Name: chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Detta arbete var stöds av NIGMS (R01GM11755) till P.W.J och ett utbildning bevilja stipendium från National Cancer Institute (NIH) (CA009110) att G.H. och J.H.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Johns Hopkins University. Experimenten utfördes på vildtyp C57BL/6J möss.
1. avverkning Fetal- eller Neonatal äggstockarna och beredning av profas kromatin sprider
<ol><li>För att extrahera embryon på 14,5 – 19,5 dagar post-intravenösa (dpc) offra de dräktiga honorna via cervikal dislokation eller CO2 kvävning enligt IACUC riktlinjer. Obs: För postn...

<ol>
	<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Keeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spo11+and+the+Formation+of+DNA+Double-Strand+Breaks+in+Meiosis.">Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis.</a> Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).</li><li>Vries, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Sycp1+functions+in+synaptonemal+complex+assembly,+meiotic+recombination,+and+XY+body+formation.">Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation.</a> Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+Mlh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).</li><li>Lipkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+arrest+and+aneuploidy+in+MLH3-deficient+mice.">Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice.</a> Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).</li><li>Kolas, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+MMR+proteins+on+meiotic+chromosomes+in+mice+indicates+distinct+functions+during+prophase+I.">Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I.</a> J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Cohesin+and+Condensin+in+Chromosome+Dynamics+During+Mammalian+Meiosis.">Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis.</a> J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).</li><li>Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+complex+chromosome+structures+during+meiosis:+versatile+deployment+of+Smc5/6.">Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6.</a> Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).</li><li>Hopkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+cohesin+component,+Stag3+is+essential+for+maintaining+centromere+chromatid+cohesion,+and+required+for+DNA+repair+and+synapsis+between+homologous+chromosomes.">Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMC5/6+is+required+for+the+formation+of+segregation-competent+bivalent+chromosomes+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes.</a> Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).</li><li>Kota, S. K., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+transitions+in+germ+cell+development+and+meiosis.">Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis.</a> Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).</li><li>Taketo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspread+ovarian+cell+preparations+for+the+analysis+of+meiotic+prophase+progression+in+oocytes+with+improved+recovery+by+cytospin+centrifugation.">Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation.</a> Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).</li><li>Sun, X., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+recombination+in+mouse+oocytes.">Studying recombination in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).</li><li>Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+meiosis-specific+cohesins+in+mouse+embryonic+oocytes.">Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).</li><li>Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mammalian+female+meiosis.">Analyzing mammalian female meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+In+vivo+and+In+vitro:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Kromatin spridning preparat kan forskare studera kronologiskt kvinnliga däggdjur meios och dynamiska localizationen av proteinerna som är inblandade. De embryonala och neonatal kromatin sprider möjliggör nära analys av händelser under hela meiotiska profas. Metafas jag och metafas II kromatin sprider kan användas för att skilja ensamstående syster kromatiderna från Parade systrar och Parade homologa kromosomer, samt bedöma ploiditeten. Som jämförelse kan av protokollet som beskrivs här vara fördelaktiga j?...

