Name: visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

इस काम को Radboud यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर से एक Hypatia फेलोशिप, ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम से कॅरियर डेवलपमेंट अवार्ड, नीदरलैंड्स के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए संस्था से २०१३ का बढऩा कार्यक्रम (NWO; आईसीआई-024.002.009), NWO (ALW विडि 864.14.001) से एक विडि अनुदान, और यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (अनुदान समझौते संख्या ३३६४७९) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से एक प्रारंभिक अनुदान ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल लाइव हेला कोशिकाओं में syntaxin 4 और VAMP3 के बीच जाल बातचीत के दृश्य के लिए झल्लाहट-FLIM के उपयोग को दर्शाता है. Syntaxin 4 एक क्यूए-जाल प्रोटीन मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली पर पता लगाने जहां यह मध्यस्थता exocytosis1,2,20,21है । VAMP3 एक आर-जाल जो मुख्य रूप से endosomal डिब्बों रीसाइक्लिंग और अंय endosomes के लिए और साथ ही प्लाज्मा झिल्ली1,2,20के लिए तस्करी की मध्यस्थता में पता लगाने के लिए वर्णित है । हालांकि, झल्लाहट-FLIM परख आसानी से अंय जाल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । केवल शर्त यह है कि इन जाल एक सी-टर्मिनल transmembrane कुंडलित होते हैं, जो अब तक सबसे जाल प्रोटीन के लिए मामला है1,2. इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहां वर्णित किसी भी युकेरियोटिक कोशिका प्रकार, पौधों और खमीर सहित में जाल परिसरों के दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम झल्लाहट का एक उपाय के रूप में दाता fluorophore के प्रतिदीप्ति जीवनकाल के छोटा इस्तेमाल किया । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, स्वीकारकर्ता fluorophore के जीवनकाल की जांच की जा सकता है, क्योंकि संवेदनशील उत्सर्जन एक अलग वृद्धि चरण जो स्पष्ट सबूत है कि प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण होता है प्रदान करता है ।
वर्तमान में, झल्लाहट-FLIM तकनीक लाइसोसोमल डिब्बों में जाल परिसरों कल्पना करने में सक्षम नहीं हो सकता है । syntaxin 3-mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण के लिए, mCherry प्रतिदीप्ति अक्सर एक juxtanuclear क्षेत्र में अधिक संचित पाया जा सकता है, जो संभावना लाइसोसोमल डिब्बों से मेल खाती है, जबकि mCitrine संकेत सेलुलर में और अधिक प्रचुर मात्रा में है परिधि५. mCitrine की तुलना में mCherry के एक समान juxtanuclear संचय मनाया गया, जब एक ही जाल प्रोटीन इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए थे सह5व्यक्त की । Lysosomes एक अत्यंत कम पीएच (& #60; 4) और proteolytic एंजाइमों की एक उच्च गतिविधि की विशेषता है । mCherry के juxtanuclear संचय की संभावना लाइसोसोमल mCitrine की तुलना में fluorophore क्षरण के लिए mCherry fluorophore के एक उच्च प्रतिरोध के कारण होता है । यह mCitrine के पीएच शमन के कारण नहीं है, के रूप में mCherry के juxtanuclear संचय भी कोशिकाओं के निर्धारण पर होता है5। इस प्रकार, झल्लाहट-FLIM तकनीक juxtanuclear (लाइसोसोमल) क्षेत्रों में झल्लाहट की राशि का अनुमान है और यह अंय फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन है कि lysosomes के लुमेन के भीतर कठोर शर्तों जीवित रहने की आवश्यकता होगी ।
