Name: whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance
Uploaded: 2017-12-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance at JoVE.com

Эта работа была поддержана центра инфекционных заболеваний и микробиологии, общественного здравоохранения. Авторы не получили каких-либо других источников финансирования для этого исследования. Авторы благодарят Drs Alicia Арнотт, Натан Бахман и Ranjeeta Менон за их квалифицированную консультацию и помощь с весь геном последовательности эксперимент.

Для этого исследования требовалось не этические утверждения.
1. субкультуры и посевные подготовка Candida glabrata
<ol><li>Выберите группу изолятов C.glabrata быть изучены, которые также должны включать по крайней мере один C. glabrata американский тип культуры коллекции (ЦУ?...

<ol>
	<li>Beyda, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKS+mutant+Candida+glabrata:+risk+factors+and+outcomes+in+patients+with+candidemia.">FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia.</a> Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).</li><li>Chapeland-Leclerc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+flucytosine,+azole,+and+caspofungin+resistance+in+Candida+glabrata.+bloodstream+isolates+serially+obtained+from+a+hematopoietic+stem+cell+transplant+recipient.">Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).</li><li>Glockner, A., Cornely, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata-unique+features+and+challenges+in+the+clinical+management+of+invasive+infections.">Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections.</a> Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).</li><li>Pfaller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+decreased+susceptibility+and+resistance+to+echinocandins+among+fluconazole-resistant+bloodstream+isolates+of+Candida+glabrata.">Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata.</a> J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).</li><li>Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+emergence+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata+resulting+in+clinical+and+microbiologic+failure.">Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).</li><li>Klevay, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+and+outcome+of+Candida+glabrata+versus+Candida+albicans+bloodstream+infection.">Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).</li><li>Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCAST+technical+note+on+the+EUCAST+definitive+document+EDef+7.2:+method+for+the+determination+of+broth+dilution+minimum+inhibitory+concentrations+of+antifungal+agents+for+yeasts+EDef+7.2+(EUCAST-AFST).">EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST).</a> Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+Method+for+Broth+Dilution+Antifungal+Susceptibility+Testing+of+Yeasts.">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.</a> Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).</li><li>Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danish+Fungaemia+Study,+G.+Caspofungin+Etest+susceptibility+testing+of+Candida+species:+risk+of+misclassification+of+susceptible+isolates+of+C.+glabrata+and+C.+krusei+when+adopting+the+revised+CLSI+caspofungin+breakpoints.">Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).</li><li>Singh-Babak, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+evolution+and+mechanism+of+echinocandin+resistance+in+Candida+glabrata.">Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata.</a> PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).</li><li>Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+perspectives+on+echinocandin+resistance+among+Candida+species.">Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species.</a> Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).</li><li>Dudiuk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+of+classical+PCRs+for+detection+of+mutations+in+Candida+glabrata+FKS.+genes+linked+with+echinocandin+resistance.">Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).</li><li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>Barzon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+technologies+in+diagnostic+virology.">Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology.</a> J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).</li><li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing.">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).</li><li>Koser, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+use+of+microbial+whole+genome+sequencing+in+diagnostic+and+public+health+microbiology.">Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology.</a> PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).</li><li>Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+pathogen+discovery+and+surveillance.">The changing face of pathogen discovery and surveillance.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).</li><li>Sintchenko, V., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pathogen+genomics+in+assessing+disease+transmission.">The role of pathogen genomics in assessing disease transmission.</a> BMJ. 350, 1314 (2015).</li><li>Garnaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+offers+new+insights+into+the+resistance+of+Candida+spp.+to+echinocandins+and+azoles.">Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles.</a> J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).</li><li>Sanmiguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+potential+applications+in+fungal+genomics.">Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics.</a> Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).</li><li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+platforms.">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).</li><li>Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+in+the+mycology+lab.">Next-Generation Sequencing in the mycology lab.</a> Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).</li><li>Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+as+a+diagnostic+test:+challenges+and+opportunities.">Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities.</a> Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).</li><li>Biswas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genetic+markers+of+resistance+to+echinocandins,+azoles+and+5-fluorocytosine+in+Candida+glabrata+by+next-generation+sequencing:+a+feasibility+study.">Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study.</a> Clin Microbiol Infect. , (2017).</li><li>Glasel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+nucleic+acid+purities+monitored+by+260nm/280nm+absorbance+ratios.">Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios.</a> BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).</li><li>Cannon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-mediated+antifungal+drug+resistance.">Efflux-mediated antifungal drug resistance.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+mutations+in+CgPDR1.+of+Candida+glabrata+not+only+mediate+antifungal+resistance+but+also+enhance+virulence.">Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence.</a> PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).</li><li>Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata:+a+review+of+its+features+and+resistance.">Candida glabrata: a review of its features and resistance.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).</li><li>Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Candida+glabrata+FKS1+and+FKS2+mutations+on+echinocandin+sensitivity+and+kinetics+of+1,3-beta-D-glucan+synthase:+implication+for+the+existing+susceptibility+breakpoint.">Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).</li><li>Arendrup, M. C., Perlin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandin+resistance:+an+emerging+clinical+problem.">Echinocandin resistance: an emerging clinical problem.</a> Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).</li><li>Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Mechanisms+of+Flucytosine+Resistance+in+C.+glabrata+Unveiled+by+a+Chemogenomics+Analysis+in+S.+cerevisiae.">New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).</li><li>de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesins+in+human+fungal+pathogens:+glue+with+plenty+of+stick.">Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick.</a> Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).</li><li>de Groot, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+wall+of+the+human+pathogen+Candida+glabrata:+differential+incorporation+of+novel+adhesin-like+wall+proteins.">The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins.</a> Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).</li><li>Vale-Silva, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+adhesin+gene+EPA1+mediated+by+PDR1+in+Candida+glabrata+leads+to+enhanced+host+colonization.">Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li></ol>

