Name: an efficient in vitro transposition method by a transcriptionally regulated sleeping beauty system packaged into an integration defective lentiviral vector
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector at

ونشكر الأستاذ زابافيجنا وجامعة مودينا ريجيو إميليا، مودينا، إيطاليا لتزويدنا بما بتشل-PGKrtTA2S-بلازميد M2. ونعترف أيضا زين Z. إيفيكس (معهد بول الريش، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا) والبلازميدات pCMVSB100X و pT2/البوسنة والهرسك. أيد هذا العمل ديبرا الدولية ووزارة الجامعة والبحث الإيطالية.

1-والبلازميدات المستخدمة
ملاحظة: بلازميد بتشل-PGKrtTA2S-M2 كان يرجى قدمها الأستاذ زابافيجنا (جامعة مودينا وريدجو إميليا، مودينا، إيطاليا). بلازميد pCMVSB100X تحمل الترميز تسلسل ترانسبوساسي مفرط وبلازميد ينقول pT2/البوسنة والهرسك قدمت تفضلت بزين Z. إيفيكس (معهد بول ايرليك، أنغن، أ?...

<ol>
	<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates.">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li><li>Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+system+to+redirect+T-cell+specificity+for+human+applications.">Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.</a> J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).</li><li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells.">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li><li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells.">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li><li>Belay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+hyperactive+transposons+for+genetic+modification+of+induced+pluripotent+and+adult+stem+cells:+a+nonviral+paradigm+for+coaxed+differentiation.">Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation.</a> Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).</li><li>Grabundzija, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-based+system+for+cellular+reprogramming+and+targeted+gene+insertion+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).</li><li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+sleeping+beauty+transposon-mediated+porcine+induced+pluripotent+stem+cells.">Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).</li><li>Turchiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+Sleeping+Beauty+transposon+integration+in+human+somatic+cells.">Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells.</a> PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).</li><li>Jin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).</li><li>Latella, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Recessive+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa+by+Transposon-Mediated+Integration+of+COL7A1+in+Transplantable+Patient-Derived+Primary+Keratinocytes.">Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+profile+and+safety+of+an+adenovirus+hybrid-vector+utilizing+hyperactive+sleeping+beauty+transposase+for+somatic+integration.">Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration.</a> PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+adeno-associated+viral+vectors+utilizing+transposase-mediated+somatic+integration+for+stable+transgene+expression+in+human+cells.">Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).</li><li>Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty-baculovirus+hybrid+vectors+for+long-term+gene+expression+in+the+eye.">Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye.</a> J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).</li><li>Galla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+cytotoxicity+of+transposases+by+dose-controlled+mRNA+delivery.">Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).</li><li>Moldt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomic+integration+profiling+of+Sleeping+Beauty+transposons+mobilized+with+high+efficacy+from+integrase-defective+lentiviral+vectors+in+primary+human+cells.">Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells.</a> Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).</li><li>Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+of+functional+transgenes+into+the+human+genome+by+adeno/AAV+hybrid+vectors.">Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors.</a> Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).</li><li>Urlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+for+tetracycline-dependent+transcriptional+activators:+novel+mutations+yield+expanded+range+and+sensitivity.">Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).</li><li>Cocchiarella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+regulated+and+nontoxic+delivery+of+the+hyperactive+Sleeping+Beauty+Transposase.">Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).</li><li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors.">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+DNA+transposable+elements+from+lentiviral+vectors.">Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors.</a> Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).</li><li>Dellambra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrective+transduction+of+human+epidermal+stem+cells+in+laminin-5-dependent+junctional+epidermolysis+bullosa.">Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa.</a> Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).</li></ol>

هنا، يمكننا وصف منهجية متاحة على نطاق واسع لإدماج غوي ستابلي في جينوم الخلايا المستهدفة الجمال النائم-بوساطة تبديل. على الرغم من أن وضع نظام بينالي الشارقة لتوفير أسلوب فاجيناليس للتحرير الجينوم، تسليم كفاءة إليه التكامل (ترانسبوساسي وينقول T2) إلزامي. ولذلك، استخدام نظام بينالي الش?...