झल्लाहट-FLIM सिद्धांत में एक (अर्द्ध) जटिल में जाल के अंश का मात्रात्मक अनुमान प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है5. जैसा कि हम इस प्रोटोकॉल में समझाया, यह डबल-घातीय क्षय कार्यों के साथ प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम की फिटिंग की आवश्यकता है (समीकरण 2), जहां तेजी से घटक के आयाम परिसर में जाल के अंश के लिए आनुपातिक है ( समीकरण 3) । हालांकि, एक दो घटक मॉडल के साथ इस तरह फिटिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । कई मुफ्त फिट मापदंडों के साथ फिटिंग (दो प्रतिदीप्ति जंमों और दो आयाम) फोटॉनों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता है, विशेष रूप से मापदंडों के बाद से एक दूसरे को प्रभावित करेगा और जीवन में छोटे त्रुटियों आयाम और उपाध्यक्ष को प्रभावित करेगा विपरीत। इन फिटिंग समस्याओं को दूर करने के लिए, धीमी घटक के प्रतिदीप्ति जंमों दाता केवल हालत (अर्थात्के जीवनकाल के लिए तय किया जा सकता है, कोई झल्लाहट; केवल mCitrine वर्तमान) और है कि मिलकर के जीवनकाल के लिए तेजी से घटक का निर्माण ( अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । हालांकि, यह भी ध्यान के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, क्योंकि प्रतिदीप्ति जंमों इन नियंत्रण राज्यों में के रूप में ही नहीं हो सकता है, और क्योंकि कई कारणों से विचलित सकता है (स्वयं शमन, द्विध्रुवीय अभिविंयास, microenvironment में रूपांतरों) । एकाधिक बंद निकटता के भीतर जाल परिसरों (& #60; 10 एनएम) दूरी पर निर्भर झल्लाहट में परिणाम कर सकते हैं, एक ही सिद्धांत है कि झल्लाहट की अनुमति देता है एक "आणविक शासक" के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस मामले में, जाल परिसर के ठहराव अस्पष्ट । इसके अलावा, एक मात्रात्मक अनुमान हमेशा सार्थक नहीं है, क्योंकि लेबल जाल अंतर्जात (unलेबल्ड) जाल के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं । एक परिणाम के रूप में, mCherry-लेबल जाल की अभिव्यक्ति स्तर5झल्लाहट प्रतिशत के लिए एक मुख्य निर्धारक है । इन सभी निरंतर के कारण, यह एक मोनो-घातीय क्षय समारोह (समीकरण 1) के साथ फ्लोरोसेंट जीवनकाल हिस्टोग्राम फिट करने के लिए सिफारिश की है. यह लाभ है कि यह जीवन भर के किसी भी प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट औसत फ्लोरोसेंट जीवन भर के लिए एक ठोस उपाय5परिसर जाल प्रदान करता है ।
फिर भी, यह अपेक्षित है कि मात्रात्मक झल्लाहट-FLIM इमेजिंग द्वारा दो घटक फिटिंग मॉडल शक्तिशाली भविष्य अनुप्रयोगों होगा । गुणसूत्र के भीतर जाल एंकोडिंग जीन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ जुड़े हुए हो सकता है, उदाहरण के लिए CRISPR/CAS9 द्वारा । अंतर्जात के फ्लोरोसेंट लेबलिंग में यह परिणाम अंतर्जात प्रोटीन के स्तर के साथ और unलेबल्ड जाल की कोई पृष्ठभूमि, जाल प्रोटीन, और इस तरह झल्लाहट-FLIM द्वारा जाल परिसरों के अंश का एक सार्थक मात्रात्मक अनुमान के लिए अनुमति देता है. जबकि अंतर्जात जाल की अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हो सकता है और अपेक्षाकृत कम फ्लोरोसेंट संकेत दे, यह आशा की जाती है कि फोटॉनों की एक पर्याप्त संख्या विशेष रूप से पूरे सेल FLIM के लिए प्राप्त किया जा सकता है (जो केवल कुछ 1, फोटॉनों की वारदातों की आवश्यकता है) । इसके अलावा, इन झल्लाहट-FLIM माप और अधिक संवेदनशील हिमस्खलन photodiode डिटेक्टरों जो भी उच्च प्रतिदीप्ति संकेतों और बेहतर फोटॉन आंकड़ों में परिणाम होगा के साथ किया जा सकता है ।

