Name: simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00
Duration: 10 min 5 s
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हम IIF प्रयोगों के प्रदर्शन और छवियों का संग्रह करने के लिए एंड्रयू Zenger धंयवाद ।

प्रोटोकॉल ट्रिनिटी जैव प्रौद्योगिकी संस्थागत मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन ।
1. नमूना और सब्सट्रेट तैयारी
<ol><li>पाउच की अनुमति दें सब्सट्रेट स्लाइड युक्त (प्रत्येक स्लाइड पर 12 कुओं के साथ ग्लास स्लाइड या तो HEp2 या एेसी-2 + HEp2 को सेल मिश्रण) equilibrate करने के लिए इष्टतम प्रदर्शन के लिए कमरे के तापमान को रोकने के लिए और स्लाइड सतह पर नमी के संघनित्र से पहले नमूना के अलावा । यह लगभग 10-15 मिनट के बीच ले जाना चाहिए ।</li>
	<li>एक बार कमरे के तापमान के लिए equilibrated, ध्यान से उंहें थैली के पक्ष को छूने के बिना उंगलियों का उपयोग सब्सट्रेट स्लाइड हटा दें ।</li>
	<li>स्लाइड लेबल और उन्हें एक मशीन चैंबर में जगह (कमरे के तापमान पर) कागज तौलिए के साथ तैयार नमूना और संयुग्म की मशीन के दौरान स्लाइड के सूखने को रोकने के लिए पानी से लथपथ । नोट: गैर विशिष्ट धुंधला शुष्क कुओं से परिणाम कर सकते हैं; मशीन चैंबर के अंदर एक गीला कागज तौलिया नमी प्रदान करता है और अच्छी तरह सूखापन रोकता है ।</li>
</ol>2. नियंत्रण और नमूनों के अलावा
<ol><li>नकारात्मक/सकारात्मक नियंत्रण के लगभग ५० µ एल वितरण, इस अध्ययन में वर्णित के रूप में DFS70-ANA सकारात्मक सीरा के संयोजन, या व्यक्तिगत स्लाइड कुओं पर रोगी सीरम नमूने ।</li>
	<li>स्लाइड पर प्रत्येक कुआं में नियंत्रण (ओं) और नमूनों का वितरण करें ।</li>
	<li>अच्छी तरह से पार संदूषण को रोकने के लिए, कुओं को भरने से बचें । जबकि कुओं को नहीं भरना, अच्छी तरह से सतह की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने और हवा के बुलबुले से बचने के । नोट: अनुशंसित वॉल्यूम ५० µ l चरण २.१ के अनुसार है ।</li>
	<li>कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन चैंबर और गर्मी स्लाइड पर ढक्कन प्लेस । यदि रोगी के सीरम में कोई ANA मौजूद है, यह इस मशीन की अवधि के दौरान एक अच्छी तरह से मौजूद कोशिकाओं को बांध देगा ।</li>
	<li>एक बार जब मशीन अवधि खत्म हो गया है, मशीन चैंबर से स्लाइड को हटा दें । स्लाइड को टैब छोर पर रखें और लगभग 10 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ धीरे कुल्ला बफर किट में प्रदान की, एक पिपेट का उपयोग कर या 10-15 एस के लिए पंजाबियों से भरा एक चोंच में स्लाइड हस्तांतरण के साथ एक Coplin जार में तुरंत स्थानांतरित करें पंजाब वॉश बफर और वॉश ( भिगोएं) 10 मिनट के लिए सभी शेष स्लाइड के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ । नोट: जब एक Coplin जार में एकाधिक स्लाइड्स रखकर, यह सुनिश्चित करें कि स्लाइड का कक्ष पक्ष किसी अंय स्लाइड से संपर्क नहीं करता, क्योंकि यह कांच स्लाइड पर कक्षों को क्षति पहुंचाने में परिणाम देगा ।</li>
</ol>3. फ्लोरोसेंट संयुग्म के अलावा
<ol><li>Coplin जार से एक समय में केवल एक स्लाइड निकालें । स्लाइड से अतिरिक्त पंजाबियों धोने बफर हटाने के लिए, धीरे से नल या कागज तौलिया पर स्लाइड दाग । प्रत्येक किट FITC लेबल विरोधी मानव आईजीजी फ्लोरोसेंट संयुग्म के साथ प्रदान की जाती है । पर एक अच्छी तरह से, धीरे (लगभग ५० µ एल) प्रदान की संयुग्म के 1 ड्रॉप लागू होते हैं ।</li>
