비슷한 금액으로 문신 문화 접시와 Sanger에서 민감도 분석에 대 한 비교 시퀀싱 샘플의 상당히 높은 수. 약 30-90 C. glabrata 게놈 시퀀싱 흐름 셀 용량, 80-100% 연속 범위에 따라 시퀀싱 ?...

Candida glabrata 는 azoles 뿐만 아니라 최근에, echinocandins,12,3저항을 전시 하는 종족으로 중요도 점점 발생된 병원 체 이다. 2 중 C. albicans, 달리 C. glabrata 의 단일 게놈 돌연변이 획득 하 고 보다 쉽게 다중 약물 저항을 개발 하도록 허용할 수 있습니다. 공동 저항에 두 약물 클래스 되었습니다 보고4. 따라서, 항진균 민감성의 초기 평가 및 C. glabrata 에서 약물 내성의 검출은 항균 성 저항1 의 드라이버 제한 항진균 집사의 직의 맥락에서 뿐만 아니라 정확 하 고, 타겟 치료에 대 한 중요 한 , 5 , 6. 빠르게 감지 저항 격리 바이오 마커의 저항에 연결 하는 확실 한 돌연변이의 존재는 또한 처방을 개선 하기 위해 도움이 결정 하는 효율적인 워크플로 및 임상 결과 설정.
항진균 민감성은 일반적으로 최소 억제 농도 (MIC) 마약 없는 성장의 저것과 비교 된 미생물의 성장에 있는 뜻깊은 감소에 있는 결과 낮은 약물 농도로 정의 되는 측정 하 여 평가 제어 합니다. 임상 실험실 표준 협회 (CLSI)와 유럽 위원회 항균 민감성 테스트 (EUCAST)를에 마이크 결정 수 있도록 메서드를 테스트 하는 민감성 표준화 더 정확 하 고 일관 된7, 8. 그러나, 항진균 마이크의 유틸리티 남아 있다 echinocandins, 특히 제한 특히 inter-laboratory 비교에 관해서는 다양 한 방법론 및 조건 있는 사용된9. Echinocandin 처리와 WT를 구별 하는 무 능력에 대 한 응답으로 마이크의 불확 실한 상관 관계 있다 (또는 취약) FKS 돌연변이 (echinocandin 내성 변종)10,11은닉에서 격리. 확실 한 단일 유전자 PCRs 생어의 가용성에도 불구 하 고 항진균 저항 마커의 시퀀싱, 결과의 실현은 종종 지연 인해 여러 저항 마커5,12의 동시 탐지의 부족. 따라서, 전체 게놈 시퀀싱 기반 분석을 사용 하도록 설정한 게놈에서 서로 다른 위치에 저항을 부여 돌연변이의 동시 검출 현재 접근에 비해 상당한 이점을 제공 합니다.
전체 게놈 시퀀싱 (WGS)는 발생 동안 질병 전송 게놈 넓은 위험 평가 약물 저항 박테리아와 바이러스13에서 테스트에 대 한 접근 추적을 성공적으로 구현 되었습니다. 핵 산 시퀀싱 기술의 최근 발전 만들었습니다 전체 게놈 시퀀싱을 (WGS) 병원 균의 임상 실용적인 차례-주위-시간에 기술적으로 그리고 경제적으로 가능. DNA 시퀀싱 병원 체 식별 및 미생물학 실험실14,,1516에 특성의 다른 방법에 비해 중요 한 장점을 제공 합니다. 첫째, 그것은 높은 처리량, 속도와 품질 범용 솔루션을 제공합니다. 시퀀싱은 미생물에 적용 될 수 있습니다 하 고 로컬 또는 지역 연구소에서 규모의 경제를 있습니다. 둘째, 국내 및 국제 수준에서 비교 의무가 ' 미래-증거 ' 형식으로 데이터를에서 생성합니다. 마지막으로, 의학에 WGS의 잠재적인 유틸리티가 추가 임상 및 역학 메타 데이터17 를 포함 하는 해당 데이터 베이스에 연결할 수 있는 참조 게놈을 포함 하는 공용 데이터 기지의 급속 한 성장에 의해 확장 되었습니다. 18.
최근 연구는 Candida spp의 임상 격리에서 항진균 저항 마커의 식별 WGS의 유틸리티를 증명 하고있다. 10 , 19 , 20.이 높은 처리량 벤치탑 시퀀서, 설립된 생물 정보학 파이프라인 및 시퀀싱21,22의 비용 감소의 가용성 때문입니다. 생어 시퀀싱은 WGS 단일 실행에 여러 게놈의 연속을 허용을 통해 곰 팡이 WGS의 장점. 또한, Candida 게놈의 WGS 약물 목표에서 새로운 돌연변이 식별 수, 유전 진화 및 임상 관련 시퀀스 형식을20,,2223의 출현을 추적. 가장 중요 한 것은, 경우에 본질적인 multidrug 저항, WGS 치료 선택22,24이전 저항 부여 돌연변이의 조기 발견에 지원할 수 있습니다.
여기, 우리는 약물 저항 antifungal 에이전트의 다른 클래스와 관련 된 돌연변이 대 한 심사 WGS 사용의 타당성 검사. 우리는 최종 사용자와 진단 균 학 실험실 관점에서 샷건 시퀀싱의 구현에 대 한 방법론을 제시. 우리는 3 세 별도 임상 사례는 생체 외에서 echinocandins와 5 flucytosine 항진균 치료 다음과 같은 시간이 지남에 개발에서 경작 하는 쌍을 분리 하는이 분석에 포함.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:991px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">DensiCHECK Plus</td>
			<td style="width:183px;">BioM&#233;rieux Inc</td>
			<td style="width:151px;">K083536</td>
			<td style="width:383px;">Densitometer used for McFarland readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Sensititre YeastOne</td>
			<td style="width:183px;">TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">YO10</td>
			<td style="width:383px;">Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">22-363-605</td>
			<td style="width:383px;">Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich, Merck</td>
			<td style="width:151px;">T2795&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:383px;">Volume 2.0 mL, natural 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td style="width:183px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:151px;">8320921</td>
			<td style="width:383px;">Used for cell wall lysis of fungal isolate before 
			DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:151px;">A1120</td>
