Name: a rat model of mild intrauterine hypoperfusion with microcoil stenosis
Uploaded: 2018-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av FY 2013 forskning utvekslingsprogram mellom JSP og CNRS, JSP KAKENHI Grant antall 26860858 og Narishige nevrovitenskap Research Foundation. Vi takker Dr. Mariko Harada-Shiba og Kyoko Shioya for nyttig diskusjoner. Vi takker Mari Furuta, Mutsumi Sakamoto, Ritsuko Maki og Dr. Emi Tanaka for utmerket kundestøtte.

Alle eksperimentene ble utført i henhold til protokoller godkjent av eksperimentelle Animal Care og bruk komiteen av nasjonale Cerebral og Kretsløpssystem Center, Suita, Japan.
1. klargjør følgende dyr og materialer for MIUH kirurgi
<ol><li>Forberede tidsbestemt gravid Sprague-Dawley rotter på svangerskapsdiabetes dag 17, dvs. embryonale dag 17 (E17). Demninger gjennomsnittlige kroppen vekt er 307.0 ± 40.7 g (mener ± SD, n = 9).</li>
	<li>Forberede metall microcoils; Indre di...

<ol>
	<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+intrauterine+hypoperfusion+reproduces+neurodevelopmental+disorders+observed+in+prematurity.">Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity.</a> Sci Rep. 6, 39377 (2016).</li><li>Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioral+outcomes+of+school-age+children+born+extremely+low+birth+weight+or+very+preterm+in+the+1990s.">Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s.</a> JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).</li><li>Levine, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+childhood+neurodevelopment+after+intrauterine+growth+restriction:+a+systematic+review.">Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review.</a> Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).</li><li>Sucksdorff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+Birth+and+Poor+Fetal+Growth+as+Risk+Factors+of+Attention-Deficit/+Hyperactivity+Disorder.">Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder.</a> Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).</li><li>Nardozza, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction:+current+knowledge.">Fetal growth restriction: current knowledge.</a> Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).</li><li>Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+birth+and+the+role+of+neuroprotection.">Preterm birth and the role of neuroprotection.</a> Bmj. 350, g6661 (2015).</li><li>Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+ischemia+deteriorates+white+matter,+brain+organization,+and+function:+implications+for+prematurity+and+cerebral+palsy.">Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy.</a> Dev Med Child Neurol. 58, 7-11 (2016).</li><li>Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Erythropoietin+Mitigates+Impaired+Cerebral+Cortical+Development+Following+Subplate+Loss+from+Prenatal+Hypoxia-Ischemia.">Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia.</a> Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).</li><li>Kubo, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+impaired+neuronal+migration+with+cognitive+deficits+in+extremely+preterm+infants.">Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants.</a> JCI Insight. 2 (10), (2017).</li><li>Delcour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+musculoskeletal+and+locomotor+alterations+in+adult+rats+with+white+matter+injury+following+prenatal+ischemia.">Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia.</a> Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).</li><li>Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertension+produced+by+reduced+uterine+perfusion+in+pregnant+rats+is+associated+with+increased+soluble+fms-like+tyrosine+kinase-1+expression.">Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression.</a> Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).</li><li>Granger, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+uterine+perfusion+pressure+(RUPP)+model+for+studying+cardiovascular-renal+dysfunction+in+response+to+placental+ischemia.">Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia.</a> Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).</li><li>Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+erythropoietin+treatment+mitigates+neural+cell+loss+after+systemic+prenatal+hypoxic-ischemic+injury.">Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury.</a> J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).</li><li>Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+ischemia+and+white+matter+damage+in+rats.">Prenatal ischemia and white matter damage in rats.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).</li><li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+induced+by+graded+prenatal+systemic+hypoxic-ischemic+insults+in+rats.">Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats.</a> Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).</li><li>Rice, D., Barone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+periods+of+vulnerability+for+the+developing+nervous+system:+evidence+from+humans+and+animal+models.">Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models.</a> Environ Health Perspect. 108, 511-533 (2000).</li><li>Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurological+outcomes+of+animal+models+of+uterine+artery+ligation+and+relevance+to+human+intrauterine+growth+restriction:+a+systematic+review.">Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).</li><li>Delcour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical,+sensorimotor+and+cognitive+deficits+in+adult+rats+with+white+matter+injury+following+prenatal+ischemia.">Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia.</a> Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).</li></ol>

Microcoil stenose i både eggstokkene og livmor arteries i både livmor horn gir konsekvent og reproduserbar intrauterine hypoperfusion i alle placentas og fostre. Nivået av hypoperfusion kan endres ved hjelp av microcoils med ulike indre diameter. Rotte unger født fra en demning som arterien stenose er utført med microcoils 0,24 mm indre diameter viser IUGR og prematur fødsel (se referanse 1 for detaljer). Valpene utstilling nevroanatomi og atferdsmessige endringer som ligner tegn og symptomer i premature barn. Diss...