झिल्ली की तस्करी युकेरियोटिक कोशिकाओं की एक केंद्रीय सुविधा है, जहां झिल्ली बुलबुले एक दाता organelle से कली और फिर चाल और एक लक्ष्य organelle के साथ फ्यूज1,2। mitochondria के लिए छोड़कर, इन सभी झिल्ली संलयन कदम जाल प्रोटीन परिवार1,2के सदस्यों द्वारा catalyzed हैं । जाल प्रोटीन परिवार के बारे में ३६ स्तनधारी कोशिकाओं में सदस्यों और खमीर में 20 सदस्यों के बारे में2होते हैं । जाल प्रोटीन एक या दो ~ ५२ अवशेषों-लंबे, natively unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों, जाल रूपांकनों बुलाया होते हैं । जाल प्रोटीन अक्सर एक सी-टर्मिनल transmembrane कुंडलित से झिल्ली को सीमित कर रहे हैं1,2. जाल वे arginine (आर) में जाल परिसर में योगदान केंद्रीय अवशेषों के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है और glutamine (क्यू)1जाल,2. झिल्ली फ्यूजन 3 या 4 cognate जाल की बातचीत से प्रेरित है कि एक साथ 4 जाल रूपांकनों योगदान और दोनों दाता और स्वीकारकर्ता झिल्ली1,2पर वितरित कर रहे हैं । एक जाल जटिल एक आर जाल आकृति और तीन क्यू जाल रूपांकनों (अवधि के क्यूए, Qb, और Qc) के होते हैं । जटिल गठन जाल रूपांकनों के एन-टर्मिनी में शुरू होता है, एक तथाकथित ट्रांसजाल जटिल गठन, और सी टर्मिनी की ओर आय, एक तंग α-पेचदार कुंडलित-कुंडल बंडल एक सीआईएस-जाल-परिसर नामक बनाने । यहां तक कि एक भी एक जाल जटिल के जटिल गठन दाता और स्वीकारकर्ता झिल्ली को एक साथ खींचता है और झिल्ली संलयन3के लिए ऊर्जा बाधा पर काबू ।
कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट परिवहन मार्गों के लिए अलग जाल परिसर निर्दिष्ट अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. हालांकि जाल स्पष्ट रूप से झिल्ली की तस्करी की विशिष्टता के लिए योगदान, वे, संकीर्ण कार्यात्मक बेमानी हैं, और उनके कार्यों1,2ओवरलैप । इस वजह से, गड़बड़ी प्रयोगों लक्ष्यीकरण, इस तरह के जीन नॉकआउट, आरएनए हस्तक्षेप, अवरुद्ध एंटीबॉडी, या घुलनशील जाल के साथ की शुरूआत के रूप में जाल, प्रमुख नकारात्मक के रूप में अभिनय टुकड़े, अक्सर अन्य के रूप में स्पष्ट phenotypes में परिणाम नहीं है जाल2क्षतिपूर्ति,4. इसके अलावा, यह ऊपर की तस्करी की घटनाओं से विशिष्ट झिल्ली संलयन कदम अंतर करने के लिए मुश्किल है, क्योंकि जाल कई परिवहन मार्गों में शामिल किया जा सकता है2. सूक्ष्म दृष्टिकोण से जाल का स्थानीयकरण अध्ययन, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए immunolabeling या आनुवंशिक संलयन का उपयोग, समस्याओं से ग्रस्त है कि: (मैं) जाल कई organelles को खोजने के रूप में वे अक्सर कई तस्करी कदम मध्यस्थता, और (द्वितीय) उनके स्थानीयकरण स्वचालित रूप से वे कार्यात्मक जटिल गठन जाल में लगे हुए हैं मतलब नहीं है । अंत में, जाल परिसरों चारा के रूप में जाल में से एक का उपयोग कर immunoprecipitation प्रयोगों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है और अन्य ठिकानों के रूप में जाल, लेकिन यह विशिष्ट organelles या तस्करी मार्गों के लिए इन परिसरों के असाइनमेंट की अनुमति नहीं है. इस प्रकार, वर्तमान में, वहाँ कोई वैकल्पिक तकनीक organellar संकल्प के साथ जाल परिसरों कल्पना करने के लिए है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस जाल बातचीत साबित करने के लिए सक्षम नहीं है, लेकिन केवल उपस्थिति या सह स्थानीयकरण की अनुपस्थिति दिखा सकते हैं, जबकि immunoprecipitation केवल पूरे सेल आबादी में जाल बातचीत लेकिन organelles आवंटित नहीं दिखा सकते हैं, जहां इन इंटरैक्शन होते हैं.