Under spermatogenes fylls stor semi-synkron vågor av meiotiska könsceller snabbt och kontinuerligt på i testiklarna vid uppkomsten av puberteten och under hela vuxenlivet1. I motsats till män initieras meios hos kvinnor enbart under fosterutvecklingen. Efter födseln, oocyter förbli greps i en långvarig dictyate skede av profas I med en intakt germinal vesikler (GV; kärn kuvert) fram till puberteten. På uppkomsten av puberteten, en delmängd av oocyter väljs cykliskt genomgå tillväxt och mognad, märkning inledandet av meiotiska återupptagande. Meiotiska återupptagande i fullvuxen oocyter manifesteras av försvinnandet av GV i en process som kallas germinal vesikler uppdelning (GVBD). Äggcellen genomgår sedan kromosom kondens och segregation, följt av polar kroppen extrudering. Oocyter bli arresterad vid progression till MII och stimuleras att slutföra andra och sista meiotiska divisionen endast efter befruktningen.
Kvinnlig fertilitet är starkt beroende av framgången av meiotiska profas jag progression. Nyckeln till detta är bildandet av en fysisk koppling mellan homologa kromosomer kallas de chiasmata, som medieras av reparation av inducerad DNA double strand breaks (DSBs) via crossover rekombination2. Denna process sker inom ramen för en dynamisk proteinrika byggnadsställning kallas komplexet synaptonemal (SC) som bildar mellan homologa kromosomer för att underlätta deras synapsis3. SC är en dragkedja-liknande tredelad struktur som består av två parallella laterala delar ansluten genom centrala regionen proteiner som håller homologs tillsammans under pågående DNA-reparation. Innan synapsis bildar prekursorer av de laterala element, kallas axiell element, mellan syster kromatider. Synaptonemal komplexa proteiner såsom SYCP2 och SYCP3 bildar axiella element som colocalize till syster-kromatida sammanhållning axlarna under tidig profas. Dessa senare utgöra bindande platser för proteinet tvärgående glödtråd, SYCP1, vilket underlättar central del montering och mås mellan justerad homologs4. I mus oocyter anges komplett synapsis av närvaron av 20 helt överlappande SYCP3 och SYCP1 sträckor, vilket kan visualiseras med hjälp av kromatin sprida preparat. Synapsis slutförs vid inträdet i pachytene undre fokalplanet, whereby mogen delningsfilter som är avsedda att bilda chiasmata mellan homologs är inredda med mutL homolog (MLH1/3) dimerer att främja deras korrekt bearbetning5,6 , 7. det strukturella underhållet av kromosomer (SMC) komplex, inklusive cohesin, condensin och SMC5/6-komplexet, är viktiga för regleringen av kromosom dynamics och struktur i hela meios8,9, 10,11,12. Sammantaget säkerställa dessa händelser korrekt bi-riktning av homologa kromosomer till motsatta spindeln polacker efter demontering av SC.
Meiotiska cellcykeln är en kraftfull modell för att undersöka olika proteiner i genomet underhåll tack vare programmerade induktion och efterföljande reparation av DNA DSBs roller. Dessutom är däggdjur meios också en relevant modell för studier av epigenetiska förändringar och imprinting13. Det är dock tekniskt svårt att bedöma dessa händelser under kvinnliga meios, som äger rum i fetal och neonatal äggstockarna hos däggdjur (figur 1). Profas jag kan delas in i 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema och dictyate. Häri, beskriver vi hur man isolera och skilja mellan fetal och neonatal äggstockar och testiklar (figur 2). Anpassad från tidigare beskrivna metoder, Detta manuskript beskriver också ett protokoll (steg 1) med video demonstration för beredning av kvinnliga meiotiska profas jag kromatin sprider14,15,16,17 . När den kombineras med immunolabelling, som beskrivs i steg 6-7, detta protokoll möjliggör detaljerad Mikroskopisk analys av profas jag händelser i oocyter.
Oogenes är felbenägen och kromosom missegregation händelser under första meiotiska divisionen utgör den vanligaste källan till genetisk sjukdom i avkomma18,19. I detta manuskript (protokoll steg 2) beskriver vi ett protokoll där mogna GV-iscensatt oocyter som utvinns ur primade äggstockarna av vuxen honmöss. Stödjande villkor genomgå fullvuxen oocyter luteiniserande hormon-oberoende återupptagandet av meios efter isolering och kulturen20. Efter meiotiska återupptagande, oocyter framsteg genom meios I och sedan gripa vid metafas II. Oocyter förblir greps vid metafas II, såvida inte befruktade. I steg 2 – 5, anpassar vi tidigare rapporterade protokoll med video demonstration att beskriva hur man samlar in, kultur och förbereda MI och MII oocyter för kromatin sprida preparat21. Detta kromatin sprida teknik möjliggör tydlig immunolabelling av proteiner associerade med kromosomer. Dessutom detta protokoll kan också användas för att skilja mellan bivalent och univalent kromosomer och ytterligare kan lösa ensamstående syster kromatiderna att underlätta bedömning av äggcell ploiditeten. Därför, förutom avslöjande lokalisering mönster av meiotiska proteiner, detta protokoll kan också fungera som ett ovärderligt verktyg för att belysa potentiella orsaker till kromosom missegregation under MI och MII.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>119-069-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm x 12mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting&#160;scissors, sharp tip, 41/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass square 1 5/8</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>742300</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646563</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD)</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>3063-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde aqueous</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-flo 200</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>74257</td>
			<td>Wetting agent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0434</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22260943</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5B</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5D</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitutoyo micrometer head</td>
			<td>Mituoyo</td>
			<td>150-208</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309646</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&#34;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>83 x 0.5 mm pipette tip</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P3080</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth&#39;s media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11220035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For oocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml filter units 0.22um</td>
			<td>Denville</td>
			<td>F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1270</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495015-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MLH1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MA5-15431</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-SYCP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PA1-16763</td>
			<td>Dilution factor- 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SCP3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-20845</td>
			<td>Dilution factor- 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-centromere protein</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-235</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- TOPOII</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109524</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78517</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Rec8</td>
			<td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilution factor- 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11013</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Kromatin spridning tekniker har använts att bedöma dynamisk localizationen av olika proteiner under könscellsbildning, särskilt för spermatogenesen. Dessa tekniker möjliggör visualisering av protein och DNA lokalisering mönster under meiotiska evenemang såsom homologa kromosom ihopkoppling, mås och DNA reparation. Medan några protokoll har beskrivits i litteraturen, är allmänna kromatin spridning tekniker använder däggdjur profas oocyter begränsad och svårt på grund av tidpunkten för meios inledande i fostrets äggstockarna. I jämförelse, kan profas spermatocyter samlas från juvenil hanmöss med högre avkastning utan behovet av lokalt. Det är dock svårt att få en ren synkroniserade population av celler i specifika stadier på grund av heterogenitet meiotiska och efter meiotiska bakteriecellen populationer i juvenil och adult testiklarna. För senare stadier av meios är det fördelaktigt att bedöma oocyter som genomgår meios jag (MI) eller meios II (MII), eftersom grupper av mogna äggceller kan samlas från vuxna kvinnliga möss och stimuleras för att återuppta meios i kultur. Här metoder för meiotiska kromatin sprida förberedelser använda oocyter från fostrets, dissekeras neonatal och vuxen äggstockarna beskrivs med tillhörande videodemonstrationer. Kromosom missegregation händelser i däggdjur oocyter är vanliga, särskilt under MI. Dessa tekniker kan användas för att bedöma och karakterisera effekterna av olika mutationer eller miljöexponering under olika stadier av oogenes. Eftersom det finns tydliga skillnader mellan oogenes och spermatogenes, är de tekniker som beskrivs inom ovärderlig för att öka vår förståelse av däggdjur oogenes och könsdimorfisk funktioner i kromosom och protein dynamics under meios .