			<td>Does 100 DNA extractions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">P7589</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. 
			Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-1096</td>
			<td style="width:383px;">Includes Box 1 and Box 2&#160; reagents for 96 samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Nextera XT Index Kit v2</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-2001, 
			FC-131-2002, 
			FC-131-2003, 
			FC-131-2004</td>
			<td style="width:383px;">Index set A 
			Index set B 
			Index set C 
			Index set D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500/550 High Output Kit v2&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2004</td>
			<td>300 cycles, More than 250 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500 Mid Output v2 Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2003</td>
			<td>300 cycles, More than 130 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">PhiX Control Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-110-3001</td>
			<td style="width:383px;">To arrange indices from Index kit in order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">TruSeq Index Plate Fixture Kit</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:151px;">FC-130-1005</td>
			<td>&#160;2 Fixtures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">KAPA Library Quantification Kit 
			for Next-Generation Sequencing</td>
			<td style="width:183px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:151px;">KK4824</td>
			<td>Includes premade standards, primers and MasterMix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Janus NGS Express Liquid handling system&#160;</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:151px;">YJS4NGS</td>
			<td>Used for DNA dilutions during sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#160;0.8 mL Storage Plate</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AB0765B</td>
			<td style="width:383px;">MIDI Plate for DNA Library cleanup and 
			normalisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:151px;">A63881</td>
			<td>&#160;Magnetic beads in solution for library purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AM10027</td>
			<td>Used for magnetic bead based DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">OrbiShaker MP&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BT1502</td>
			<td>96-well plate shaker with 4 platforms</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hard Shell PCR Plate</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">HSP9601</td>
			<td>Thin Wall, 96 Well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LightCycler 480 Instrument II&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:151px;">5015278001</td>
			<td>Accomodates 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">&#160;MSB1001</td>
			<td>Clear 96-well plate sealers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">CLCBio</td>
			<td>Software for data analysis, Version 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq500 instrument</td>
			<td style="width:183px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Illumina&#160;</td>
			<td>Benchtop Sequencer used for next generation sequencing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance

