Name: visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана Ипатия стипендий от Медицинский центр университета Radboud, премию развития карьеры от человека пограничной науки программы, программы 2013 гравитации из Нидерландской организации научных исследований (НВО; ICI-024.002.009), ВиДи грант от НВО (ALW ВиДи 864.14.001) и начиная с Грант от Европейского совета научных исследований (ERC) под седьмой рамочной программы Европейского союза (Грант соглашения номер 336479).

<ol>
	<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion.">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li><li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+and+traffic.">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li><li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion.">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li><li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking.">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), 1543-1559 (2009).</li><li>Verboogen, D. R. J., Gonz&#225;lez Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation.">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dance+of+the+SNAREs:+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses.">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+pixel+kinetic+data+analysis+for+FRET+detection+by+multi-photon+time-domain+FLIM.">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).</li><li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Biosensor F&#246;rster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li><li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane.">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li><li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift.">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li><li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits.">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li><li>Veale, K. J., Offenh&#228;user, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4/SNAP23+mediates+adhesion,+cell+spreading+and+persistent+migration.">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li><li>G&#243;mez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells.">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Этот протокол демонстрирует использование ладу-FLIM для визуализации SNARE взаимодействий между Синтаксин 4 и VAMP3 в живых клеток HeLa. Синтаксин 4 — это белок Qa-ЛОВУШКУ, преимущественно местонахождения на плазматической мембраны, где он опосредует экзоцитоз1,2,,2021. VAMP3 является Р-ЛОВУШКУ, которая главным образом описал найти на рециркуляции от англ отсеков и опосредует людьми в других endosomes, а также плазматической мембраны1,2,20. Однако Лада-FLIM assay можно легко адаптировать для изучения других белков SNARE. Единственным условием является, что эти ловушки содержат C-терминал трансмембранного спирали, что характерно для большинства белков SNARE далеко1,2. Кроме того протокол, описанные здесь могут быть адаптированы для визуализации SNARE комплексов в любой тип эукариотических клеток, включая растения и дрожжей. В этом протоколе мы использовали сокращение флуоресценции жизни Флюорофор доноров как мера ладу. Как дополнительный подход жизни акцепторной Флюорофор могли бы быть изучены, которая обеспечивает недвусмысленное доказательство что резонанс передача энергии происходит потому что сенсибилизированных излучение вызывает собственный рост фаза.
В настоящее время лад-FLIM техника может быть не способны визуализировать SNARE комплексов в лизосомальных отсеках. Для конструкции 3-mCitrine-mCherry тандем Синтаксин флуоресценции mCherry часто можно найти более накопленных в районе juxtanuclear, который вероятно соответствует лизосомальных отсеков, в то время как mCitrine сигнал более обильны в сотовых периферии5. Аналогичные juxtanuclear накопление mCherry, по сравнению с mCitrine было отмечено, когда же белки SNARE, сливается с этим флуоресцентные белки были совместно выразили5. Лизосомы, характеризуются чрезвычайно низкий рН (&#60; 4) и высокая активность протеолитических ферментов. Накопление juxtanuclear mCherry скорее всего вызвана высоким сопротивлением mCherry Флюорофор лизосомальных деградации, по сравнению с mCitrine Флюорофор. Это не благодаря рН закалки mCitrine, как juxtanuclear накопление mCherry также происходит после фиксации клетки5. Таким образом метод ладу-FLIM недооценивает количество лад в регионах (лизосомальных) juxtanuclear и это потребует других флуоресцентные репортер белков, которые выжить в суровых условиях в пределах люмен лизосом.
ЛАД-FLIM в принципе позволяет получить (полу-) количественная оценка доли ловушки в комплексе5. Как мы объясняли в настоящем Протоколе, это требует установку жизни гистограмм флуоресцирования с двойной экспоненциальный распад функции (уравнение 2), где быстрые компонента пропорциональна амплитуде на долю ловушки в комплексе ( Уравнение 3). Однако такие установки с 2 компонентная модель является технически сложным. Установки с несколькими параметрами бесплатно подходят (две жизни флуоресценции и два амплитуд) требует очень большое количество фотонов, особенно поскольку параметры будут влиять друг на друга и небольшие ошибки в жизни будет влиять на амплитуд и вице- VERSA. Для преодоления этих проблем установки, флуоресценции продолжительностей жизни медленно компонента могут быть установлены для жизни доноров единственное условие (т.е., не МУЧИТЬ; только mCitrine настоящее время) и что быстро компонента жизни тандем построить ( Максимальная ожидаемого лад). Однако это должно также интерпретировать с осторожностью, потому что флуоресценции продолжительностей жизни не могут же, как и эти управления государства и может отличаться из-за нескольких причин (самостоятельно закалки, ориентацию диполя, вариации в микроокружения). Несколько комплексов SNARE в непосредственной близости (&#60; 10 Нм) может результат в расстояни зависимая ладу, тот же принцип, что позволяет лад для использования в качестве «молекулярная правитель», но в этом случае, скрывает количественная оценка SNARE комплексов. Кроме того количественная оценка не всегда имеет смысл, потому что помечены сковывания конкурировать с ловушки эндогенные (без метки). Как следствие уровень экспрессии mCherry меченых SNARE является основным фактором, определяющим для процент ладу5. Из-за всех этих оговорок рекомендуется подогнать флуоресцентные жизни гистограммы с функцией моно экспоненциальный распад (уравнение 1). Это имеет то преимущество, что она не требует каких-либо априорных знаний продолжительностей жизни и результате очевидной средняя флуоресцентные жизни обеспечивает Твердомеры для SNARE комплексообразующие5.
Тем не менее ожидается, что количественные ладу-FLIM изображений двухкомпонентные установки моделей будет иметь мощный будущих приложений. Силки кодирование генов в хромосоме могут сливается с репортер флуоресцентные белки, например, ТРИФОСФАТЫ/CAS9. Это приводит к люминесцентные маркировки эндогенного SNARE белков, с уровня эндогенного белка и никакую предпосылку немеченого ловушки и таким образом позволяет для значимого количественной оценки доли SNARE комплексов ладу-FLIM. В то время как выражение уровня эндогенного ловушки может быть довольно низким и дать относительно низкой флуоресцентные сигналов, ожидается, что может быть получено достаточное количество фотонов, особенно для всей ячейки FLIM (который требует лишь несколько 1000 фотонов). Кроме того эти ладу-FLIM измерения могут быть выполнены с более чувствительным лавинный фотодиод детекторов, которые приведет также к выше флуоресценции сигналов и лучше Фотон статистики.

