Name: chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NIGMS (R01GM11755) a P.W.J y por una beca de beca de capacitación desde el Instituto Nacional de cáncer (NIH) (CA009110) G.H. y J.H.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins. Los experimentos fueron realizados en ratones C57BL/6J de tipo salvaje.
1. recolección de ovarios fetales o neonatales y la preparación de la profase la cromatina se separa
<ol><li>Para extraer embriones en 14.5 – 19,5 días post-coitum (dpc) sacrificar hembras preñadas mediante dislocación cervical o CO2 asfixia según las pauta...

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	<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Keeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spo11+and+the+Formation+of+DNA+Double-Strand+Breaks+in+Meiosis.">Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis.</a> Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).</li><li>Vries, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Sycp1+functions+in+synaptonemal+complex+assembly,+meiotic+recombination,+and+XY+body+formation.">Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation.</a> Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+Mlh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).</li><li>Lipkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+arrest+and+aneuploidy+in+MLH3-deficient+mice.">Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice.</a> Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).</li><li>Kolas, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+MMR+proteins+on+meiotic+chromosomes+in+mice+indicates+distinct+functions+during+prophase+I.">Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I.</a> J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Cohesin+and+Condensin+in+Chromosome+Dynamics+During+Mammalian+Meiosis.">Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis.</a> J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).</li><li>Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. 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K., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+transitions+in+germ+cell+development+and+meiosis.">Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis.</a> Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).</li><li>Taketo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspread+ovarian+cell+preparations+for+the+analysis+of+meiotic+prophase+progression+in+oocytes+with+improved+recovery+by+cytospin+centrifugation.">Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation.</a> Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).</li><li>Sun, X., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+recombination+in+mouse+oocytes.">Studying recombination in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).</li><li>Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+meiosis-specific+cohesins+in+mouse+embryonic+oocytes.">Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).</li><li>Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mammalian+female+meiosis.">Analyzing mammalian female meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+In+vivo+and+In+vitro:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Preparaciones de extensión de cromatina permiten a los investigadores estudiar cronológicamente meiosis mamífera hembra y la localización dinámica de las proteínas implicadas. Las extensiones de cromatina embrionaria y neonatal permiten análisis cercano de los acontecimientos a lo largo de la profase meiótica. Metafase I y metafase II se separa de la cromatina puede utilizarse para distinguir solo hermana chromatids de emparejado hermanas y cromosomas homólogos emparejados, así como evaluar la ploidía. En comp...