	<li>30 मिनट के लिए बंद धुंधला मशीन चैंबर में स्लाइड की मशीन । नोट: एफसी विशिष्ट आईजीजी संयुग्म के उपयोग की सिफारिश की है । यदि रोगी के सीरम में कोई अना उपस्थित है, तो संयुग्म इस मशीनीकरण अवधि के दौरान प्रत्येक कुआं में मौजूद कोशिकाओं को बाँध देगा, जो कुएँ में मौजूद कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिदीप्ति में परिणाम देता है. संयुग्म प्रकाश के प्रति संवेदनशील है । बंद गर्मी चैंबर प्रत्येक अच्छी तरह से में मौजूद कोशिकाओं के संयुग्म प्रतिक्रिया के साथ प्रकाश हस्तक्षेप को रोकने में मदद मिलेगी ।</li>
	<li>एक बार जब मशीन अवधि खत्म हो गया है, मशीन चैंबर से स्लाइड को हटा दें । स्लाइड को टैब छोर पर रखें और लगभग 10 मिलीलीटर पंजाबियों धोने बफर किट में प्रदान की, एक पिपेट का उपयोग कर या एक चोंच में पंजाबियों से भरा के साथ धीरे कुल्ला । पंजाब के साथ एक Coplin जार में तुरंत स्लाइड स्थानांतरण बफर और धोने के लिए (सोख) 10 मिनट के लिए सभी शेष स्लाइड के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ । नोट: जब एक Coplin जार में एकाधिक स्लाइड्स रखकर, यह सुनिश्चित करें कि स्लाइड का कक्ष पक्ष किसी अंय स्लाइड से संपर्क नहीं करता, क्योंकि यह कांच स्लाइड पर कक्षों को क्षति पहुंचाने में परिणाम देगा ।</li>
	<li>coverslips कि एक सूखी कागज तौलिया पर किट में प्रदान की जाती है जगह है । बढ़ते मीडिया किट के साथ प्रदान की जाती है । coverslip के नीचे किनारे करने के लिए, एक लाइन में बढ़ते मीडिया की 3-4 बूंदों के बीच लागू होते हैं ।</li>
	<li>धोने बफर युक्त Coplin जार से एक समय में एक स्लाइड बाहर ले लो । अतिरिक्त धोने बफर हटाने के लिए, धीरे नल या कागज तौलिया पर स्लाइड दाग ।</li>
	<li>स्लाइड को coverslip के किनारे पर स्लाइड के निचले किनारे रखकर coverslip पर धीरे से कम करें । इस स्लाइड के शीर्ष किनारे करने के लिए प्रवाह करने के लिए निचले किनारे coverslip पर मौजूद बढ़ते मीडिया की अनुमति देता है, और हवा के बुलबुले के गठन को कम करता है, जो एक स्लाइड की एक अच्छी तरह से पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । नोट: स्लाइड पर कवर स्लाइड को माउंट करने के लिए ंयूनतम दबाव का उपयोग किया जाना चाहिए । किसी भी अतिरिक्त दबाव कवर फिसल जाता है की पार्श्व आंदोलन पैदा कर सकता है । इससे कोशिकाओं की monolayer तैयारी को क्षति पहुंच सकती है और इसका परिणाम विकृत हो सकता है ।</li>
	<li>2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड स्टोर. स्लाइड् स की जांच करें जैसे ही वे घुड़सवार हों या ४८ h के भीतर हों । नोट: अब भंडारण पैटर्न और फ्लोरोसेंट संकेत की गिरावट में परिणाम हो सकता है ।</li>
</ol>4. सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों की पहचान
<ol><li>एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड देखें एक FITC फिल्टर सेट का उपयोग कर, एक अंधेरे कमरे में स्थित.</li>
	<li>सकारात्मकता और पैटर्न के बारे में अंतिम व्याख्या करने के लिए 200X या अधिक के एक इज़ाफ़ा पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत विशिष्ट चमकीले हरे प्रतिदीप्ति के लिए जांच करें । सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का निरीक्षण करें । नोट: सकारात्मक नियंत्रण नाभिक में चमकीले हरे प्रतिदीप्ति (चित्रा 2a, सजातीय) प्रदर्शित करेगा । नकारात्मक नियंत्रण एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोई विशिष्ट हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करेगा ।</li>
	<li>प्रत्येक कुआं के लिए सकारात्मक/नकारात्मक परिणाम रिकॉर्ड और सकारात्मक मामलों के लिए ANA पैटर्न शामिल हैं ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011)</li><li>Meroni, P. L., Schur, P. 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Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li></ol>

लेखक किशोर Malyavantham और लक्ष्मणन सुरेश ट्रिनिटी बायोटेक, यूएसए के कर्मचारी हैं.