Торговля людьми мембраны является центральным элементом эукариотических клеток, где мембрана везикулы бутон от от доноров органелл и затем перейти к и предохранитель с целевой органеллы1,2. За исключением митохондрий все эти шаги фьюжн мембраны катализируемые членов SNARE белка семьи1,2. Белка семьи SNARE состоит из около 36 членов в mammalian клетках и около 20 членов в дрожжи2. Силки протеины содержат один или два ~ 52 остатков Лонг, изначально неструктурированных регионов, называемый SNARE-мотивы. Силки белки часто привязаны к мембраны трансмембранного спирали1,C-терминала2. Ловушки могут быть классифицированы на основании Центральной остатков, которые они вносят вклад в сложный ЛОВУШКУ в аргинин (R) и глютамин (Q) ловушки1,2. Мембрана фьюжн управляется взаимодействия 3 или 4 родственных ловушки, которые вместе способствовать 4 SNARE-мотивы и распространяются через доноров и акцепторов мембраны1,2. Силки комплекс состоит из одного мотива Р-ловушки и три Q-SNARE мотивы (называемых Qa, Qb и КК). Сложные образования начинается в N-Термини SNARE-мотивы, образуя так называемые транс-Силки-комплекс и приступает к C-Термини, образуя плотный α-винтовой биспиральных пакет называется СНГ-SNARE-комплекс. Комплекс формирования даже одну ЛОВУШКУ комплекс перетаскивает доноров и акцепторов мембраны вместе и преодолевает барьер для мембранных фьюжн3.
Назначение различных комплексов SNARE конкретных транспортных маршрутов в пределах клетки часто технически сложным. Хотя ловушки, несомненно, способствовать специфика мембраны людьми, они неразборчивый, функционально излишним, и их функции пересекаются1,2. Из-за этого возмущений эксперименты ориентации ловушек, таких как Нокаут гена, РНК-интерференция, введение блокирующих антител, или фрагментами растворимых SNARE, выступающей в качестве доминирующей негативы, часто не приводят к ясно фенотипов как другие Ловушки компенсировать2,4. Кроме того трудно дифференцировать конкретные мембраны фьюжн шаги от вверх по течению оборота событий, потому что ловушки могут быть вовлечены в нескольких транспортных маршрутов2. Локализация исследования сковывания микроскопии подходы, с помощью immunolabeling или генетических фьюжн репортер флуоресцентные белки, страдают от проблем, что: (i) ловушки найти несколько органеллы как они часто посредником несколькими людьми шаги и (ii) их локализации не означает автоматически, что функционально они участвуют в формировании комплекса SNARE. Наконец SNARE комплексы могут быть идентифицированы с помощью иммунопреципитации эксперименты с использованием одной из ловушки как приманку и другие ловушки как цели, но это не позволяет назначение этих комплексов для определенных органелл или маршруты незаконного оборота. Таким образом в настоящее время существует не альтернативный метод для визуализации SNARE комплексы с organellar резолюции. Иммунофлюоресценции не может доказать SNARE взаимодействий, но может показать только наличие или отсутствие совместного локализации, а иммунопреципитации только может показать SNARE взаимодействий в целом клеток населения, но не назначить органеллы где эти частотными.
Чтобы преодолеть эти ограничения, Роман метод, позволяющий для количественного визуализации SNARE комплексов в живых клеток с organellar резолюции недавно был разработан Verboogen и др. 5 этот метод основан на выражение пар ловушки с спектрально смещенные флуоресцентных белков, C-неизлечимо сливается с их трансмембранных спиралей. После завершения синтеза мембранных и формирования СНГ-Поймайте комплекс, эти флуорофоров на C-Термини трансмембранных спиралей немедленно сопоставленные друг другу. Флуорофоров, затем хорошо в пределах расстояния Фёрстер (обычно &#60; 5 Нм), что привело в ладу Флюорофор Грин смещается доноров в красно смещается акцепторной Флюорофор5,6. ЛАДУ результаты закалки Флюорофор доноров и увеличение выбросов акцепторной Флюорофор, которая может быть измерена