Name: an efficient in vitro transposition method by a transcriptionally regulated sleeping beauty system packaged into an integration defective lentiviral vector
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00
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我々 は教授 Zappavigna、モデナ大学、レッジョ ・ エミリア、モデナ、イタリア pCCL PGKrtTA2Sと私たちを提供するために感謝-M2 プラスミド。我々 はまた pCMVSB100X と pT2/BH プラスミドの教授 Z. Ivics (ポール Ehlrich 研究所、ドイツのランゲン) と教授 Z. Izvak (Max Delbruck センター分子医学、ベルリン、ドイツ) を認めます。この作品は、国際デブラとイタリア大学・研究省によって支えられました。

1. プラスミドを採用
注: プラスミド pCCL PGKrtTA2S-M2 親切教授 Zappavigna (大学のモデナとレッジョ ・ エミリア、モデナ、イタリア) で提供されました。非常に活発なトランスポザーゼのコード配列を運ぶ pCMVSB100X プラスミドと pT2/BH トランスポゾン プラスミド親切教授 Z. Ivics (ポール Ehrlich の協会、ドイツのランゲン)、教授 Z. Izvak (Max Delbruck 分子医学センター、ベルリ...

<ol>
	<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates.">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li><li>Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+system+to+redirect+T-cell+specificity+for+human+applications.">Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.</a> J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).</li><li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells.">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li><li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells.">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li><li>Belay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+hyperactive+transposons+for+genetic+modification+of+induced+pluripotent+and+adult+stem+cells:+a+nonviral+paradigm+for+coaxed+differentiation.">Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation.</a> Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).</li><li>Grabundzija, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-based+system+for+cellular+reprogramming+and+targeted+gene+insertion+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).</li><li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+sleeping+beauty+transposon-mediated+porcine+induced+pluripotent+stem+cells.">Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).</li><li>Turchiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+Sleeping+Beauty+transposon+integration+in+human+somatic+cells.">Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells.</a> PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).</li><li>Jin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).</li><li>Latella, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Recessive+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa+by+Transposon-Mediated+Integration+of+COL7A1+in+Transplantable+Patient-Derived+Primary+Keratinocytes.">Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+profile+and+safety+of+an+adenovirus+hybrid-vector+utilizing+hyperactive+sleeping+beauty+transposase+for+somatic+integration.">Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration.</a> PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+adeno-associated+viral+vectors+utilizing+transposase-mediated+somatic+integration+for+stable+transgene+expression+in+human+cells.">Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).</li><li>Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty-baculovirus+hybrid+vectors+for+long-term+gene+expression+in+the+eye.">Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye.</a> J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).</li><li>Galla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+cytotoxicity+of+transposases+by+dose-controlled+mRNA+delivery.">Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).</li><li>Moldt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomic+integration+profiling+of+Sleeping+Beauty+transposons+mobilized+with+high+efficacy+from+integrase-defective+lentiviral+vectors+in+primary+human+cells.">Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells.</a> Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).</li><li>Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+of+functional+transgenes+into+the+human+genome+by+adeno/AAV+hybrid+vectors.">Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors.</a> Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).</li><li>Urlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+sequence+space+for+tetracycline-dependent+transcriptional+activators:+novel+mutations+yield+expanded+range+and+sensitivity.">Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).</li><li>Cocchiarella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+regulated+and+nontoxic+delivery+of+the+hyperactive+Sleeping+Beauty+Transposase.">Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).</li><li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors.">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+DNA+transposable+elements+from+lentiviral+vectors.">Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors.</a> Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).</li><li>Dellambra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrective+transduction+of+human+epidermal+stem+cells+in+laminin-5-dependent+junctional+epidermolysis+bullosa.">Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa.</a> Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).</li></ol>

ここでは、眠れる森の美女による標的細胞のゲノムに安定、五井を統合する広くアクセスできる方法論について述べる-転位を介する。SB システム nonviral ゲノムの編集法を提供するために開発されましたが、統合機械 (トランスポザーゼと T2 トランスポゾン) の効率的な配信は必須です。したがって、SB システムをほとんど transfectable の一次電池、使用する SB コンポーネントのウイル?...