परमाणु और cytoplasmic प्रतिजनों के लिए एंटीबॉडी प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों में अत्यधिक प्रचलित हैं । हालांकि कोई एकल परख सर्वोत्तम संभव संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करता है, IIF द्वारा एेसी-2 व्यापक रूप से प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए एक अति संवेदनशील और लागत प्रभावी स्क्रीनिंग विधि के रूप में माना जाता है2,3,4 . अधिक से अधिक ५० साल के लिए IIF प्रोटोकॉल की व्यापकता के बावजूद, IIF परख की सटीकता तकनीशियन के कौशल पर अत्यधिक निर्भर है, प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत कदम के सावधान निष्पादन, और एक अच्छी तरह से बनाए रखा का उपयोग कर परिणामों की सटीक व्याख्या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप । प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग का निदान एेसी-2 द्वारा IIF के रूप में किसी एकल सीरम परीक्षण के परिणामों पर आधारित नहीं होना चाहिए ।
उच्च गुणवत्ता वाले पानी (आसुत/), मानकीकृत किट घटकों का उपयोग (एेसी के साथ स्लाइड-2 सेल monolayers, नमूना मंदक, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, पूर्व पतला अनुकूलित FITC-संयुग्म, और बढ़ते मध्यम) का प्रयोग reagents के पुनर्गठन परिणामों पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है । कुओं पर नियंत्रण या नमूनों के अलावा लंघन झूठी नकारात्मक व्याख्या को प्रोत्साहित कर सकते हैं । किसी भी बिंदु पर स्लाइड के सूखने के बाद नमूना या नियंत्रण के अलावा artifactual झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं में परिणाम कर सकते हैं और/ बहुत ज्यादा धोने बफर स्लाइड पर छोड़ दिया या स्लाइड कुओं के सुखाने बढ़ते मध्यम के औषधालय से पहले कलाकृतियों में परिणाम कर सकते हैं । मध्यम बढ़ते या स्लाइड सतह पर एक coverslip रखने से पहले बुलबुले पैदा की अपर्याप्त मात्रा जोड़ने प्रतिक्रियाओं में परिणाम कर सकते है कि धुंधला देखो या ध्यान से बाहर जब माइक्रोस्कोप के तहत मनाया । घुड़सवार स्लाइड 2-8 ° c पर संग्रहीत और झूठी नकारात्मक या artifactual परिणाम को कम करने के लिए समय की सिफारिश की खिड़की के भीतर विश्लेषण किया जाना चाहिए ।
एक अच्छी तरह से बनाए रखा महामारी-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप जो एक उपयुक्त एलईडी/पारा/क्सीनन प्रकाश स्रोत और उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर है कि क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे है सहित साफ ऑप्टिकल घटकों का उपयोग सही IIF परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । सकारात्मक/नकारात्मक प्रतिक्रिया तीव्रता और पैटर्न की व्याख्या भेदभाव के लिए अंत उपयोगकर्ता प्रशिक्षण महत्वपूर्ण है । एेसी-2 IIF परख प्रक्रियाओं, माइक्रोस्कोप विंयास, और अंत प्रयोक्ता प्रशिक्षण या कौशल में मानकीकरण की कमी की चपेट में हैं । सहमति नामकरण और प्रतिनिधि पैटर्न और विभिंन निर्माताओं का उपयोग कर अधिग्रहीत छवियों के उदाहरण शैक्षिक प्रयोजनों के लिए ICAP (< www. ANApatterns. org >) द्वारा उपलब्ध किए गए है4। एक एेसी-2 सेल पैटर्न वर्गीकरण पेड़ विभिंन परमाणु, cytoplasmic के लिए ICAP द्वारा प्रदान की है, और mitotic पैटर्न एक मूल्यवान को विभिंन पैटर्न है कि अप्रशिक्षित आंखें4के समान लग सकता है के बीच सूक्ष्म अंतर जानने के संसाधन है । एक चुनौतीपूर्ण पैटर्न के प्राथमिक उदाहरणों में से एक DFS70 जो भी एक स्व-प्रतिरक्षित शर्त के साथ एक विशिष्ट सहयोग का अभाव है, और के रूप में पिछले वर्गों में इस पद्धति के स्वस्थ आबादी में अत्यधिक प्रचलित है5चर्चा की ।
अध्ययन के आधार पर, विरोधी DFS70 एंटीबॉडी की व्यापकता स्वस्थ साथियों के बीच बदलती हैं, ana स्क्रीनिंग आबादियों, और एना सकारात्मक व्यक्तियों प्रणालीगत प्रतिरक्षा रोग का कोई सबूत के साथ9,16,20 ,30,31. DFS70 एंटीबॉडी को अलगाव में होने के साथ ही अंय रोग के साथ-ANA पैटर्न जुड़े सूचित किया गया है । पृथक या monospecific DFS70 पैटर्न स्वस्थ नियंत्रण के 2-22% में रिपोर्ट लेकिन स्व-प्रतिरक्षित आमवातीरोग३२ के साथ मामलों में से कम 1% में है । इन प्रवृत्तियों के आधार पर, DFS70 मोनो सकारात्मक पैटर्न एक कसौटी के रूप में ICAP समिति3,31,३२द्वारा स्व-प्रतिरक्षित आमवाती रोगों में शामिल करने के लिए प्रस्तावित किया गया था । ICAP समिति, autoantibody परीक्षण नामकरण और एेसी-2 IIF परिणामों की व्याख्या के अनुरूपता को बढ़ावा देने के लिए स्थापित, ANA स्क्रीनिंग परिणाम4रिपोर्टिंग जबकि DFS70 धनात्मकता रिपोर्टिंग की सिफारिश की ।
एक प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग DFS70 मोनो-धनात्मकता के आधार पर सत्तारूढ़ करने से पहले, यह वर्तमान स्क्रीनिंग और पुष्टि विधियों की स्थिति की समीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है (विशेष रूप से उन DFS70 के लिए विशिष्ट). एेसी DFS70 धनात्मकता के बीच समझौता-2 IIF और ठोस चरण पुष्टि परख अर्थात् एलिसा, CLIA, और रेखा immunoassay/डॉट दाग तरीके) विभिंन अध्ययनों के बीच व्यापक रूप से विभिंन13,22,25,३३ . IIF व्याख्या और पुष्टि परख पैरामीटर है कि इस असहमति के लिए योगदान पहले5,13,३४चर्चा की गई है । विरोधी के लिए हाल ही में प्रस्तावित immunoadsorption दृष्टिकोण DFS70 एंटीबॉडी पुष्टि वर्तमान ठोस चरण (DFS70 के लिए) परख की कमियों में से कुछ पते, लेकिन प्रयोगशालाओं के लिए संदिग्ध नमूनों पर IIF प्रक्रिया में एक अतिरिक्त कदम प्रदर्शन की आवश्यकता है, जो लागत और परिणाम रिपोर्टिंग के लिए बदलाव समय13बढ़ाता है । इस अतिरिक्त कदम की आवश्यकता नहीं है जब एेसी-2 अभिजात वर्ग/DFS70 KO कोशिकाओं नियमित ANA स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है । यह कुल लागत कम कर देता है और इसके अलावा वहां DFS70 पैटर्न के रूप में बदलाव के समय पर कोई प्रभाव नहीं है प्रारंभिक स्क्रीनिंग कदम27में समझदार है । पारंपरिक एेसी-2 IIF विधि का उपयोग कर के एक अतिरिक्त नुकसान यह है कि यह DFS70 पैटर्न सह स्क्रीनिंग चरण में अंय ANA पैटर्न के साथ होने वाली अंतर करने में असमर्थ है । हालांकि, इस नुकसान एेसी-2 अभिजात वर्ग/DFS70 KO कोशिकाओं27के उपयोग से दूर है ।