इन सीमा पर काबू पाने के लिए, एक उपंयास विधि organellar संकल्प के साथ जीना कोशिकाओं के भीतर जाल परिसरों के मात्रात्मक दृश्य के लिए अनुमति हाल ही में Verboogen एट अल द्वारा विकसित किया गया था । 5 इस विधि के साथ जाल के जोड़े की अभिव्यक्ति पर आधारित है वर्णक्रमीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके transmembrane helices के लिए सी-टर्मिनल से जुड़े हुए स्थानांतरित कर दिया । झिल्ली संलयन और एक सीआईएसजाल परिसर के गठन के पूरा होने के बाद, transmembrane helices के सी-टर्मिनी पर इन fluorophores तुरंत एक दूसरे के लिए झकझोरता हैं. fluorophores तो Förster दूरी के भीतर अच्छी तरह से कर रहे हैं (आमतौर पर & #60; 5 एनएम), हरी पाली दाता fluorophore से झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप लाल पाली स्वीकारकर्ता fluorophore5,6। दाता fluorophore के शमन में परिणाम झल्लाहट और स्वीकार fluorophore कि दाता और स्वीकारकर्ता उत्सर्जन (ratiometric झल्लाहट) के अनुपात से मापा जा सकता है की एक वृद्धि उत्सर्जन । हालांकि, दो अलग अणुओं के बीच ratiometric झल्लाहट चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि प्रतिदीप्ति पार बात और दाता और स्वीकारकर्ता के विभिंन स्तरों के विभिंन organelles और कोशिकाओं के बीच में जाल7,8। झल्लाहट भी प्रतिदीप्ति जीवनकाल, जो उत्तेजना और एक फोटॉन के उत्सर्जन के बीच समय है से मापा जा सकता है । यदि दाता fluorophore झल्लाहट से अपनी ऊर्जा जारी कर सकते हैं, यह प्रतिदीप्ति जीवन भर के एक स्पष्ट छोटा में इस प्रतिस्पर्धा की प्रक्रिया परिणाम । यह FLIM7,8द्वारा मापा जा सकता है । लाइफटाइम झल्लाहट और अधिक मजबूत है दो अलग अणुओं के बीच बातचीत को मापने के लिए ratiometric झल्लाहट से, के रूप में प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक fluorophore की एक आंतरिक संपत्ति है और अपनी एकाग्रता के प्रति असंवेदनशील है । इसके अलावा, झल्लाहट संनिकटन मात्रा से है, क्योंकि झल्लाहट की क्षमता व्युत्क्रम दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores के बीच की दूरी की छठी शक्ति के लिए आनुपातिक है (मूलतः एक कदम समारोह) । इसलिए, फिटिंग द्वारा प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक डबल घटक क्षय मॉडल के साथ FLIM द्वारा दर्ज की गई हिस्टोग्राम, झल्लाहट-FLIM जाल जटिल गठन में लगे अणुओं के अंश के (अर्द्ध) मात्रात्मक आकलन के लिए अनुमति देता है5.
