Name: chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), g.h. und j.h.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt. Experimente wurden an Wildtyp C57BL/6J Mäusen durchgeführt.
1. Ernte fetale oder neonatale Eierstöcke und Vorbereitung der Prophase Chromatin breitet sich
<ol><li>Embryonen im 14,5 – 19,5 Tage Post-Coitum (Dpc) extrahieren Opfern Sie die trächtige Weibchen durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien. H...

<ol>
	<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Keeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spo11+and+the+Formation+of+DNA+Double-Strand+Breaks+in+Meiosis.">Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis.</a> Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).</li><li>Vries, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Sycp1+functions+in+synaptonemal+complex+assembly,+meiotic+recombination,+and+XY+body+formation.">Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation.</a> Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+Mlh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).</li><li>Lipkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+arrest+and+aneuploidy+in+MLH3-deficient+mice.">Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice.</a> Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).</li><li>Kolas, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+MMR+proteins+on+meiotic+chromosomes+in+mice+indicates+distinct+functions+during+prophase+I.">Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I.</a> J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Cohesin+and+Condensin+in+Chromosome+Dynamics+During+Mammalian+Meiosis.">Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis.</a> J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).</li><li>Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. 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K., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+transitions+in+germ+cell+development+and+meiosis.">Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis.</a> Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).</li><li>Taketo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspread+ovarian+cell+preparations+for+the+analysis+of+meiotic+prophase+progression+in+oocytes+with+improved+recovery+by+cytospin+centrifugation.">Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation.</a> Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).</li><li>Sun, X., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+recombination+in+mouse+oocytes.">Studying recombination in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).</li><li>Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+meiosis-specific+cohesins+in+mouse+embryonic+oocytes.">Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).</li><li>Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mammalian+female+meiosis.">Analyzing mammalian female meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+In+vivo+and+In+vitro:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen erlauben Forschern, weiblichen Säugetieren Meiose und die dynamische Lokalisierung von Proteinen, chronologisch zu studieren. Die embryonalen und neonatale Chromatin-Spreads ermöglichen genaue Analyse von Veranstaltungen das ganze meiotischen Prophase. Metaphase I und Metaphase II Chromatin Spreads können verwendet werden, um einzelne Schwester unterscheiden Chromatiden von Schwestern und gepaarten Homologen Chromosomen gepaart sowie Diploidie zu beurteilen. Im Vergleich dazu, kann...