परम्परागत एेसी-2 का तुलनात्मक मूल्यांकन और नए इंजीनियर एेसी-2 (एेसी-2 एलीट/DFS70 KO) ANA सकारात्मक नियंत्रण और एक मोनो पॉजिटिव DFS70 नियंत्रण के साथ उनके संयोजन का उपयोग कर, एक साथ करने के लिए नए सब्सट्रेट की क्षमता की उपयोगिता का प्रदर्शन अनस के लिए स्क्रीन और DFS70 पैटर्न (चित्रा 1) की पुष्टि करें । नई सब्सट्रेट के लिए IIF प्रोटोकॉल पारंपरिक एेसी-2 IIF विधि के समान है । सभी रोग के लिए व्याख्या योजना-संबद्ध ANA पैटर्न DFS70 पैटर्न के अपवाद के साथ समान है (तालिका 1) । दोनों मोनो सकारात्मक और मिश्रित DFS70 पैटर्न की व्याख्या अपेक्षाकृत आसान नई विधि का उपयोग किया गया था और यह अतिरिक्त परख (चित्र 1b) वारंट नहीं है. नैदानिक प्रयोगशाला में इस नई विधि के कार्यांवयन DFS70 पैटर्न की व्याख्या के साथ जुड़े चुनौती सरल और आगे का खुलासा रोग द्वारा ana स्क्रीनिंग के समग्र सटीकता में सुधार-संबद्ध ANA पहले से छुपा पैटर्न DFS70 (मिश्रित पैटर्न) ।

अनस स्व-प्रतिरक्षित मध्यस्थता प्रणालीगत संयोजी ऊतक रोगों की एक बानगी है1. कई तरीके स्क्रीनिंग और अनस की पुष्टि के लिए कार्यरत हैं । IIF का उपयोग कर तकनीक एेसी-2 सब्सट्रेट सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और अक्सर स्क्रीनिंग के लिए विधि की सिफारिश की है अनस1,2। ठोस चरण निदान परख के तरीके में अग्रिम के बावजूद जैसे एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा), एंजाइम immunoassay (ईआईए), chemiluminescence immunoassay (CLIA), और मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख, IIF द्वारा एेसी-2 सबसे प्रचलित स्क्रीनिंग है अपनी नैदानिक उपयोगिता और लागत प्रभावशीलता के कारण विधि1,2,3। उपर्युक्त परख प्रौद्योगिकियों शुद्ध देशी या संयोजक के एक सीमित सेट पर निर्भर करते हैं, जबकि एेसी-2 ग्लास स्लाइड कुओं पर सेल monolayer तैयार करना अपने प्राकृतिक रूप में एक व्यापक सरणी, एंटीजन के पार वितरित नाभिक और कोशिका, कि रोगी सीरा या सकारात्मक नियंत्रण से एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया, पैटर्न है कि विभिंन स्व-प्रतिरक्षित शर्तों के साथ जुड़े रहे है की एक भीड़ में जिसके परिणामस्वरूप । इन नमूनों को नाभिकीय, cytoplasmic, और mitotic कक्षों में antigen के स्थान के आधार पर पैटर्न में वर्गीकृत किया गया है । प्रत्येक प्रतिमान और संबंधित antigen/एंटीजन और रोग स्थितियां अच्छी तरह से4विशेषता हैं । IIF विधि में, रोगी और नियंत्रण सीरा ग्लास स्लाइड कुओं पर मशीन है कि एेसी-2 कोशिकाओं के एक monolayer संस्कृति उपयुक्त अपने प्राकृतिक विंयास में एंटीजन की एक भीड़ को संरक्षित करने के लिए तय कर रहे हैं । रोगी सीरा या सकारात्मक नियंत्रण में एंटीबॉडी को मशीनीकरण के दौरान सब्सट्रेट (ग्लास स्लाइड अच्छी तरह से) पर एेसी-2 कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत एंटीजन को बांधने की अनुमति दी जाती है । बाद मशीन, असीम एंटीबॉडी धुल रहे है और आईजीजी वर्ग की बाध्य एंटीबॉडी fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी एजेंट के साथ पता लगाया है । अनबाउंड बताया-संयुग्म दूर धोया