हाल ही में इस झल्लाहट-FLIM विधि का इस्तेमाल Verboogen एट अल ने किया था. प्रतिरक्षा प्रणाली के प्राथमिक वृक्ष कोशिकाओं में जाल जटिल गठन की कल्पना5. यह दिखाया गया है कि एक रोगजनक उत्तेजना का सामना करने पर, वृक्ष कोशिकाओं को उनकी झिल्ली आर-जाल पुटिका-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) 3 के साथ एक वृद्धि हुई जटिल के साथ अवैध रूप से re-जाल syntaxin 4 में विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली । इस वृद्धि हुई जाल जटिल गठन की संभावना interleukin-65जैसे भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव के लिए वृद्धि हुई स्रावी क्षमता को पूरा करने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक दृश्य के लिए झल्लाहट-FLIM डेटा के अधिग्रहण के लिए आवश्यक कदम और (अर्द्ध) जाल परिसरों की मात्रात्मक माप का वर्णन ।यह समझाया गया है कि कैसे पूरे सेल प्रतिदीप्ति जीवन भर मोनो और द्वि-घातीय क्षय कार्यों के साथ फिट करने के लिए, एक मात्रात्मक अनुमान के रूप में स्पष्ट प्रतिदीप्ति जीवनकाल में जिसके परिणामस्वरूप बातचीत जाल । इस प्रोटोकॉल में, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हेला सेल लाइन एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन विधि आसानी से अंय युकेरियोटिक कोशिकाओं में जाल परिसर का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील संलयन प्रोटीन (NSF) अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन झिल्ली की तस्करी के लिए महत्वपूर्ण हैं, के रूप में वे युकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर झिल्ली संलयन उत्प्रेरित । जाल प्रोटीन परिवार के बारे में ३६ विभिंन सदस्यों के होते हैं । विशिष्ट intracellular परिवहन मार्गों 3 या 4 के विशिष्ट सेट से catalyzed कर रहे हैं जाल प्रोटीन कि जिससे विशिष्टता और झिल्ली की तस्करी के प्रति निष्ठा में योगदान । हालांकि, जाल प्रोटीन की सटीक समारोह का अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि उच्च प्रचुर मात्रा में है और कार्यात्मक रूप से बेमानी, कई और अतिव्यापी कार्यों होने जाल के साथ । इस प्रोटोकॉल में, लाइव कोशिकाओं में जाल जटिल गठन के दृश्य के लिए एक नई विधि वर्णित है । इस विधि को व्यक्त करने पर आधारित है जाल प्रोटीन सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े और Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) को रोजगार से उनकी बातचीत को मापने । एक multicomponent क्षय मॉडल के साथ प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम फिटिंग करके, झल्लाहट-FLIM अलग बुलबुले में जाल जटिल गठन के अंश का (अर्द्ध) मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्लाज्मा झिल्ली में और स्तनधारी सेल लाइनों और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में endosomal डिब्बों पर जाल जटिल गठन कल्पना करने के लिए लागू किया गया है, और आसानी से अन्य organelles में जाल कार्यों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है पशु, संयंत्र, और कवक कोशिकाओं ।

झल्लाहट-FLIM द्वारा जाल बातचीत को मापने के लिए परख की तर्क चित्रा 1में दिखाया गया है । सी-टर्मिनी के transmembrane helices के cognate जाल प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए जुड़े हुए है वर्णक्रम में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदा, mCitrine और mCherry) स्थानांतरित कर दिया । एक सीआईएसके गठन-इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक दूसरे को और झल्लाहट के लिए तुरंत झकझोरता बनने में झिल्ली संलयन परिणाम पर जाल जटिल । चित्रा 2 हेला कोशिकाओं के प्रतिनिधि फोकल छवियों फ्लोरोसेंट-लेबल जाल प्रोटीन व्यक्त दिखाता है । दिखाया एक सेल syntaxin व्यक्त कर रहे है 4-mCitrine (दाता