Durante la espermatogénesis, grandes olas semisincrónico de meiótica de las células germinales se rápidamente y continuamente reponen en el testículo en el inicio de la pubertad y a lo largo de la edad adulta1. En contraste con los varones, la meiosis de las hembras se inicia únicamente durante el desarrollo fetal. Después de nacimiento, ovocitos permanecen detenidos en una etapa prolongada dictyate de profase I con una vesícula germinal intacta (GV; envoltura nuclear) hasta la pubertad. En el inicio de la pubertad, un subconjunto de los ovocitos se seleccionan cíclicamente a experimentar crecimiento y maduración, marcando el inicio de la reanudación meiótica. Reanudación meiótica de ovocitos adulto se manifiesta por la desaparición de la GV en un proceso conocido como ruptura de vesícula germinal (GVBD). Entonces, el ovocito sufre cromosoma condensación y segregación, seguido por la protuberancia del cuerpo polar. Ovocitos pasan arrestados tras progresión a MII y son estimulados para completar la segunda y última división meiótica sólo después de la fertilización.
Fertilidad de la mujer depende el éxito de la profase meiótica I progresión. Clave para esto es la formación de un vínculo físico entre los cromosomas homólogos denominados quiasmas, que está mediada por la reparación de roturas de doble cadena inducida por ADN (distritales) via crossover recombinación2. Este proceso ocurre dentro del contexto de un andamio proteínico dinámico conocido como el Complejo Sinaptonémico (SC) que se forma entre los cromosomas homólogos para facilitar sus sinapsis3. El SC es una cremallera-como estructura tripartita que consta de dos elementos laterales paralelos conectados por las proteínas de la región central que posee homólogos juntos a lo largo de curso reparación del ADN. Antes de la sinapsis, precursores de los elementos laterales, llamados elementos axiales, forman entre cromátides hermanas. Las proteínas del Complejo Sinaptonémico como SYCP2 y SYCP3 forman elementos axiales que colocalize a los ejes de la hermana chromatid cohesión durante la profase temprana. Estos más adelante servir como sitios para la proteína del filamento transversal, SYCP1, que facilita el montaje del elemento central y sinapsis entre homólogos alineados4de Unión. En ovocitos de ratón, sinapsis completa se indican por la presencia de 20 completamente superposición de extensiones SYCP3 y SYCP1, que pueden visualizarse mediante el uso de cromatina difundir preparativos. Synapsis se ha completado al entrar en el subestadio de paquiteno, por el crossover maduro que está destinado a quiasmas forma entre homólogos está decorada con dímeros de mutL homólogo (MLH1/3) para promover su proceso exacto5,6 , 7. el mantenimiento estructural de complejos de cromosomas (SMC), incluyendo la cohesina, condensin y el SMC5/6 complejos, son importantes para la regulación de la dinámica del cromosoma y estructura a lo largo de la meiosis8,9, 10,11,12. Colectivamente, estos eventos aseguran bi-orientación adecuada de los cromosomas homólogos a polos de huso después de desmontaje de la SC. de oposición
El ciclo celular meiótico es un poderoso modelo para examinar los papeles de varias proteínas en el mantenimiento del genoma debido a la inducción programada y posterior reparación del ADN distritales. Además, mamífera meiosis es también un modelo relevante para el estudio de las modificaciones epigenéticas e impresión13. Sin embargo, es técnicamente difícil de evaluar estos acontecimientos durante la meiosis femenina, que tiene lugar en los ovarios fetales y neonatales en los mamíferos (figura 1). Profase I puedo se divide en 5 subetapas: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema y dictyate. Adjunto, describimos cómo aislar y distinguir entre ovarios fetales y neonatales y los testículos (figura 2). Adaptado de los métodos anteriormente descritos, este manuscrito describe también un protocolo (paso 1) con video de demostración para la preparación de la profase meiótica femenina la cromatina separa14,15,16,17 . Cuando se combina con immunolabelling, tal como se describe en los pasos 6 y 7, este protocolo permite análisis microscópico detallado de profase I eventos en ovocitos.
Ovogénesis son propenso, y eventos de protooncogenes del cromosoma durante la primera división meiótica representan la fuente más común de enfermedades genéticas en la progenie de18,19. En este manuscrito (paso 2 del Protocolo), se describe un protocolo que ovocitos maduros organizado por el GV se extraen preparados ovarios de ratones hembra adultos. Condiciones de apoyo, ovocitos adulto pasan por independiente de la hormona luteinizante reanudación de la meiosis después de aislamiento y la cultura20. Tras la reanudación meiótica, ovocitos progresan a través de la meiosis I y luego arrestan en metafase II. Ovocitos siendo arrestados en metafase II, a menos que fertilizan. En los pasos 2 – 5, nos adaptamos a protocolos previamente divulgados con video de demostración para describir cómo recopilar, cultura y preparar MI y MII ovocitos cromatina difundir preparativos21. Esta cromatina separarse técnica permite immunolabelling claro de proteínas relacionadas con los cromosomas. Además, este protocolo también puede utilizarse para distinguir entre los cromosomas bivalentes y univalentes y además puede resolver sola hermana chromatids para facilitar la evaluación de la ploidía de ovocitos. Por lo tanto, además de revelar patrones de localización de proteínas meióticas, este protocolo también puede servir como una valiosa herramienta para dilucidar las causas potenciales de protooncogenes cromosoma durante MI y MII.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>119-069-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm x 12mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting&#160;scissors, sharp tip, 41/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass square 1 5/8</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>742300</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646563</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD)</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>3063-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde aqueous</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-flo 200</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>74257</td>
			<td>Wetting agent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0434</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22260943</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5B</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5D</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitutoyo micrometer head</td>
			<td>Mituoyo</td>
			<td>150-208</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309646</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&#34;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>83 x 0.5 mm pipette tip</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P3080</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth&#39;s media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11220035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For oocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml filter units 0.22um</td>
			<td>Denville</td>
			<td>F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1270</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495015-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MLH1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MA5-15431</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-SYCP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PA1-16763</td>
			<td>Dilution factor- 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SCP3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-20845</td>
			<td>Dilution factor- 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-centromere protein</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-235</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- TOPOII</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109524</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78517</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Rec8</td>
			<td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilution factor- 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11013</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Técnicas de propagación de cromatina se han utilizado ampliamente para evaluar la localización dinámica de proteínas diferentes durante la gametogénesis, particularmente para la espermatogénesis. Estas técnicas permiten para la visualización de patrones de localización de ADN y proteína durante eventos meióticas como cromosoma homólogo emparejamiento, synapsis y ADN reparación. Mientras que en la literatura se han descrito algunos protocolos, cromatina general técnicas de propagación utilizando ovocitos de mamífero profase son limitados y difíciles debido a la sincronización de la iniciación de la meiosis en los ovarios fetales. En comparación, espermatocitos de profase se pueden recoger en ratones machos menores con rendimientos más altos sin necesidad de microdissection. Sin embargo, es difícil obtener una población sincronizada pura de células en fases específicas debido a la heterogeneidad de las poblaciones de meiótica y posterior meiosis células germinales en el testículo adulto y juvenil. Para etapas posteriores de la meiosis, es ventajoso para evaluar oocitos en meiosis I (MI) o meiosis II (MII), porque grupos de ovocitos maduros pueden ser obtenidos de ratones hembra adultas y estimulados para reanudar la meiosis en la cultura. Aquí, métodos para preparaciones de meiosis cromatina extendida utilizando ovocitos disecaron de fetal, neonatal y adulto ovarios se describen con el acompañamiento de demostraciones en video. Eventos de protooncogenes cromosoma en ovocitos mamíferos son frecuentes, especialmente en MI. Estas técnicas pueden utilizarse para evaluar y caracterizar los efectos de diversas mutaciones o exposiciones ambientales en distintas etapas de la Oogénesis. Como hay diferencias distintas entre ovogénesis y espermatogénesis, las técnicas descritas son invaluables para aumentar nuestra comprensión de la Oogénesis mamíferos y las características de dimorfa sexual de cromosoma y proteína dinámica durante la meiosis .

Hemos descrito dos técnicas de visualización y evaluación de los cromosomas meiotic en ovocitos. La primera técnica es atendida para evaluar la progresión de la profase en ovarios embrionarias y neonatales. Profase la cromatina propagación preparados son muy valiosos para la visualización de numerosos procesos dinámicos durante la meiosis, incluyendo cromosoma emparejamiento, synapsis y desynapsis, recombinación homóloga y remodelación de cromosoma epigenético. Aquí, hemos de...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Investigación

Genética

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehído-asistida aislamiento de elementos reguladores para medir accesibilidad de la cromatina en células de mamíferos

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...