जाता है और कांच coverslips एक बढ़ते माध्यम है कि प्रतिक्रियाओं को बरकरार रखता है और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन की सुविधा का उपयोग कर स्लाइड के शीर्ष पर बढ़ रहे हैं । प्रतिक्रियाओं एक प्रतिदीप्ति उपयुक्त उत्तेजना-उत्सर्जन फिल्टर संयोजन है कि रिपोर्टर के अनुसार (FITC रिपोर्टर, एक नैदानिक माइक्रोस्कोप के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ सुसज्जित के तहत मनाया जाता है उत्तेजना रेंज के साथ फिल्टर का उपयोग करता है ४६७ -४९८ एनएम और ५१३-५५६ एनएम का उत्सर्जन रेंज) । ANA की उपस्थिति कोशिकाओं में विशिष्ट संरचनाओं के एक चमकदार हरी प्रतिदीप्ति द्वारा प्रदर्शन किया है । स्वचालित परख प्लेटफार्मों के विपरीत, IIF पद्धति सीरियल कमजोर सीरा और धुंधला पैटर्न जो महत्वपूर्ण उपयोगकर्ता विशेषज्ञता की आवश्यकता है के दृश्य सकारात्मक दृढ़ संकल्प के श्रमसाध्य प्रक्रिया पर निर्भर करता है5,6। इन सीमाओं के बावजूद, IIF द्वारा एेसी-2 सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और पैटर्न व्याख्या और एना पैटर्न (ICAP) समिति पर अंतरराष्ट्रीय सहमति द्वारा नामकरण की दिशा में मानकीकरण के प्रयासों के कारण अनस की स्क्रीनिंग के लिए विधि की सिफारिश की है, IIF स्लाइड प्रोसेसिंग के लिए स्वचालन समाधानों की वृद्धि की उपलब्धता, और परिणाम व्याख्या3.
के अलावा पैटर्न की भीड़ एेसी-2 IIF विधि द्वारा पता चला, psip1 जीन उत्पाद लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी (भी LEDGF/p75/DFS70 के रूप में निर्दिष्ट), हाल के वर्षों में कई कारणों के लिए महत्वपूर्ण ब्याज प्राप्त किया है4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 एंटीबॉडी स्वस्थ नियंत्रण में उच्च titers में मौजूद हैं, और अध्ययन अब तक DFS70 एंटीबॉडी7की उपस्थिति के लिए एक विशिष्ट नैदानिक संघ का प्रदर्शन करने में विफल रहे हैं,8,9 ,10,11,12,13. विभिंन रोग राज्यों और स्वस्थ साथियों में DFS70 एंटीबॉडी के लिए रिपोर्ट सकारात्मक परिणामों की दरों को अध्ययन के बीच व्यापक रूप से विभिंन6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. monospecific DFS70 पैटर्न अच्छी तरह से एक सजातीय या धब्बेदार पैटर्न से विभेदित है लेकिन मिश्रित सजातीय की व्याख्या-धब्बेदार पैटर्न और विरोधी DFS70 एंटीबॉडी सह अंय अनस के साथ होने वाली भी विशेषज्ञ पाठकों के लिए चुनौती दे रहा है । IIF स्क्रीनिंग तरीकों और DFS70 विशिष्ट ठोस चरण परख की वर्तमान पीढ़ी के मिश्रित पैटर्न (चित्र 1a, एल्गोरिथ्म के पीले छायांकित क्षेत्र) से एक monospecific DFS70 प्रतिक्रिया अंतर करने में सक्षम नहीं हैं । DFS70 पैटर्न के सजातीय, धब्बेदार, या मिश्रित पैटर्न, या इसके विपरीतके रूप में अशुद्ध व्याख्या, रोगी की देखभाल पर गंभीर प्रभाव पड़ सकता है । वर्तमान आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल इस प्रकार है: नैदानिक लैब्स रोग के लिए ठोस चरण पुष्टि परीक्षण के एक नंबर से जुड़े अनस और/या DFS70/LEDGF के लिए एक immunoadsorption विधि जब घने ठीक धब्बेदार (एसी-2) पैटर्न संदिग्ध है (आंकड़ा 1a)4,5.