по соотношению доноров и акцепторов выбросов (ratiometric лад). Однако ratiometric ладу между двух различных молекул является сложной задачей, из-за кросс talk и различные уровни флуоресценции доноров и акцепторов ловушки на различные органеллы и среди клеток7,8. ЛАДУ могут также быть измерены от флуоресценции жизни, который является время между возбуждением и излучение фотонов. Если Флюорофор доноров может освободить свою энергию на ладу, этот конкурирующих результат процесса в явное сокращение жизни флуоресценции. Это может быть измерен FLIM7,8. Время существования ладу гораздо более надежными, чем ratiometric ладу для измерения взаимодействий между двух различных молекул, как флуоресценции жизни является неотъемлемой собственностью Флюорофор и нечувствительна к его концентрации. Кроме того Лада является приближение количественных, потому что эффективность ладу обратно пропорциональна шестой силу расстояние между доноров и акцепторов флуорофоров (по существу функция шаг). Таким образом путем установки флуоресценции жизни гистограммы зарегистрированных FLIM с моделью двухкомпонентных распада, Лада-FLIM позволяет для (полу-) количественной оценки доли SNARE молекул, участвующих в ЛОВУШКУ комплекс формирования5.
Недавно этот лад-FLIM метод был использован, Verboogen и др. для визуализации сложных формирования SNARE в первичной дендритных клеток иммунной системы5. Было показано, что при обнаружении патогенных стимул, дендритные клетки перенаправлять их мембраны торговли сопровождается повышенной комплексообразующие Р-ловушки связанные везикул мембранных белков (VAMP) 3 с Синтаксин Qa-SNARE 4 специально на плазматической мембраны. Скорее всего это повышенное образование сложных SNARE требуется для удовлетворения повышенной секреторной потенциала секрецию воспалительных цитокинов, таких как интерлейкина-65. Этот протокол описывает экспериментальные шаги, необходимые для приобретения ладу-FLIM данных для визуализации и (полу-) количественные измерения SNARE комплексов.Это объясняется как подходят поклеточного флуоресценции жизни гистограммы с моно - и Би экспоненциальный распад функций, что приводит к очевидным флуоресценции жизни как количественную оценку SNARE взаимодействий. В этом протоколе линия широко используемых клетки HeLa используется в качестве примера, но метод может быть легко расширен для изучения SNARE комплексов в других эукариотических клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Растворимые N- ethylmaleimide чувствительных фьюжн белка (NSF) вложение белка рецептора (SNARE) белки являются ключ для мембранных людьми, как они катализируют мембраны фьюжн в эукариотических клеток. Белка семьи SNARE состоит из около 36 различных членов. Конкретные внутриклеточных транспортных маршрутов катализируемые конкретные наборы 3 или 4 SNARE белков, которые таким образом способствуют специфика и верности оборота мембраны. Однако изучая точное предназначение SNARE белков является технически сложной задачей, потому, что ловушки очень обильные и функционально излишним, с большинство ловушек, имея несколько и дублирование функций. В этом протоколе описан новый метод для визуализации сложных формирования SNARE в живых клеток. Этот метод основан на выражая SNARE белков C-неизлечимо сливается с флуоресцентных белков и измерения их взаимодействие энергии резонанса Фёрстер передачи (ЛАДА) нанимающей флуоресценции жизни изображений микроскопии (FLIM). Путем установки жизни гистограмм флуоресцирования с моделью многокомпонентных распада, Лада-FLIM позволяет (полу-) количественной оценки доли SNARE комплекс формирования на различных везикулы. Этот протокол успешно применяется для визуализации SNARE комплекс формирования на плазматической мембраны и от англ отсеков в mammalian клетки линии и первичных иммунных клеток и может быть легко расширен для изучения функции ловушки на другие органеллы в животных, растений и грибковых клеток.