T2 ベース トランスポゾンと結合した多動 SB100X トランスポザーゼは既に臨床遺伝子療法アプリケーション1,2,3, ゲノムの変更4、5で使用されていて、誘導多能性幹細胞 (iPSC)6,7をプログラムし直します。通常、SB コンポーネント一過性トランスフェクション プラスミドによって提供されます、強い構成プロモーター ドライブ、トランスポザーゼの式。ただし、トランスフェクションの向上新しい方法にもかかわらず二成分系の配信のまま多くのアプリケーションのための挑戦です。したがって、新しい配信プロトコルの開発は、関心が高まっています。トランスフェクション法プラスミド8と mRNA9、ほかウイルス配信によるアデノ ウイルス10、11、アデノ随伴ウイルス (AAV)12、バキュロ ウイルス13、gammaretroviral14レンチウイルスベクター15は過去に提案されています。特に、選択肢のシステムはウイルスのベクトルの統合がなければ SB コンポーネントの一時的な配信を保証しなければなりません。それにもかかわらず、構成式のトランスポザーゼは、トランスポゾンの手に負えない rehopping の危険があるため安全上の懸念を発生させます。
したがって、洗練されたテトのシステムによる SB100X の転写調節機構は、初挑戦です。単純ヘルペス ウイルス 1 (HSV-1)16, Timidine キナーゼ (TK) 遺伝子の最小プロモーター (-81) とオリジナル開発最小限サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターを置き換えることによって得られる変更されたテト応答性プロモーターのクローンの上流、SB100X cDNA (pTetOTKSB100X)。変異の逆テトラサイクリン トランス rtTA2s-M217は異なるプラスミドの複製 (ホスホ グリセリン酸プロモーター、PGK) 強い構成プロモーターの制御下で表されます (pCCL PGKrtTA2S・ m 2)。Dox を培養培地に加え、rtTA2sがバインドされます-M2 の変調器は、複雑なまたは、SB100X 式18の堅く調整された誘導の Tet プロモーターをテザーします。
2 番目の主要な課題は、物理的・化学的手法によるひと初代培養細胞の非能率的なトランスフェクションから発生します。ひと細胞のトランスフェクション、SB100X、rtTA2sに耐性トランスポザーゼを効率的に配信-M2 式カセットが 2 つ統合欠陥レンチウイルスベクター (IDLVs)19にパッケージ化: IDLVTKSB と IDLVrtTA2s-M2。ウイルスのベクトルは一過性 HEK293T 細胞20と Vescicular 性口内炎ウイルス (VSV G)、感染症の広範なスペクトルを与えるの糖蛋白質 G の新規第 3 世代ベクトルとして生産されています。ベクトル粒子は遠心によって濃縮され、HIV 1 ギャグ p24 イミュノキャプチャー滴定します。細胞と細胞を変換するには、ベクトル粒子は polybrene 複合体し、dox の有無と標的細胞培養が。薬物依存性活性化導入された細胞における SB100X の発現は、定量的 RT-PCR (qRT PCR)18によって測定されます。
テト規制 SB100X 式を示した一度ターゲット細胞のゲノムに (例えば、緑色蛍光タンパク質 GFP) 五井の転位は明らかに Bak とミケルセン21描き出しました分子イベントに従います。IDLV 3 分の 1 は、五井 T2 トランスポゾン IRs (IDLVT2) 間のクローン作成の式カセットが構築し上記のようにパッケージを運ぶベクターします。最後に、効率的に生体外で人間の細胞 (例えば、プライマリ ケラチノ サイト) 変換し、ドキシサイクリン18存在下で五井を統合する 3 つの IDLV ベクトルを使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>Cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td>Reagents for cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Reagent for cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-737E</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4&#183;2H2O), 99.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for injection</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>-</td>
			<td>Reagent for HBS 2X preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m PESS filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462100</td>
			<td>Filters used to remove cell debris from viral supernatant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer Beckman tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-1X w/o Ca, Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td>Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 Gag p24 immunocapture kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEK50001KT</td>
			<td>Kit for IDLV particle titration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Reagent to enhance transduction efficiency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>BE17-160E</td>
			<td>Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td>
			<td>100938B</td>
			<td>AnalaR BDH</td>
			<td>Reagent for trypsin working solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Bovine Serum, New Zealand Origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16030-074</td>
			<td>Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21765</td>
			<td>Medium for keratinocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>Serum for HeLa cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Serum for human primary keratinocyte culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1152-25</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>3867-1</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5516</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF</td>
			<td>Austral Biological</td>
			<td>GF-010-9</td>
			<td>Reagents for keratinocyte growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-099</td>
			<td>To label feeder layer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>RNA purification kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080051</td>
			<td>Reverse transcriptase kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7295</td>
			<td>Reagent for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Hot Start Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M740B</td>
			<td>Taq polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15581028</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Reagent for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-9891</td>
			<td>drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4304437</td>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tubes for cell collection and vector dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Cell culture dish for viral production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td>Tubes for dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td>Tubes for dilution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Tubes for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4346906</td>
			<td>96-well for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td>Tubes for flow cytometry acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Pipettes for sterile tissue culture applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for measurement of HBS 2X pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis equipment</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>Flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>7900HT</td>
			<td>Equipment for qRT-PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracentrifuge for lentiviral particle production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 &#176;C, -20 &#176;C, -80 &#176;C), micropipettes and pipet-aid).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.</td>
		</tr>
	</tbody>
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an efficient in vitro transposition method by a transcriptionally regulated sleeping beauty system packaged into an integration defective lentiviral vector