fluorophore) के साथ VAMP3-mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore), के रूप में अच्छी तरह के रूप में केवल syntaxin 4-mCitrine का निर्माण (दाता ही, कोई झल्लाहट) व्यक्त कोशिकाओं के नियंत्रण की शर्तों और syntaxin 3 दोनों से जुड़े mCitrine और मिलकर में mCherry (अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । चित्रा 3 के साथ प्रतिदीप्ति जीवन भर और FLIM मोनो के साथ प्रत्येक पिक्सेल के जीवन भर के हिस्टोग्राम फिटिंग द्वारा उत्पंन छवियां दिखाता है घातीय क्षय कार्य (आंकड़ा3ए-बी) और द्वि-घातीय क्षय कार्य ( चित्र 3 सी - घ). चित्रा 4a हमारे सेटअप के IRF से पता चलता है एक खुर्दबीन कवर ग्लास के पीछे बिखरने से मापा । चित्रा 4B-ईमें, पूरे सेल FLIM विश्लेषण के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति जीवन भर के हिस्टोग्राम के साथ साथ फिट curves मोनो-घातीय क्षय कार्यों के लिए दिखाया जाता है । चित्रा 4F एक फ्लोरोसेंट जीवनकाल एक प्रयोग के हिस्टोग्राम दिखाता है भी माइक्रोस्कोप कवर कांच की सतह के करीब, एक प्रमुख प्रतिबिंब चोटी में जिसके परिणामस्वरूप । चित्रा 4g एक द्वि-घातीय क्षय समारोह के साथ प्रतिनिधि फिट के साथ एक जीवनकाल हिस्टोग्राम दिखाता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
चित्रा 1: झल्लाहट से जाल परिसरों visualizing के लिए तर्क की योजना है । (क) के संरचनात्मक मॉडल के ंयूरॉन जाल (प्रोटीन डाटाबेस 3HD717) पुटिका-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) 2 (नीला; R), syntaxin 1 (लाल; क्यूए-जाल), और SNAP25 (हरा; दोनों एक Qb और Qc-जाल आकृति) शामिल हैं । syntaxin-1 के transmembrane कुण्डली के सी-टर्मिनस को संयुग्मित से mCitrine (दाता fluorophore; प्रोटीन डाटाबेस 3DQ118) है । VAMP2 के transmembrane कुण्डली के सी-टर्मिनस को संयुग्मित mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore; प्रोटीन डाटाबेस 2H5Q19) है । (ख) झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप जाल मध्यस्थता झिल्ली संलयन की योजना है । एक सीआईएस-जाल परिसर के गठन से झिल्ली संलयन के बाद, जाल तुरंत झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप एक दूसरे के लिए झकझोरता हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े जाल प्रोटीन की अभिव्यक्ति. पहला कॉलम: दाता fluorophore, ५१६ एनएम पर उत्तेजित । दूसरा कॉलम: स्वीकारकर्ता fluorophore, ६१० एनएम पर उत्तेजित । (क) दाता ही हालत. syntaxin 4-mCitrine (दाता fluorophore, हेला में हरा) के प्रतिनिधि का फोकल इमेज । स्वीकारकर्ता चैनल (द्वितीय स्तंभ) प्रतिदीप्ति क्रॉस-टॉक दिखाता है. (B) नकारात्मक नियंत्रण (कोई झल्लाहट नहीं) । दोनों syntaxin 4-mCitrine के साथ VAMP3-mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore, मर्ज में रानी) के साथ व्यक्त एक हेला सेल की प्रतिनिधि फोकल छवि । (ग) सकारात्मक नियंत्रण (अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । syntaxin 3-mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण की एक हेला सेल व्यक्त की प्रतिनिधि फोकल छवि । ध्यान दें कि mCitrine और mCherry संकेतों के प्रतिदीप्ति संकेत पूरी तरह से ओवरलैप नहीं करता है, mCitrine की एक कम प्रतिरोध की संभावना लाइसोसोमल की तुलना में mCherry गिरावट के लिए (चर्चा अनुभाग देखें). BF: ब्राइट फील्ड. स्केल बार्स, 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