Candida glabrata 신속 하 게 될 약물 저항, 특히 azoles 및 echinocandins 돌연변이 수집할 수 있습니다. 유전자 변이의 식별, 필수적 이다 저항 체 외에서 수 자주와 상관 될 임상 실패 감지. 우리는 항진균 약물 저항 C. glabrata의 게놈 넓은 분석에 대 한 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)를 사용 하 여의 타당성을 검사 합니다. 목표는 torecognize enablers와 장벽을 WGS 구현에서 되었고 그 효과 측정. 이 문서는 주요 품질 관리 검사점 및 항진균 요원 민감성 감소와 관련 되었던 유전자 표시를 조사 WGS 방법론의 필수 구성 요소를 설명 합니다. 그것은 또한 데이터 분석의 정확도 테스트 시간 주위 차례 견적.
12 임상, phenotypic 민감성과 C. glabrata 의 한 ATCC 스트레인 항진균 민감도 테스트를 통해 결정 되었다. 이 포함된 3 쌍, 3 환자, 마약 최소 억제 농도 상승 개발에서 격리. 두 쌍에서 두 번째의 각 쌍 개발 저항 echinocandins 격리 합니다. 3 쌍의 두 번째 분리 5 flucytosine에 저항을 개발 했다. 나머지 구성 취약 azole 내성 격리. Echinocandin, azole 5 flucytosine 저항에 연결 하는 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)는 WGS 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 통해 저항 격리에서 확인 되었다.   FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 및 FCY2 같은 유전자 발견 했다 항진균 저항 비 동의어 Snp. 전반적으로, 약 75-fold 읽기 깊이 범위와 참조 게놈에 매핑된 C. glabrata 격리의 WGS 읽기의 98%의 평균. 처리 시간 및 비용 생어 비교 했다 순서.
결론적으로, C. glabrata 의 WGS 다중 PCR/DNA 연속 반응에 대 한 필요 없이 다른 항진균 약물 클래스에 저항에 관련 된 임상적으로 중요 한 유전자 돌연변이 공개에서 가능 했다. 이 항진균 성 부여 대체의 동시 검출에 대 한 임상 실험에서 샷건 시퀀싱 기능 설정으로 긍정적인 단계를 나타냅니다.

C. glabrata (CMRL12에 CMRL1 격리) 임상 균 학 참조 실험실에서 C. glabrata ATCC 90030 및 12 격리 구성, 웨스트 미드 병원, 시드니 공부 했다 13 (표 1). 이러한 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 CMRL-5/CMRL-6 얻은 그들 사이의 역학 링크와 항진균 치료 전후 격리의 3 개 쌍을 포함 24 (표 1).
마이크 CLSI 해석 중단점을 사용 하 여...

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Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

이 연구는 Candida glabrata에 항진균 약물 저항을 부여 하는 유전자에 돌연변이의 분석을 위한 전체 게놈 시퀀싱을 구현. C. glabrata 격리 저항 echinocandins, azoles 및 5-flucytosine 하는 방법론을 설명 하기 위해 시퀀싱 했다. 유전자의 특정 돌연변이 패턴의 존재 여부와 상관 하는 격리의 민감성 프로필.

전체 게놈 시퀀싱 Candida glabrata 검출의 마커 항진균 약물 저항에 대 한의

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

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