Это исследование определяет целесообразность, приблизительные сроки и точность обнаружения WGS-руководствуясь лекарственной устойчивости в C. glabrata. Время обработки (ТАТ) для подготовки библиотека и последовательности было четыре дня и отчетности проанализированы результаты одно?...

Кандида glabrata это все чаще встречающихся возбудителя с значение как вид, который проявляет устойчивость к азолов, а также совсем недавно,1,echinocandins,2,,3. В отличие от диплоидных C. albicansгаплоидным геномом C. glabrata может позволить ему приобрести мутации и более легко развить множественной лекарственной устойчивости. Совместное сопротивление для обоих классов наркотиков был также сообщили4. Таким образом ранние оценки противогрибковые восприимчивости и выявления лекарственной устойчивости в C. glabrata имеет решающее значение для правильного, целевые терапии в контексте противогрибковые руководством ограничить водителей антибиотикорезистентности1 , 5 , 6. Создание эффективного рабочего процесса быстро обнаружить наличие подтверждающих мутаций, связанных с Сопротивления биомаркеров в устойчивые изолятов будет также поможет улучшить предписывающих решениях и клинические исходы.
Противогрибковые восприимчивости обычно оценивается путем измерения минимальный тормозной концентрации (MIC), которая определяется как низкая концентрация препарата, что приводит к значительному сокращению темпов роста по сравнению с немедикаментозными роста микроорганизма управления. Клинические и лабораторные стандарты Института (CLSI) и Европейского комитета по тестирования по антимикробной чувствительности (EUCAST) имеют стандартизированные методы испытаний для определения MIC восприимчивости более точной и последовательной в7, 8. Однако утилита противогрибковые MIC остается ограниченным особенно для echinocandins, в частности отношении межлабораторных сравнений различных методологий и условия которых используются9. Существует также неопределенной корреляции с ответом на лечение echinocandin и неспособность отличить WT Мико (или подверженных) изоляты от тех, кто укрывает FKS мутации (echinocandin устойчивые штаммы)10,11. Несмотря на наличие подтверждающих сингл ген ГКДЗ и Сэнгер последовательности противогрибковые сопротивление, реализация результатов часто задерживается из-за отсутствия одновременного обнаружения нескольких сопротивления маркеры5,-12. Следовательно параллельных обнаружения сопротивления вручение мутаций в разных местах в геноме, включаемые на основе последовательности анализа всего генома, предлагает значительные преимущества в сравнении с текущими подходами.
Весь геном последовательности (РГ) успешно реализованы для отслеживания передачи болезни во время вспышек, а также подход для генома общесистемного риска оценки и наркотиков сопротивления, тестирование в13бактерий и вирусов. Последние достижения в технологии секвенирование нуклеиновой кислоты сделали всего генома (РГ) патогенов в клинически осуществимое поворот вокруг времени технически и экономически осуществимы. Секвенирования ДНК обеспечивает важные преимущества по сравнению с другими методами идентификации возбудителя и характеристика, занятых в микробиологии лаборатории14,,1516. Во-первых он обеспечивает универсальное решение с высокой пропускной способностью, скорость и качество. Последовательность может быть применен к любой из микроорганизмов и позволяет масштаба на местных или региональных лабораторий. Во-вторых он производит данные в формате «будущее» поддаются сравнения на национальном и международном уровнях. Наконец был увеличен потенциальной полезности WGS в медицине быстрый рост общественного данных баз, содержащих ссылку геномов, которые могут быть связаны с базы эквивалентных данных, которые содержат дополнительные метаданные клинических и эпидемиологических17 ,18.
Недавние исследования продемонстрировали полезность WGS для идентификации противогрибковые сопротивления маркеров из клинических изолятов Candida spp. 10 , 19 , 20. это главным образом объясняется наличие высокой пропускной способностью benchtop секвенсеры, установленным биоинформатики трубопроводов и снижается стоимость секвенирования21,22. Преимущество грибковых WGS Сэнгер, последовательности, что РГ позволяет секвенирования геномов несколько на один запуск. Кроме того РГ Candida геномов может идентифицировать новые мутации в наркотиков цели, отслеживать генетической эволюции и появление клинически значимых типов последовательности20,,2223. Самое главное в случае внутренней множественной лекарственной устойчивости, WGS может помочь раннего выявления мутаций присвоении сопротивления до лечения выбор22,24.