Vi har beskrivit två tekniker för att visualisera och bedöma meiotiska kromosomer i oocyter. Den första tekniken är tillgodoses mot bedömningen av profas progression i embryonala och neonatal äggstockarna. Profas kromatin spridning preparat är otroligt värdefulla för att visualisera många dynamiska processer under meios, inklusive kromosom ihopkoppling, mås och desynapsis, homolog rekombination och epigenetiska kromosom remodeling. Här, vi har visat nyttan av denna metod för...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Kromatin sprida preparat för analys av mus äggcellen Progression från profas till metafas II

Oogenes hos däggdjur är känt för att vara felbenägna, särskilt på grund av kromosom missegregation. Detta manuskript beskriver kromatin sprida beredningsmetoder för mus profas, metafas I och II-iscensatt oocyter. Dessa grundläggande tekniker möjliggör studier av kromatin-bundna proteiner och kromosom morfologi i hela däggdjur oogenes.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Genetics

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sekventiell Salt extraktioner för analys av Bulk kromatin bindande egenskaper av kromatin ändra komplex

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Kromatinimmunutfällning (ChIP) i mus-T-celllinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kartläggning av MLV-integrationswebbplatser för att definiera cellspecifika reglerande regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerande och inducerbara system för genetiska In Vivo modifiering av mus hepatocyter använder hydrodynamiska svans ven injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-assisted isolering av reglerande element till åtgärd kromatin tillgänglighet i däggdjursceller

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...