تم بالفعل استخدام ترانسبوساسي SB100X مفرط بالإضافة إلى ينقول المستندة إلى T2 في الجينات السريرية العلاج التطبيقات1،2،3، الجينوم التعديلات4،5، و المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية) إعادة برمجة6،7. عادة، مكونات SB توفرها عابر تعداء بلازميد ومروج تأسيسي قوية التعبير عن ترانسبوساسي محركات الأقراص. ومع ذلك، يظل تقديم النظام المكون الثاني على الرغم من تحسين أساليب جديدة من تعداء، تحديا للعديد من التطبيقات. وهكذا، قد وضع بروتوكول جديد بإيصال اهتماما متزايداً. بالإضافة إلى طرق تعداء بلازميد8 ومرناً9، الفيروسية التسليم استناداً إلى أدينوفيرال10،11، مرتبطة بالغدد الفيروسية (إف)12، باكولوفيروس13، جاماريتروفيرال14 وناقلات لينتيفيرال15 وقد اقترح في الماضي. جدير بالذكر أن نظام الاختيار يجب أن تضمن عملية تسليم عابر لمكونات SB دون التكامل بين النواقل الفيروسية. ومع ذلك، التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي يثير الشواغل المتعلقة بالسلامة بسبب خطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.
ولذلك، تنظيم النسخي SB100X بنظام على تيت المكرر هو التحدي الأول. مروج تيت مراعية معدلة، التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال المروج المتقدمة الحد الأدنى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) الأصلي مع المروج (-81) الحد الأدنى من الجينات تيميديني كيناز (المعارف التقليدية) من فيروس "الحلأ البسيط"-1 (هامبورغ-1)16، هو استنساخ المنبع كدنا SB100X (pTetOTKSB100X). تحور عكس-التتراسيكلين-ترانساكتيفاتور rtTA2s-أعرب عن M217 تحت سيطرة قوي التأسيسي المروج (المروج فوسفوجليسيراتي، PGK) المستنسخة في بلازميد مختلفة (بتشل-PGKrtTA2S-M2). عند إضافة إلى متوسط الثقافة، يربط دوكس rtTA2s-المغير M2 والحبال المروج تيت المعقدة، أو الناتجة عن ذلك في شكل محكم التنظيم الاستقراء من التعبير SB100X18.
التحدي الرئيسي الثاني ينشأ من تعداء الكفاءة البشرية الابتدائية الخلايا بالعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية. لكفاءة تسليم ترانسبوساسي في الخلايا البشرية مقاومة تعداء، SB100X و rtTA2s-شرائط التعبير M2 يتم حزم في اثنين التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة (إيدلفس)19: إيدلفتكسب و IDLVrtTA2s- M2. يتم إنتاج النواقل الفيروسية عابر كناقلات الجيل الثالث في الخلايا HEK293T20 وبسيودوتيبيد مع بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم فيسسيكولار (منظمة-ز)، الذي يمنح طائفة عريضة من العدوى. ناقل الجزيئات هي تتركز تنبيذ فائق ومعاير بفيروس نقص المناعة البشرية-1 "اسكت" إيمونوكابتوري p24. جسيمات ناقلات الرصاصية مع بوليبريني ترانسدوسي خطوط الخلايا والخلايا الأولية، وهي المحتضنة مع الخلايا المستهدفة في وجود أو عدم وجود دوكس. تفعيل مدمني المخدرات من التعبير SB100X في الخلايا ترانسدوسيد تقاس بكمية RT-PCR (قرة-PCR)18.
تحويل غوي (مثلاً، أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) إلى جينوم الخلية المستهدفة بمجرد يتجلى التعبير ينظم تيت SB100X، يتبع الأحداث الجزيئية وضوح المخططة ب باك وميكيلسن21. ثالث إيدلف ناقلات تحمل كاسيت تعبير لحكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب T2-ينقول (IDLVT2) وقد شيدت وتعبئتها كما هو مذكور أعلاه. وأخيراً، يمكن استخدام ثلاث ناقلات إيدلف كفاءة ترانسدوسي الخلايا البشرية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية) في المختبر وإدماج غوي حضور الدوكسيسيكلين18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>Cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Reagents for cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Reagent for cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-737E</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4&#183;2H2O), 99.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for injection</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>-</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m PESS filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462100</td>
			<td>Filters used to remove cell debris from viral supernatant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer Beckman tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-1X w/o Ca, Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td>Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 Gag p24 immunocapture kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEK50001KT</td>
			<td>Kit for IDLV particle titration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Reagent to enhance transduction efficiency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>BE17-160E</td>
			<td>Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>100938B</td>
			<td>AnalaR BDH</td>
			<td>Reagent for trypsin working solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Bovine Serum, New Zealand Origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16030-074</td>
			<td>Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21765</td>
			<td>Medium for keratinocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>Serum for HeLa cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Serum for human primary keratinocyte culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1152-25</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3867-1</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5516</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Austral Biological</td>
			<td>GF-010-9</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-099</td>
			<td>To label feeder layer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>RNA purification kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Reverse transcriptase kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7295</td>
			<td>Reagent for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Hot Start Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M740B</td>
			<td>Taq polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15581028</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-9891</td>
			<td>drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4304437</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tubes for cell collection and vector dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Cell culture dish for viral production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Tubes for dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td>Tubes for dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Tubes for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4346906</td>
			<td>96-well for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td>Tubes for flow cytometry acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Pipettes for sterile tissue culture applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for measurement of HBS 2X pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>7900HT</td>
			<td>Equipment for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracentrifuge for lentiviral particle production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 &#176;C, -20 &#176;C, -80 &#176;C), micropipettes and pipet-aid).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient in vitro transposition method by a transcriptionally regulated sleeping beauty system packaged into an integration defective lentiviral vector