चित्रा 3: जाल जटिल गठन के FLIM छवियों । (A) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति चित्रा 2में दिखाया गया कोशिकाओं की लाइफटाइम छवियां । छवियों पहले फोटॉन एक TCSPC प्रणाली (. pt3) द्वारा छवि cytometry मानक (. आईसीएस) PT32ICS सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दर्ज अंश परिवर्तित द्वारा उत्पंन किया गया । एकल पिक्सेल लगे प्रतिदीप्ति लाइफटाइम छवियां तो TRI2 सॉफ्टवेयर12,15-100% तीव्रता, 7 पिक्सेल परिपत्र बिन्नी और monoexponential फिटिंग एल्गोरिथ्म (Marquardt) से थ्रेसहोल्ड के साथ13 का उपयोग कर उत्पंन किया गया । रंग औसत स्पष्ट फ्लोरोसेंट जीवन भर इंगित करता है । (ख) FLIM छवियां जहां प्रतिदीप्ति लाइफटाइम छवियां (पैनल ए में दिखाया गया है) mCitrine दाता fluorophore के प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ जटिल थे ( चित्रा 2में दिखाया गया है) । कनवल्शनफ़िल्टर्स एक कस्टम-निर्मित मैक्रो का उपयोग ImageJ फिजी के साथ किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें). (ग) प्रतिदीप्ति लाइफटाइम और हेला सेल के FLIM छवियों दोनों syntaxin 4-mCitrine और VAMP3-mCherry से एक-बी पैनलों, लेकिन अब द्वि-घातीय क्षय curves के साथ फिटिंग के साथ (नियंत्रण की स्थिति के लिए तय जीवन भर के साथ; देखें ४.४ चरण में प्रोटोकॉल) । पिक्सेल रंग VAMP3 (समीकरण 3) के साथ जटिल में syntaxin 4 के अनुमानित अंशों को F इंगित करते हैं । (D) पैनल B के समान, लेकिन द्वि-घातांक फ़िट के लिए । कनवल्शनफ़िल्टर्स एक कस्टम-निर्मित मैक्रो का उपयोग ImageJ फिजी के साथ किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
चित्रा 4: पूरे सेल FLIM विश्लेषण । (क) सेटअप का इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (IRF) । IRF गिलास पानी अंतरफलक पर पीछे बिखरने का उपयोग कर मापा गया था (एक साफ कांच माइक्रोस्कोपी पानी युक्त पकवान का उपयोग) ।(ख-ङ) चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाए गए कक्षों के लिए पूरे सेल जीवनकाल हिस्टोग्राम । छवियों में उपस्थित सभी फोटॉनों को परित किया गया । curves IRF के साथ deconvoluted और मोनो-घातीय क्षय कार्यों (समीकरण 1) के साथ सज्जित थे. इन कक्षों के लिए, प्रतिदीप्ति जंमों २.८२ एनएस (केवल syntaxin 4-mCitrine; दाता केवल; पैनल बी), २.०९ एनएस (कोशिकाओं सह व्यक्त syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry; पैनल सी के साथ), और २.०८ एन एस (कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए प्राप्त किया गया syntaxin 3- mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण; अधिकतम उंमीद झल्लाहट नियंत्रण; पैनल डी) । inlays एक ही रेखांकन दिखाने के लिए, लेकिन अब y-अक्ष के लघुगणकीय स्केलिंग के साथ । पैनल ई पैनलों बी डी के क्षय curves के एक ओवरले से पता चलता है । (च) एक फ्लोरोसेंट जीवनकाल हिस्टोग्राम का उदाहरण भी माइक्रोस्कोप कवर स्लिप की सतह के करीब दर्ज की गई । एक बड़े प्रतिबिंब चोटी में यह परिणाम (पीला छायांकित क्षेत्र द्वारा चित्रित) । (G) पैनल सी के रूप में ही, लेकिन अब एक द्वि-घातीय नियंत्रण शर्तों के लिए तय जंमों के साथ क्षय वक्र के साथ फिटिंग (प्रोटोकॉल में ४.४ कदम देखें) । तेजी के आयाम (एक1) और धीमी गति से (एक2) घटक १४.४२ और ०.०१, क्रमशः थे, ०.९९ (समीकरण 3) के जटिल एफ में जाल के एक अनुमानित अंश में जिसके परिणामस्वरूप । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
अनुपूरक फाइल 1. फ़ंक्शन फ़ाइल FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
अनुपूरक फाइल 2. फ़ंक्शन फ़ाइल FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

इस प्रोटोकॉल जाल प्रोटीन के जटिल गठन के मात्रात्मक दृश्य के लिए अनुमति देता है एक नई विधि का वर्णन, Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के आधार पर, और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी.

प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualizing Intracellular जाल ्े

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

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