Здесь мы изучили возможности WGS-поддержкой скрининга для мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью к различным классам противогрибковых препаратов. Мы представляем методологии для осуществления WGS с точки зрения лабораторных диагностических микология и конечных пользователей. Мы включили в этот анализ, что три изолировать пар, культивированный из трех отдельных клинических случаев, в которых в vitro устойчивость к echinocandins и 5-флуцитозин разработаны со временем, после противогрибковое лечение.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:991px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">DensiCHECK Plus</td>
			<td style="width:183px;">BioM&#233;rieux Inc</td>
			<td style="width:151px;">K083536</td>
			<td style="width:383px;">Densitometer used for McFarland readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Sensititre YeastOne</td>
			<td style="width:183px;">TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">YO10</td>
			<td style="width:383px;">Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">22-363-605</td>
			<td style="width:383px;">Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich, Merck</td>
			<td style="width:151px;">T2795&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:383px;">Volume 2.0 mL, natural 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td style="width:183px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:151px;">8320921</td>
			<td style="width:383px;">Used for cell wall lysis of fungal isolate before 
			DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:151px;">A1120</td>
			<td>Does 100 DNA extractions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">P7589</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. 
			Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-1096</td>
			<td style="width:383px;">Includes Box 1 and Box 2&#160; reagents for 96 samples</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:275px;">Nextera XT Index Kit v2</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-131-2001, 
			FC-131-2002, 
			FC-131-2003, 
			FC-131-2004</td>
			<td style="width:383px;">Index set A 
			Index set B 
			Index set C 
			Index set D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500/550 High Output Kit v2&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2004</td>
			<td>300 cycles, More than 250 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq 500 Mid Output v2 Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-404-2003</td>
			<td>300 cycles, More than 130 samples per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">PhiX Control Kit</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:151px;">FC-110-3001</td>
			<td style="width:383px;">To arrange indices from Index kit in order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">TruSeq Index Plate Fixture Kit</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:151px;">FC-130-1005</td>
			<td>&#160;2 Fixtures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">KAPA Library Quantification Kit 
			for Next-Generation Sequencing</td>
			<td style="width:183px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:151px;">KK4824</td>
			<td>Includes premade standards, primers and MasterMix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Janus NGS Express Liquid handling system&#160;</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:151px;">YJS4NGS</td>
			<td>Used for DNA dilutions during sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">&#160;0.8 mL Storage Plate</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AB0765B</td>
			<td style="width:383px;">MIDI Plate for DNA Library cleanup and 
			normalisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:151px;">A63881</td>
			<td>&#160;Magnetic beads in solution for library purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">AM10027</td>
			<td>Used for magnetic bead based DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">OrbiShaker MP&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:151px;">BT1502</td>
			<td>96-well plate shaker with 4 platforms</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hard Shell PCR Plate</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">HSP9601</td>
			<td>Thin Wall, 96 Well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LightCycler 480 Instrument II&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:151px;">5015278001</td>
			<td>Accomodates 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical&#160;</td>
			<td style="width:183px;">BioRad</td>
			<td style="width:151px;">&#160;MSB1001</td>
			<td>Clear 96-well plate sealers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">CLCBio</td>
			<td>Software for data analysis, Version 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">NextSeq500 instrument</td>
			<td style="width:183px;">Illumina&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Illumina&#160;</td>
			<td>Benchtop Sequencer used for next generation sequencing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole genome sequencing of candida glabrata for detection of markers of antifungal drug resistance