Обоснование анализа для измерения SNARE взаимодействий на ладу-FLIM показан на рисунке 1. C-Термини трансмембранных спиралей родственных белков SNARE сплавлены к паре спектрально смещенные флуоресцентных белков (например, mCitrine и mCherry). Формирование СНГ-Поймайте комплекс мембраны слияние результатов в этих флуоресцентных белков, сразу же становится сопоставленные друг другу и ладу. Рисунок 2 показывает представитель конфокальный изображения клетки HeLa, выражая дневно меченых SNARE белков. Показано выражают ячейки Синтаксин 4-mCitrine (доноров Флюорофор) с VAMP3-mCherry (акцепторной Флюорофор), а также контролировать условия клеток, выражая только Синтаксин 4-mCitrine конструкция (только доноров; не ладу) и Синтаксин 3 сливается с обеих mCitrine и mCherry в тандеме (максимальным ожидаемым лад). Рисунок 3 показывает, сопровождающих флуоресценции жизни и FLIM изображения, созданные на установку гистограммы жизни каждого пикселя с моно экспоненциальный распад функции (рис. 3A–B) и (Би экспоненциальный распад функции Рисунок 3 c - D). рисунке 4A показано МАФ нашей установки измеряется обратно рассеяния крышки стекла микроскопа. В рисунке 4В–E, представитель флуоресценции гистограммы жизни всей ячейки FLIM анализ вместе с сопроводительными подходят показаны кривые для моно экспоненциальный распад функции. Рисунок 4F показана гистограмма флуоресцентный жизни эксперимента образ слишком близко к поверхности покрытия стекла микроскопа, результате видно отражение пика. Рисунок 4 g показывает гистограмму жизни с представителем подходят с функцией Би экспоненциальный распад.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Рисунок 1: схема обоснования для визуализации SNARE комплексы лад. (A) структурная модель нейрональных ловушки (белок базы данных 3HD717) связанные везикул мембранных белков (VAMP) 2 (синий; R), Синтаксин 1 (красная; Qa-SNARE) и SNAP25 (зеленый; содержит как мотив Qb - и Qc-SNARE). C-конечная трансмембранного спирали Синтаксин-1 конъюгированных с mCitrine (Флюорофор доноров; белка базы данных 3DQ118). C-конечная трансмембранного спирали VAMP2 конъюгированных с mCherry (акцепторной Флюорофор; белка базы данных 2H5Q19). (B) схемы SNARE при посредничестве мембраны фьюжн, что приводит к ладу. После сплавливания мембраны путем формирования СНГ-ловушки, Силки комплекс немедленно сопоставленные друг с другом, что приводит к ладу. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Рисунок 2: выражение SNARE белков сливается с флуоресцентные белки. Первый столбец: Флюорофор доноров, возбужденных в 516 Нм. Второй столбец: акцепторной Флюорофор, возбужденного в 610 Нм. (A) доноров только условие. Представитель конфокальное изображение НеЬа клетки, выражая Синтаксин 4-mCitrine (Флюорофор доноров; зеленый слияния). Акцептор канал (вторая колонка) показывает флуоресценции кросс talk. (B) отрицательный контроль (не беспокоить). Представитель конфокальное изображение НеЬа клетки, выражая оба Синтаксин 4-mCitrine с VAMP3-mCherry (акцепторной Флюорофор; пурпурный слияния). (C) положительный контроль (максимальным ожидаемым лад). Представитель конфокальное изображение клетки HeLa, выражая тандем 3-mCitrine-mCherry Синтаксин построить. Обратите внимание, что сигнал флуоресценции mCitrine и mCherry сигналов, делает не полностью перекрываются, вероятно, из-за снижения сопротивления mCitrine лизосомальных деградации, по сравнению с mCherry (см. раздел "обсуждение"). BF: поле и ярко. Масштаб баров, 20 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Рисунок 3: FLIM изображения комплекс формирования SNARE. (A) представитель флуоресценции образы жизни клеток, показано на рисунке 2. Изображения были получены путем преобразования следы фотон, Записанная системой TCSPC (.pt3) для изображения цитометрии стандарт (.ics) с помощью программного обеспечения PT32ICS. Пиксель установлены флуоресценции жизни, генерации изображения были затем использование TRI2 программного обеспечения12,13 с порога от 15-100% интенсивности, 7 пикселей круговой биннинга и monoexponential применении алгоритма (Марквардт). Цвет