眠れる森の美女(SB) トランスポゾンは遺伝子導入および機能ゲノム解析の実証済みの有効性と非ウイルス性統合システムです。SB トランスポゾン機械を最適化するためには、転写規制多動トランスポザーゼ (SB100X) やトランスポゾンの T2 ベースを採用します。通常、トランスポザーゼとトランスポゾンは一過性トランスフェクション プラスミッドによって提供される、SB100X 式が構成のプロモーターによって駆動されます。ここでは、SB100X 式を制御し、安定した統合により、「カットアンド ペースト「アンチモン (五井) 興味遺伝子のいくつかの物理的および化学的遺伝子導入方法に耐性がある人間の細胞に SB コンポーネントを提供する効率的な手法について述べるメカニズム。多動トランスポザーゼの式は 1992 年以来の遺伝子発現の制御に広く用いられる、テトのシステムによって厳しく制御されています。興味の遺伝子は、反転の繰り返し (IR) T2 トランスポゾンによって挟まれています。SB の両方のコンポーネントは、欠陥レンチウイルスベクターは一過性 HEK293T 細胞で生産される統合パッケージ化されます。ヒトの細胞、細胞株あるいは人間のティッシュから初代培養細胞は体外一過性のウイルスのベクトルを導入です。培地にドキシサイクリン (dox、テトラサイクリン アナログ) の追加が、トランスポザーゼ式の微調整は、測定し、扱われた細胞のゲノムの興味の遺伝子の長期的な統合の結果します。このメソッドは効率的で (例えば、HeLa 細胞) と初代培養細胞 (例えば、人間プライマリ ケラチノ サイト) に適用される、従って遺伝子工学や遺伝子治療のための貴重なツールを表します。

ここで説明されて手順を使用して規制される SB 成分を運ぶ 3 つの IDLV ベクトル (SB100X、rtTA2S-M2 と T2 GFP のトランスポゾン) パッケージ化され使用を効率的に配信し、しっかりと人間の細胞で SB 系を調節します。図 1 aは、体外伝達 HeLa 細胞 (表 2に報告される) 2 つの IDLV ベクトルの最高用量の組み合わせで SB トランス?...

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An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

このプロトコルでは、転写調節の眠れる森の美女システムによって人間のゲノムへの興味の遺伝子の安定した統合を実現する方法について説明します。統合導入された細胞の分子アッセイ、ひと細胞の体外伝達不良レンチウイルスベクターの作製が報告されます。

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx:マラリアベクトルアノフェレスガンビア用に設計されたビッグデータトランスクリプトミクスのためのオープンソースデータ統合ツール

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...