Während der Spermatogenese werden große halbsynchrone Wellen der meiotischen Keimzellen in den Hoden zu Beginn der Pubertät und im gesamten Erwachsenenalter1schnell und kontinuierlich aufgefüllt. Im Gegensatz zu den Männchen wird Meiose bei den Weibchen nur während der fetalen Entwicklung eingeleitet. Nach der Geburt, Eizellen bleiben verhaftet in einem längeren Dictyate Stadium der Prophase I mit einer intakten Germinal Vesicle (GV; Kernhülle) bis zur Pubertät. Zu Beginn der Pubertät eine Teilmenge der Eizellen werden zyklisch ausgewählt, um Wachstum und Reifung, Kennzeichnung der Einleitung der meiotischen Wiederaufnahme zu unterziehen. Meiotische Wiederaufnahme in ausgewachsene Eizellen manifestiert sich durch das Verschwinden der GV in einem Prozeß bekannt als Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD). Die Eizelle wird dann Chromosom Kondensation und Segregation, gefolgt von Polkörperchen Extrusion. Eizellen werden bei der Progression zu MII verhaftet und stimuliert die zweite und letzte meiotische Teilung nur nach der Befruchtung abgeschlossen.
Weibliche Fruchtbarkeit hängt stark von dem Erfolg der meiotischen Prophase ich fortschreiten. Der Schlüssel hierzu ist eine physische Verbindung zwischen Homologen Chromosomen bekannt als Chiasmata, die durch Reparatur der induzierten DNA-Doppelstrang Brüchen (DSB) über Crossover Rekombination2vermittelt wird. Dieser Vorgang erfolgt im Rahmen der dynamischen eiweißreichen leski bekannt als des synaptonemalen Komplexes (SC), die zwischen Homologen Chromosomen zur Erleichterung ihrer Synapsis3bildet. Der SC ist ein Reißverschluss dreigliedrige Struktur, die besteht aus zwei parallelen seitlichen Elementen verbunden durch Zentralregion Proteine, die homologe zusammen in der gesamten laufenden DNA-Reparatur hält. Vor der Synapsis bilden Vorstufen von den seitlichen Elementen, genannt axiale Elemente zwischen Schwester Chromatiden. Synaptonemalen Komplex Proteine wie SYCP2 und SYCP3 bilden axiale Elemente, die zu den Achsen der Schwester Chromatids Zusammenhalt während der frühen Prophase colocalize. Diese später dienen als Bindungsstellen für die transversale Filament-Protein, SYCP1, das zentrale Element Montage und Synapsis zwischen ausgerichteten homologe4erleichtert. Maus Eizellen ist komplette Synapsis durch die Anwesenheit von 20 komplett entnehmen Sie bitte, dass überlappende SYCP3 und SYCP1 Strecken, die visualisiert werden können, mithilfe von Chromatin Zubereitungen verbreiten. SYNAPSIS ist bei Eintritt in die Pachytene Unterphase abgeschlossen wobei Reife Frequenzweichen, die in Form Chiasmata zwischen homologen bestimmt sind mit MutL Homolog (MLH1/3) Dimere Förderung ihre präzise Verarbeitung5,6 verziert sind , 7. Bauunterhaltung der Chromosomen (SMC) komplexe, einschließlich Cohesin, condensin und die SMC5/6-Komplex, sind wichtig für die Regulierung des Chromosoms Dynamik und Struktur im gesamten Meiose8,9, 10,11,12. Gemeinsam sorgen diese Ereignisse korrekte Bi-Ausrichtung der Homologen Chromosomen an den gegnerischen Spindel Polen nach Demontage des SC.
Die meiotische Zellzyklus ist ein leistungsfähiges Modell, die Rollen der verschiedenen Proteine im Genom Wartung aufgrund der programmierten Induktion und anschließende Reparatur der DNA DSB zu untersuchen. Säugetier-Meiose ist darüber hinaus auch eine relevante Modell für die Untersuchung von epigenetischen Modifikationen und Prägung13. Jedoch ist es technisch schwierig, bewerten diese Ereignisse während weibliche Meiose stattfindet in fetalen und neonatalen Eierstöcke bei Säugetieren (Abbildung 1). In 5 Subverteiler teilbar Prophase: Leptonema, Zygonema, Pachynema, Diplonema und Dictyate. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren und zu unterscheiden zwischen fetalen und neonatalen Eierstöcke und Hoden (Abbildung 2). Adaptiert von zuvor beschriebenen Methoden, diese Handschrift auch beschreibt ein Protokoll (Schritt 1) mit video-Demonstration für die Vorbereitung der weiblichen meiotischen Prophase ich Chromatin breitet sich14,15,16,17 . Verbindung mit Immunolabelling, wie beschrieben in Schritte 6 und 7, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte mikroskopische Analyse der Prophase ich Ereignisse in Eizellen.
Oogenese ist fehleranfällig und Chromosom Missegregation Ereignisse während der ersten meiotischen Teilung stellen die häufigste Quelle der genetischen Krankheit Nachkommen18,19. In diesem Manuskript (Protokoll (Schritt 2) beschreiben wir ein Protokoll, in dem grundiert Eierstöcke von Erwachsenen weiblichen Mäusen Reife GV inszeniert Eizellen entnommen sind. Unterstützende Bedingungen werden ausgewachsene Eizellen luteinisierendes Hormon-unabhängigen Wiederaufnahme der Meiose nach Isolation und Kultur20unterzogen. Nach meiotische Wiederaufnahme Eizellen durch Meiose ich Fortschritt, dann in Metaphase II zu verhaften. Eizellen bleiben in Metaphase II, verhaftet, wenn befruchtet. In den Schritten 2 – 5 passen wir uns zuvor aufgezeichneten Protokolle mit video-Demonstration zu beschreiben, wie zu sammeln, Kultur und Chromatin verteilt Vorbereitungen21MI und MII Eizellen vorbereiten. Dieser Chromatin Verbreitung Technik ermöglicht eine klare Immunolabelling der Proteine Chromosomen zugeordnet. Darüber hinaus dieses Protokoll kann auch zur Unterscheidung zwischen bivalenten und einwertigen Chromosomen und lösen weitere einzelne Schwester Chromatiden Bewertung der Eizelle Diploidie zu erleichtern. Daher kann dieses Protokoll neben enthüllt Lokalisierung Muster der meiotischen Proteine, auch als ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Ursachen von Chromosom Missegregation während MI und MII dienen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>119-069-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm x 12mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting&#160;scissors, sharp tip, 41/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass square 1 5/8</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>742300</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646563</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD)</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>3063-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde aqueous</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-flo 200</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>74257</td>