Spedbarn med intrauterine vekst restriksjonskoder (IUGR) (også kjent som fetal vekst begrensning) (fødselen vekt < 10th persentil for svangerskapsdiabetes alder), tidlig fødsel (født på < 37 uker av svangerskapet) og/eller lav fødselen vekt (< 2500 g) konto for nesten 10% av alle nyfødte 2,3. Mange av disse spedbarn presenterer nevrologiske problemer som cerebral parese og utviklingsforstyrrelser (f.eks oppmerksomhet-underskudd/hyperaktivitet (ADHD) og læring lidelser) 3,4,5. Disse betingelsene har likheter og forskjeller i etiologien og resultater. Etiologien for IUGR er multifaktoriell placental insuffisiens tilknyttet intrauterine hypoperfusion anses å være den vanligste årsaken i ikke-uregelrett fostre 7. Etiologien for premature er multifaktoriell også, og chorioamnionitis er de hyppigste årsak 8.
Påvirkning av mild intrauterine hypoperfusion (MIUH) på å utvikle hjernen er uklart. Foreløpig innebære tilgjengelig dyr modeller av intrauterin hypoperfusion/iskemi hovedsakelig alvorlig hypoperfusion eller gradient grad av hypoperfusion med eller uten reperfusion 9,10,11. I kliniske innstillinger, men anses tilfeller av MIUH å være langt oftere enn de som involverer slike alvorlige forhold. Tilgjengelige modeller av MIUH er en gnager modell som involverer Sutur ligation av enten i livmor eller ovarian arterien og en gnager modell som involverer klipping bilaterale ovarian arteriene og aorta har patency 12,13, 14,15,16,17. En av ulempene med disse modellene er omfattende mellom fosteret variasjon, mellom fostre med dyp hypoperfusion fostre nesten intakt perfusjon, avhengig av plasseringen av fosteret innenfor arterielle arkaden av den livmor og ovarian arterier. En annen ulempe av disse modellene er deres manglende evne til å skille plasseringen av hver fosteret etter fødselen; Derfor kan ikke forskere skille alvorlighetsgraden av intrauterin hypoperfusion oppleves av en individuell valp etter fødselen.
Vi har utviklet en rotte modell av MIUH som involverer flere arterien stenose 1. Innpakning metall mikro-spoler med en diameter på 0,24 mm rundt ovarian og livmor arteriene fører stenose, men ikke obstruksjon, av blodkar (figur 1). Bruk disse microcoils ved de proksimale delene av alle blodårene forsyne livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene, på embryonale dag 17 (tilsvarer embryonale uker 20-25 mennesker 18) induserer en betydelig, men mild nedgang i blodtilførsel til placentas og fostre. Fellingene i blodstrømmen etter CoILer brukes på alle fire arteries mater livmoren er stort sett identiske for hver morkaken og fosteret. Dødelighet fosteret er mindre enn 20%. Valpene er født via spontan arbeid 1-2 dager tidligere (embryonale dag 21-22) enn normalt. Nært alle pups er født viser betydelig lav fødselen vekt 1. Grå og hvit sak er minket uten åpenbare vev skade 1. Pups presenterer forsinket oppkjøpet av nyfødte reflekser, muskelsvakhet og endret spontan aktivitet 1. Denne modellen etterligner kliniske tegn og symptomer av barn født for tidlig eller IUGR; barn født premature utstillingen redusert grå og hvit substans volum med eller uten hvit substans skade 6, nåværende forsinket milepæler nevrologisk utvikling, og kan presentere atferdsproblemer som for eksempel ADHD 3,5; barn med IUGR utstilling minimal nevroanatomi endringer, og har en økt risiko for nedsatt nevrologisk utvikling som motoriske og kognitive forsinkelse 4,7. Tidlig fødsel og IUGR er ulike forhold, men de to forholdene deler grunnleggende mekanisme, dvs. fornærmelser til umodne hjernen før hele gestasjonsalder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaper 30x40 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory foam or shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine disinfectant solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze 10x20 cm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray bottle with ethanol for disinfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with large blunt tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps with angled fine tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture 4-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringes (50ml) and needles (18G)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat model of mild intrauterine hypoperfusion with microcoil stenosis