Кандида glabrata можно быстро приобрести мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, особенно для азолов и echinocandins. Определение генетических мутаций имеет важное значение, как сопротивление обнаруженные в vitro часто может быть соотнесена с клинической недостаточностью. Мы изучили возможность использования всего генома (РГ) для анализа генома общесистемной противогрибковым препаратам в C. glabrata. Цель была и создают условия и препятствия в осуществлении WGS и оценивать ее эффективность. В этом документе изложены основные качества контроля контрольно-пропускных пунктов и основных компонентов WGS методологии для изучения генетических маркеров, связанные с уменьшенной восприимчивости к противогрибковых препаратов. Она также оценивает точность анализа данных и поворот вокруг времени тестирования.
Фенотипические восприимчивость 12 клинических и один ATCC штамм C. glabrata был определен путем противогрибковые восприимчивость тестирования. Эти включены три изолировать пар, из трех пациентов, разработанные рост минимальный тормозной концентрации наркотиков. В две пары второй изолировать каждой пары разработан сопротивления echinocandins. Второй изолировать третьей пары развилась устойчивость к 5-флуцитозин. Оставшиеся состоит из восприимчивых и устойчивостью азол изолятов. Единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генов, связанных с echinocandin, азол и 5-флуцитозин сопротивления были подтверждены в устойчивые изолятов через WGS, с помощью следующего поколения последовательности.  Non синоним ОНП в противогрибковые сопротивления, были определены гены как FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 и FCY2 . В целом, в среднем 98% говорится WGS изолятов C. glabrata , сопоставляются с геном ссылку с охватом около 75-fold чтения глубины. Сроки и стоимость, были сопоставимы с Сэнгер последовательности.
В заключение WGS C. glabrata было возможно в выявление мутаций гена клинически, участвующих в сопротивлении классов различных противогрибковый препарат без необходимости использования нескольких последовательности реакций ПЦР/ДНК. Это представляет собой позитивный шаг на пути к созданию WGS возможности в клинической лаборатории для одновременного обнаружения противогрибковые сопротивления присвоении замен.

Тринадцать C. glabrata составе изолятов ATCC 90030 и 12 C. glabrata от клинической микологии референс-лаборатории (изоляты CMRL1 до CMRL12), были изучены больницы Westmead, Сидней (таблица 1). К ним относятся три пары изолятов, CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 и CMRL-5/CMRL-6, полученные до и после противогрибк...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance at JoVE.com

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Это исследование реализован всего генома для анализа мутаций в генах, присвоении противогрибковым препаратам в Candida glabrata. C. glabrata изолятов устойчивых к echinocandins, азолов и 5-флуцитозин, были упорядочены для иллюстрации методологии. Восприимчивость профили изолятов, связаны с наличием или отсутствием структур конкретных мутаций в генах.

Весь геном последовательности Candida glabrata для обнаружения маркеров противогрибковым препаратам

Candida glabrata can rapidly acquire mutations that result in drug resistance, especially to azoles and echinocandins. Identification of genetic mutations ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Whole Genome Sequencing of Candida glabrata for Detection of Markers of Antifungal Drug Resistance

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Производство и обнаружения активных форм кислорода (АФК) в Раки

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Черенковского свечения Imaging (CLI) для мониторинга терапии рака

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Идентификация<em&gt; Спящая красавица</em&gt; Транспозонов вставки в твердых опухолей с использованием Linker-опосредованного ПЦР

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Ортотопическая мышиной модели человеческого рака простаты Метастазы

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Метод мониторинга Доступное ВИЧ-1 Устойчивость к лекарству для настройки ограниченного ресурса

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Черенкова Люминесценция Визуализация межлопаточной бурой жировой ткани

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Раннее выявление лекарственно-индуцированный почечной дисфункции гемодинамических Использование Сонографические технологии в Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Реализация<em&gt; In Vitro</em&gt; Лекарственной устойчивости Анализы: Максимизация потенциала для раскрытия клинически значимых механизмов сопротивления

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

Ячеечная модель культуры сопротивления артерий

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...