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक उपंयास इंजीनियर एेसी-2 IIF सब्सट्रेट (एेसी-2 अभिजात वर्ग/DFS70 नॉकआउट (KO), एेसी-2 अभिजात वर्ग के रूप में निर्दिष्ट किया जाएगा) कि के सभी फायदों को बरकरार रखने के लिए है, जबकि एक साथ एक ही समय अनस के लिए पारंपरिक एेसी-2 दोनों monospecific और मिश्रित ANA सकारात्मक मामलों में उच्च विश्वास के साथ DFS70 पैटर्न भेद (आंकड़ा 1b, एल्गोरिथ्म के पीले छायांकित क्षेत्र)5। एेसी-2 अभिजात वर्ग सब्सट्रेट unसंशोधित पारंपरिक एेसी-2 कोशिकाओं और इंजीनियर LEDGF/p75/DFS70 प्रतिजन के 1:9 अनुपात में विहीन कोशिकाओं के एक अनुमानित मिश्रण से बना है5। एेसी-2 एलीट के लिए IIF प्रक्रिया परम्परागत एेसी-2 विधि के समान है । एेसी-2 अभिजात वर्ग सब्सट्रेट के अद्वितीय विंयास न केवल पारंपरिक HEp2 के सभी लाभ बरकरार रखती है, लेकिन सजातीय, धब्बेदार, और DFS70 पैटर्न से मिश्रित प्रतिक्रिया पैटर्न प्रारंभिक स्क्रीनिंग या एक नमूने के परीक्षण पर अंतर कर सकते है (चित्र 1b )5. रोगी सीरा के साथ स्लाइड पर प्रतिक्रिया किया जा करने के लिए एेसी-2 IIF सब्सट्रेट को स्क्रीनिंग कमजोर पड़ने के साथ या व्यक्ति प्रयोगशाला कसौटी के अनुसार पतला 1:40 किया जाना चाहिए । 1:40 या उच्चतर titer पर एक विशिष्ट प्रतिक्रिया सकारात्मक माना जाता है ।
इस अध्ययन में, सजातीय के लिए सकारात्मक सीरा, धब्बेदार, centromere, nucleolar, cytoplasmic जालीदार/ामा, और DFS70 पैटर्न है कि एक मध्यम सकारात्मक संकेत (नकारात्मक नियंत्रण और किट द्वारा प्रदान की सकारात्मक ANA नियंत्रण के सापेक्ष) का उत्पादन स्क्रीनिंग पर 1:40 के कमजोर पड़ने से एेसी-2 सब्सट्रेट्स (परम्परागत और एेसी-2 एलीट) पर मोनो-विशिष्ट और मिश्रित पैटर्न का अनुकरण करने के लिए चयन किया गया । 1:40 पतला DFS70 पॉजिटिव सीरा व्यक्तिगत रोग-संबद्ध ANA पैटर्न नियंत्रण के 1:40 कमजोर पड़ने के साथ मिलाया गया (सजातीय, धब्बेदार, centromere, nucleolar, या cytoplasmic जालीदार-ामा) विभिंन अनुपात में (नियंत्रण: DFS70 में 100:0, 80:20, 50:50, 20:80, और 0:100) और पारंपरिक और एेसी-2 अभिजात वर्ग सब्सट्रेट्स मानक IIF प्रक्रिया के बाद नीचे उल्लिखित पर मूल्यांकन किया गया ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANA positive control</td>
			<td>Trinity Biotech&#160;</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFS70 antibody positive control</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan&#39;s blue counterstain</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer diluent for serum</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials used in the study but not provided by the kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td></td>
			<td>provided for customers (no catalog #)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General lab supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled/deionized water</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General lab supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate

प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित संयोजी ऊतक विकारों antinuclear एंटीबॉडी प्रसारित द्वारा विशेषता है (ANA) । हालांकि वहाँ कई प्रौद्योगिकियों एना स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध हैं, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IIF) मानव उपकला कोशिकाओं का उपयोग-2 (एेसी-2) सब्सट्रेट अपनी बेहतर संवेदनशीलता के कारण प्राथमिक और अनुशंसित विधि बनी हुई है. एेसी-2 सब्सट्रेट autoantibody विभिन्न प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के नाभिक और कोशिकाओं के कोशिका भर में वितरित एंटीजन के लिए बाध्यकारी के परिणामस्वरूप पैटर्न के एक भीड़ का पता लगा सकते हैं । monospecific और मिश्रित एेसी-2 सब्सट्रेट पर सकारात्मक प्रतिक्रियाओं से उत्पंन पैटर्न की महान विविधता भी व्याख्या और रिपोर्टिंग की सटीकता जटिल । एक विशिष्ट उदाहरण है जो अत्यंत ध्यान प्राप्त हाल ही में घने ठीक धब्बेदार ७० (DFS70) है कि विशेष रूप से एक प्रोटीन के लिए बाइंड लेंस उपकला व्युत्पंन विकास कारक (LEDGF) कहा जाता है कि एंटीबॉडी से उत्पंन पैटर्न । एक विशिष्ट प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग और स्वस्थ आबादी में उच्च प्रसार के साथ स्पष्ट सहयोग की कमी DFS70 पैटर्न महत्वपूर्ण की सटीक व्याख्या की है । पारंपरिक एेसी-2 सब्सट्रेट का प्रयोग रोग से जुड़े पैटर्न से DFS70 पैटर्न का सही अंतर चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, अक्सर सह रोग के साथ साथ DFS70 पैटर्न की घटना-ऐसे सजातीय, धब्बेदार, और मिश्रित सजातीय-धब्बेदार पैटर्न IIF व्याख्या जटिल के रूप में पैटर्न जुड़े । इस पेपर के लक्ष्य के लिए एक उपंयास इंजीनियर एेसी-2 IIF सब्सट्रेट है कि पारंपरिक एेसी-2 सब्सट्रेट के सभी लाभ को बरकरार रखता है, जबकि एक साथ दोनों में उच्च विश्वास के साथ DFS70 पैटर्न भेद करने की क्षमता प्रदान करने की उपयोगिता का प्रदर्शन है monospecific और मिश्रित अना सकारात्मक उदाहरण । नए सब्सट्रेट रोग से जुड़े एना पहले DFS70 पैटर्न से छुपा पैटर्न मुखौटा करने में सक्षम है.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate at JoVE.com

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

DFS70 एंटीबॉडी आम बीमारी की नकल-जुड़े antinuclear एंटीबॉडी सटीक व्याख्या चुनौतीपूर्ण बनाने जब पारंपरिक एेसी-2 सब्सट्रेट का उपयोग कर पैटर्न । प्रोटोकॉल का वर्णन है उपंयास के लाभ इंजीनियर एेसी-2 सब्सट्रेट पर पारंपरिक एेसी-2 ana स्क्रीनिंग और दोनों monospecific और मिश्रित ANA सकारात्मक मामलों में उच्च विश्वास के साथ DFS70 पैटर्न भेद ।

एक उपंयास के साथ ANA स्क्रीनिंग के दौरान Monospecific और मिश्रित DFS70 पैटर्न के एक साथ भेद एेसी-2 अभिजात वर्ग/DFS70 पीटा सब्सट्रेट

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