Intrauterine hypoperfusion/iskemi er en av hovedårsakene til intrauterine/fetal vekst begrensning, tidlig fødsel og lav fødselsvekt. De fleste studier av dette fenomenet er utført i enten modeller med alvorlige intrauterine iskemi eller modeller med gradient grad av intrauterin hypoperfusion. Ingen studie har utført i en modell på uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). To modeller er brukt for studier av MIUH: en modell basert på Sutur ligation av hver side av arteriell arkaden dannet med livmor og eggstokkreft arteriene, og en forbigående modell basert på klipping bilaterale ovarian arteriene og aorta har patency. De to gnager modellene av MIUH har noen begrensninger, f.eks ikke alle fostre er utsatt for MIUH, avhengig av posisjonen i livmor horn. I MIUH modellen, er alle fostre utsatt for et tilsvarende nivå for intrauterine hypoperfusion. MIUH ble oppnådd av mild stenose i alle fire arterier fôring livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene.
Arterial stenose ble indusert av metall microcoils pakket rundt fôring arteriene. Produserer arteriell stenose med microcoils tillatt oss å kontrollere, optimalisere og reprodusere redusert blodstrøm med lite Inter dyr variasjon og en lav dødelighet, dermed muliggjør nøyaktig vurdering. Når microcoils med en diameter på 0,24 ble brukt, blodstrømmen i både morkaken og Foster var mildt redusert (ca 30% fra før stenose nivå i morkaken). Avkom av vår MIUH modell tydelig viser varige endringer i nevrologiske, nevroanatomi og atferdsmessige testresultater.

Etter at microcoils til alle arteries mater livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene, er alle fostre utsatt for sammenlignbare nivåer av hypoperfusion. Anvendelsen av microcoils med en diameter på 0,24 fører til mild stenose i disse arteriene, og dermed forårsaker en mild reduksjon i blodstrømmen til placentas og fostre (Figur 3, ca. 30% fra før stenose nivå i morkaken, se Referanse 1 for detaljer). Valpene født fra demningen demonst...

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis at JoVE.com

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Mild intrauterine hypoperfusion ble produsert av arterien stenose med metall microcoils pakket rundt livmor og eggstokkreft arteries i rotter på embryonale dag 17. Denne prosedyren produsert prenatal hypoperfusion og intrauterine vekst begrensning.

En rotte modell av Mild Intrauterine Hypoperfusion med Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersøkelser på Endringer i Hippocampus Circuit Funksjon Etter mild traumatisk hjerneskade

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

En protokoll for å måle Cue reaktivitet i en rotte modell av kokain bruk lidelse

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method

En rotte modell av sentral Fatigue bruker en modifisert flere plattform-metoden

In this article, we introduced a rat model of central fatigue using the modified multiple platform method (MMPM). The Multiple Platform box was designed ...

A Novel and Translational Rat Model of Concussion Combining Force and Rotation with In Vivo Cerebral Microdialysis

En roman og translational Rat modell av hjernerystelse kombinere Force og rotasjon med in vivo cerebral Microdialysis

Persistent cognitive and motor symptoms are known consequences of concussions/mild traumatic brain injury (mTBIs) that can be partly attributable to ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Avansert Diffusion Imaging i hippocampus hos rotter med mild traumatisk hjerneskade

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Establishment of a Rat Model of Superior Sagittal-Sinus Occlusion via a Thread-Embolism Method

Etablering av en rottemodell av overlegen skytten-sinus okklusjon via en tråd-embolisme metode

The mechanisms contributing to the natural onset of cerebral venous sinus thrombosis (CVST) are mostly unknown, and a variety of uncontrollable factors ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En rottemodell av EcoHIV hjerneinfeksjon

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Induksjon og vurdering av Levodopa-indusert dyskinesi i en rottemodell av Parkinsons sykdom

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Elektromagnetisk kontrollert lukket hodemodell av mild traumatisk hjerneskade hos mus

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Chinese Massage Techniques: Enhancing Motor Function in Cerebral Palsy Rats

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Exploring the Potential of Massage Therapy in Cerebral Palsy Using Animal Models (Video) | JoVE

Abdominal massasje for å forbedre motorisk dysfunksjon hos rotter med cerebral parese

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...