ينقول النائمة (س. ب) نظام تكامل غير فيروسية مع أثبتت فعاليتها لنقل الجينات والجينوم الوظيفي. لتحسين إليه ينقول SB، يعملون ترانسبوساسي مفرط التنظيم ترانسكريبتيونالي (SB100X)، والمستندة إلى T2 ينقول. عادة، يتم توفير ترانسبوساسي وينقول عابر من تعداء بلازميد والتعبير SB100X تحركها مروج تأسيسي. وهنا، يمكننا وصف طريقة فعالة لتوصيل المكونات بينالي الشارقة إلى الخلايا البشرية التي مقاومة للعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية تعداء، التحكم في التعبير SB100X وإدماج [ستبلى] مورثة للفائدة (غوي) من خلال SB "قص ولصق" إليه. يتم التعبير عن ترانسبوساسي مفرط رقابة مشددة من جانب النظام على تيت، تستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير الجيني منذ عام 1992. الجينات للاهتمام هو محاط يكرر مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من ينقول T2. يتم حزم كلا العنصرين بينالي الشارقة في التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة عابر تنتج في الخلايا HEK293T. الخلايا البشرية، أما من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية من الأنسجة البشرية، في المختبر ترانسدوسيد عابر مع النواقل الفيروسية. عند إضافة الدوكسي (دوكس، التتراسيكلين التناظرية) في المتوسط الثقافة، يقاس الضبط الدقيق للتعبير ترانسبوساسي والنتائج في على تكامل طويلة الأمد للجينات للفائدة في جينوم الخلايا المعالجة. هذا الأسلوب يتسم بالكفاءة وتنطبق على خط الخلية (مثل خلايا هيلا) والخلايا الأولية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية البشرية)، ويمثل بالتالي أداة قيمة للهندسة الوراثية ونقل الجينات العلاجية.

استخدام الإجراء المعروضة هنا، ثلاث ناقلات إيدلف تحمل مكونات بينالي الشارقة ينظم (SB100X، rtTA2S-ينقول M2 وبروتينات فلورية خضراء-T2) تم تعبئتها واستخدامها لكفاءة تقديم وتنظيم أحكام نظام بينالي الشارقة في الخلايا البشرية. ويبين الشكل 1A مخطط في المختبر ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector at

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-تكس: أداه تكامل البيانات المفتوحة المصدر لنسخ البيانات الكبيرة المصممة لمكافحه ناقلات الملاريا

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...