показывает средний очевидной флуоресцентные жизни. (B) FLIM изображения, где образы жизни флуоресцирования (показано в группе A) были замысловатого с интенсивностью флюоресценции mCitrine доноров Флюорофор (показано на рис. 2). Свертка была выполнена с ImageJ Фиджи с помощью макроса на заказ (см. Таблицу материалы). (C) флуоресценции жизни и FLIM изображения клетки HeLa, выражая Синтаксин 4-mCitrine и VAMP3-mCherry от групп A-B, но теперь с установку с Би экспоненциальный распад кривых (с продолжительностей жизни, крепится к условиям управления; см. шаг 4.4 в протокол). Пиксель цвета указывают оценкам фракций F Синтаксин 4 в комплексе с VAMP3 (уравнение 3). (D) так же, как группа B, но для Би экспоненциальный подходят. Свертка была выполнена с ImageJ Фиджи с помощью макроса на заказ (см. Таблицу материалы). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Рисунок 4: вся ячейка анализ FLIM. (A) Функция реагирования инструмент (МАФ) установки. МАФ была измерена с помощью обратно рассеяние на интерфейсе стекла воды (с помощью микроскопии чистую стеклянную посуду, содержащих воду).(EB–) Все ячейки жизни гистограммы для клетки, показано на рисунке 2 и на рисунке 3. Все Фотоны присутствует в образы, были объединены. Кривые были deconvoluted с МАФ и оснащены функциями моно экспоненциальный распад (уравнение 1). Для этих клеток, флуоресценции продолжительностей жизни были получены из 2.82 ns (клетки, выражая только Синтаксин 4-mCitrine; доноров только группы B), 2.09 ns (клетки совместно выражая Синтаксин 4-mCitrine с VAMP3-mCherry; панель C) и 2,08 ns (клетки, выражая Синтаксин 3 - mCitrine-mCherry тандем построить; Максимальная ожидаемого ладу управления; Группа D). Вставками показывают же графики, но теперь с логарифмической шкале по оси y. Группа E показывает оверлей распада кривых панелей B-D. (F) пример гистограммы флуоресцентные жизни записал слишком близко к поверхности скольжения обложки микроскопа. Это приводит к большой отражение пик (изображен желтый затененной области). (G) так же, как Группа C, но теперь установку с Би экспоненциальный распад кривой с продолжительностей жизни фиксированной к условиям управления (см. шаг 4.4 в протоколе). Амплитуды быстрый (1A) и медленной (2A) компоненты были 14.42 и 0.01, соответственно, что приводит к оценкам доля ловушки в сложных F 0,99 (уравнение 3). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Дополнительный файл 1. Функцию файл FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 2. Функцию файл FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Этот протокол описывает новый метод, позволяющий для количественного визуализации сложных формирования SNARE белков, основанный на передачи энергии резонанса Фёрстер и флуоресценции жизни изображений микроскопии.

Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Визуализация и количественной оценки внутриклеточного Взаимодействия Neisseria meningitidis И правам α-актинина по конфокальной микроскопии

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Микроволновая печь Assisted экспресс-диагностики болезней растений Вирус помощью просвечивающей электронной микроскопии

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Открытие новых внутриклеточных патогенов на Amoebal сокультивирования и подходов Amoebal обогащению

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Анализ<em&gt; Yersinia энтероколитные</em&gt; Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Неинвазивная<em&gt; In Vivo</em&gt; Флуоресцентная оптическая визуализация воспалительной активности ММП с использованием активируемого флуоресцентного средства визуализации

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Мышиные лимфоцит Этикетировочное по<sup&gt; 64</sup&gt; Си-антитело к рецептору Ориентация на<em&gt; В Vivo</em&gt; Cell Торговля ПЭТ / КТ

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Интегрировать изображений проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование для оценки измененных Endocytic CD1d торговля

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...