			<td>Wetting agent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0434</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22260943</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5B</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5D</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitutoyo micrometer head</td>
			<td>Mituoyo</td>
			<td>150-208</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309646</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&#34;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>83 x 0.5 mm pipette tip</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P3080</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth&#39;s media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11220035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For oocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml filter units 0.22um</td>
			<td>Denville</td>
			<td>F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1270</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495015-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MLH1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MA5-15431</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-SYCP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PA1-16763</td>
			<td>Dilution factor- 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SCP3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-20845</td>
			<td>Dilution factor- 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-centromere protein</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-235</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- TOPOII</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109524</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78517</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Rec8</td>
			<td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilution factor- 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11013</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
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chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Chromatin verbreitete Techniken haben am meisten benutzt, die dynamische Lokalisierung verschiedener Proteine während der Gametogenese, insbesondere für die Spermatogenese zu beurteilen. Diese Techniken ermöglichen für die Visualisierung von Protein- und DNA-Lokalisierung Muster bei meiotische Veranstaltungen wie homologe Chromosom Paarung, Synapsis und DNA zu reparieren. Während einige Protokolle in der Literatur beschrieben wurden, sind allgemeine Chromatin verbreitete Techniken mit Säugetieren Prophase Eizellen begrenzt und schwierig aufgrund des Zeitpunkts der Meiose Initiation in fetalen Ovarien. Im Vergleich dazu können Jugendliche männliche Mäuse mit höheren Erträgen ohne Mikrodissektion Prophase Spermatozyten abgeholt werden. Es ist jedoch schwierig, eine reine synchronisierte Population von Zellen in bestimmten Phasen aufgrund der Heterogenität der meiotischen und Post-meiotische Keim-Zell-Populationen in den Jugendlichen und Erwachsenen Hoden zu erhalten. Für die späteren Phasen der Meiose ist es vorteilhaft, die Eizellen durchläuft Meiose I (MI) oder Meiose II (MII), weil Gruppen von reifen Eizellen können von Erwachsenen weiblichen Mäusen gesammelt und wieder Meiose in Kultur angeregt zu beurteilen. Hier Methoden für meiotische Chromatin verteilt Vorbereitungen mit Eizellen seziert von fötale, neonatale und Erwachsenen Eierstöcke sind beschrieben mit dem dazugehörigen video-Demonstrationen. Chromosom Missegregation Veranstaltungen in Säugetieren Eizellen sind häufig, besonders während MI. Diese Techniken können verwendet werden, zu bewerten und zu charakterisieren, die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen oder Umwelteinflüsse während der verschiedenen Stadien der Oogenese. Da gibt es deutliche Unterschiede zwischen Oogenese und Spermatogenese, sind die Techniken beschrieben wurden, innerhalb von unschätzbarem Wert für unser Verständnis von Säugetieren Oogenese und sexuell dimorphen Eigenschaften des Chromosoms und Protein Dynamik während der Meiose zu erhöhen .

Wir haben zwei Techniken zur Visualisierung und Bewertung meiotische Chromosomen in Eizellen beschrieben. Die erste Technik ist gesorgt, in Richtung Prophase Fortschreiten in embryonalen und neonatale Eierstöcke beurteilen. Prophase Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen sind unglaublich wertvoll für zahlreiche dynamische Prozesse während der Meiose, einschließlich Chromosom Paarung, Synapsis visualisieren und desynapsis, homologe Rekombination und epigenetische Chromosom Umbau. Hier ze...

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Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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SCIENTISTS IN ACTION

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Forschung

Genetik

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...