Name: using crispr/cas9 gene editing to investigate the oncogenic activity of mutant calreticulin in cytokine dependent hematopoietic cells
Uploaded: 2018-01-05T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01HL131835), un premio de investigador clínico de Damon Runyon y el consorcio de cáncer de Starr.

1. sgRNA diseño utilizando herramientas en línea13
<ol><li>
SgRNAs diseño contra el gen de interés utilizando herramientas libremente disponibles en línea.
	<ol>
<li>Copie y pegue la secuencia de Referencia NCBI del gen de interés en la herramienta de diseño web Instituto Broad sgRNA: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design). Nota: Esta herramienta identifica secuencias sgRNA con sitios de la hendidura dentro de los exones y los que ab...

<ol>
	<li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Trans Med. 8, 360 (2016).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).</li><li>Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+Gene-knockout+screens+and+target+identification+via+Whole+genome+sequencing+uncover+host+genes+required+for+picornavirus+infection.">CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection.</a> J Biol Chem. 10, 1074 (2017).</li><li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancies+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing.">Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li><li>Daley, G. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Elf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Calreticulin+requires+both+its+mutant+C-terminus+and+the+thrombopoietin+receptor+for+oncogenic+transformation.">Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation.</a> Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Genomic+Deletions+in+Mammalian+Cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9.</a> J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).</li><li>Watanabe-Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+acquired+mutations+in+transgenes+arising+in+Ba/F3+transformation+assays:+findings+and+recommendations.">Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations.</a> Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).</li></ol>

Aquí se demuestra el uso de CRISPR/Cas9 gene edición para estudiar la función biológica de las mutaciones de inserción en las células hematopoyéticas. El éxito de este protocolo depende de múltiples factores. En primer lugar, es importante saber qué tipos de mutaciones pueden ser responsables del fenotipo deseado. En el presente Protocolo, la lectura es la transformación de células Ba/F3 a la independencia de 3 mIL y los tipos de mutaciones son indels en el exón 9 de inserción. Sin embargo...

Tecnología CRISPR/Cas9 recientemente ha revolucionado la edición del genoma específica de organismos y células vivas. Se ha convertido en una herramienta extremadamente poderosa para la investigación biomédica y en la actualidad está siendo utilizada como una vía potencial para la terapia de enfermedades genéticas1. La base de todas las herramientas de edición genoma se basa en la creación de una nucleasa-inducida ADN doble trenzada ruptura (de diferencias OSD) en el locus genómico a modificarse. Los consejos escolares distritales pueden repararse por final-Unión no homólogos (NHEJ) o reparación dirigida de homología (HDR)2,3. La ventaja de la nucleasa Cas9 sobre otro genoma ingeniería nucleasas, como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas de efectores como activador de transcripción (TALENs) es su dependencia del RNA para dirigir la nucleasa para una secuencia de ADN deseada, en comparación con a las interacciones DNA proteína encontradas en ZFNs y TALENs2,3.
Después del descubrimiento de la vía de nucleasa CRISPR/Cas9 como un sistema inmune adaptante en las células procariotas4,5, mucho esfuerzo ha entrado en la adaptación de la vía para el uso en líneas de células de mamífero y de organismos modelo2, 3. como una herramienta para la edición de gene, el camino CRISPR/Cas9 utiliza dos componentes principales: el Streptococcus pyogenes (Sp) derivados Cas9 nucleasa y sgRNAs contra el gen de interés2,3. Lo sgRNA consta de 20 nucleótidos Cas9 directo a un sitio específico en el genoma a través de RNA-DNA pares complementariedad2,3. El sitio de destino de lo sgRNA debe estar adyacente a un sitio de protospacer motivo adyacente (PAM) en forma de 5' NGG, reconocida por la nucleasa de SpCas9. Con estas herramientas, Cas9 pueden ser dirigidas a cualquier secuencia de ADN mediante el diseño de sgRNAs orientados a la región de interés. Además Sp derivado Cas9, hay variantes adicionales para Cas9 con diferentes características dependiendo de la aplicación específica. Por ejemplo, hay variantes de Cas9 con mayor especificidad para la edición en blanco o capacidad escote solo-filamento de la DNA mellar6,7. Por otra parte, Cas9 catalítico inactivo se ha desarrollado recientemente para la regulación transcripcional8. Los científicos ahora han utilizado el sistema CRISPR/Cas9 para una variedad de aplicaciones, como knockin gene knockout para el estudio de las funciones biológicas de los genes9, de la función de pérdida y ganancia de función biblioteca pantallas10 y genética Ingeniería de organismos modelo11.
En este protocolo, se combina la metodología CRISPR/Cas9 con el ensayo de transformación celular de Ba/F3 para entender la función biológica de las mutaciones de inserción . Ba/F3 células son un murino IL-3 dependientes de células hematopoyéticas que se pueden representar IL-3 independientes sobre la expresión de ciertos oncogenes como BCR-ABL12. Para entender si calreticulina mutante puede transformar las células Ba/F3 para el crecimiento independiente de citoquinas, dirigido el exón 9 del locus endógeno de inserción utilizando CRISPR/Cas9 para introducir mutaciones indel y retiró IL-3 de las células para aplicar una presión de selección positiva, con el objetivo de recapitular las mutaciones de inserción de ganancia de función encontradas en pacientes de la MPN. El protocolo incluye el diseño, la clonación y la entrega de sgRNAs, el desarrollo de estable Cas9 células expresando y proyección para CRISPR objetivos gene edición. Este protocolo se puede aplicar a diferentes genes y diferentes líneas de celulares de citoquinas dependientes de interés y es especialmente valiosa para modelar y estudiar la función biológica de genes implicados en cáncer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1113803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLX_TRC311-Cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXPR-011</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERB49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LentiGuide-Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #52963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNK</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 gene editing to investigate the oncogenic activity of mutant calreticulin in cytokine dependent hematopoietic cells

Agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) es un sistema de inmunidad adaptativa en procariotas ha sido repurposed por los científicos para generar RNA-dirigida de nucleasas, como CRISPR-asociado (Cas) 9 para el genoma eucariótico específico edición. Ingeniería del genoma por Cas9 utiliza robusta, eficiente y fácilmente modificar genes endógenos en muchas líneas celulares mamíferos biomédico pertinentes y organismos. Aquí mostramos un ejemplo de cómo utilizar la metodología CRISPR/Cas9 para entender la función biológica de las mutaciones genéticas específicas. Modelo de calreticulina (inserción) mutaciones en murinos interleucina-3 (mIL-3) dependiente pro-B (Ba/F3) las células por la entrega de una guía RNAs (sgRNAs) contra el locus endógeno de inserción en la región específica donde inserción o canceladura (indel ) Las mutaciones de inserción ocurren en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN), un tipo de cáncer de la sangre. El sgRNAs crear roturas de doble cadena (distritales) en la región específica que son reparados por no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) a indels de varios tamaños. Luego empleamos el ensayo de transformación celular de Ba/F3 estándar para comprender el efecto de expresión nivel fisiológico de las mutaciones de inserción en la transformación celular hematopoyético. Este enfoque puede aplicarse a otros genes para el estudio de su función biológica en varias líneas celulares mamíferos.

Utilizando el método descrito aquí, el objetivo de este experimento es estudiar los efectos funcionales de la introducción de mutaciones indel para el locus endógeno de inserción sobre la transformación de células hematopoyéticas. El sistema CRISPR/Cas9 se utiliza como una herramienta para crear mutaciones de inserción endógenas en las células Ba/F3. Dos sgRNAs fueron elegidos a exón 9 de inserción (figura 1), en la reg...

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Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Genes específicos de edición usando CRISPR/Cas9 ha facilitado enormemente la comprensión de las funciones biológicas de los genes. Aquí, utilizamos la metodología CRISPR/Cas9 para mutaciones de calreticulina modelo en dependiente de citoquinas hematopoyéticas células para estudiar su actividad oncogénica.

Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

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