Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

ونحن نشكر زملائنا لإجراء مناقشات مفيدة. ونشكر أيضا شليتشتينج إيلمي وبيتر كارل هوفنر لتوفير البروتين المجمعات. نحن نعترف بتمويل من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية، زيك برنامج، 03Z22HN22)، صناديق التنمية الإقليمية الأوروبية (عفر، ZS/2016/04/78115) وهالة-فيتنبرغ MLU شخص وتمويل من مؤسسة ويلكوم ترست (109854/658 Z/15/Z) إلى أ فب

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يتم توفير بروتوكولات للتحليل الهيكلي الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي لمجمعات البروتين وحدة فرعية متعددة. اثنين من التقنيات، المبينة في البروتوكول، معظمهم من تسليم النتائج التكميلية ومؤهلة جيدا لاكتساب نظرة ثاقبة الترتيبات الهيكلية داخل البروتين (-يجند) المجمعات التي يصعب من الدراسة من خلال تقنيات الهيكلية التقليدية. يسلم أصلي الكتلي ثاقبة ستويتشيوميتريس البروتين، فضلا عن تفاعلات البروتين بتحليل سوبكومبليكسيس ونماذج التفاعل مستقرة. العابرة للربط، من ناحية أخرى، تعطي معلومات عن مواقع الاتصال المباشر. اعتماداً على كروسلينكير المستخدمة، درجة معينة من مرونة يمكن أو ينبغي أن تدرج في التحليل.
البروتوكولات المتوفرة عموما سهلة لتنفيذ ولا تستغرق وقتاً طويلاً. بروتوكول كامل يمكن تنفيذها في غضون أسبوع واحد، ويمكن تطبيقها على مجمعات البروتين كلها تقريبا، على الرغم من أن كمية معينة من البروتين المعقد مطلوب لنجاح التحليل. إعداد عينة بسيطة ولا تتطلب على وجه التحديد البروتين المنقي المجمعات. بيد أن مأزق مشترك واحد تلوث العينة أثناء إعداد العينات لتحديد البروتين الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي. وتشمل هذه الملوثات في معظم الحالات كراتين التي تنشأ من الغبار أو الجلد أو الشعر. ولذلك، الإضافية مثل ارتداء القفازات والمعاطف مختبر، فيلتراتينج المخازن المائية، واستخدام المذيبات عالية النقاء الحرص أثناء إعداد العينات لتحديد البروتين الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي. عادة ما يتم إدخال البروتينات تلويث الأخرى مثل المحرمين أثناء تنقية البروتين، مثلاً، عند استخدام العلامات تقارب. وفي هذه الحالات، تنقية البروتين ينبغي تحسين، على سبيل المثال عن طريق زيادة خطوات الغسيل. على أي حال، تحديد التلوث البروتين في العينة بسهولة أثناء البحث قاعدة البيانات بحذف عامل التصفية التصنيف (أيالبحث ضد البروتينات من جميع الأنواع). إلا إذا كان يلاحظ بعض الببتيدات (أي، على تغطية منخفضة بروتين يمكن الحصول عليها)، على الرغم من أن عينة كافية متوفرة، قد يكون من الضروري استخدام بروتيناز مختلفة أثناء الهضم. بشكل عام ينتج التربسين عددا كافياً من الببتيدات؛ ومع ذلك، في بعض الحالات مثل البروتينات الغشاء أو المجالات غشاء من البروتينات، هو تخفيض عدد مواقع الانقسام تريبتيك وانزيمات أخرى تستهدف مسعور الأحماض الأمينية أفضل خيار.
من حيث الأجهزة، مطلوب صك تم تعديل لا سيما الكتلي الأصلي الذي يحتفظ بتفاعلات غير التساهمية أثناء التحويل إلى الغاز-المرحلة. قد أدخلت العديد من أنواع الصك، بما في ذلك الصكوك Q ToF وأوربيتراب. بينما معدلة Q ToF مطيافات الشامل متوفرة تجارياً الكتلي الأصلية منذ عدة سنوات، إلا في الآونة الأخيرة وأدخلت هذا الأخير وفي معظم الحالات تتطلب التعديل المتخصصة45. ومع ذلك، تطبيق الصكوك ذات الدقة العالية يسمح بدراسة الربط يغاندس متعددة وعلى التقدير الكمي46،47 وواعدة بالنسبة للتطبيقات المستقبلية.
تحديد cross-linked di-الببتيدات من السائل إلى جانب اللوني الكتلي، يمكن تطبيق الإجراءات القياسية مع قليل من التعديلات. ومع ذلك، البحث قاعدة البيانات عاملاً يحد من البرمجيات المتخصصة يمكن نادراً ما تتعامل مع قواعد البيانات الكبيرة، وانخفاض قواعد البيانات التي تحتوي على وحدات البروتين من المجمعات مطلوبة. الدراسات الحديثة المستخدمة كروسلينكيرس قياس الطيف الكتلي كليفابل جماعية تستهدف تفاعلات البروتين في الخلية بأكملها ليساتيس48،49. استخدام كروسلينكيرس الكيميائية التي تجزئ في تجارب الكتلي جنبا إلى جنب معظمهم غلة الببتيدات الخطي (تعديل بواسطة كروسلينكير)، التي يمكن تحديدها بمزيد من التجزؤ وقاعدة بيانات البحث من الببتيدات الخطي، وهذا يقلل البحث في الزمان والمكان البحث الحاسوبية. ومع ذلك، لإجراء هذه التجارب، محلل شامل فخ أيون أو مطياف كتلة مختلطة مع اعتراض أيون مطلوب. بشكل عام، كما إيجابيات كاذبة مسألة هامة، أطياف الجماعية من الببتيدات cross-linked يتم غالباً التحقق من صحة يدوياً بنوعية هذه الأطياف جزء يمتد وقت تحليل البيانات هائلة. تطوير أنظمة التهديف قوية يمكن تطبيقها دون مزيد من خطوات التحقق من صحة ثم التطبيقات المستقبلية المحتملة. طريقة واحدة لتحسين تحليل البيانات، والحد من عدد إيجابيات كاذبة هو الأخذ بحسابات معدل اكتشاف كاذبة وتطبيقها على مجموعات البيانات50العابرة للربط.
وبصفة عامة، يمكن أن تستكمل الأساليب الموصوفة هنا مع مزيد من تقنيات الطيف الكتلي (مثلاً، التساهمي وسم) زيادة الناتج من التحليل. ويمكن بسهولة تنفيذ التعديلات والتحسينات البروتوكولات الأخرى. على هذا النحو المقارن العابرة للربط34 كشف النقاب عن التغييرات كونفورماشونال في الجمعية البروتين. مزيد من التطورات في أصلي الكتلي في الوقت الحاضر يسمح تحليل غشاء بروتينات51،52 وتفاعلاتها مع الدهون28،52،،من5354 . التطورات الجديدة من المطيافات أسلحة عالية الدقة لأصلي الكتلي قد مدد في التطبيق وملزم يجند، مثلاً، ملزمة للدهون لبروتينات الغشاء، والآن يمكن أن تدرج في التحليل45، 46-بالاقتران مع نهج النمذجة الحاسوبية، هذه التقنيات يمكن تسليم النماذج الهيكلية متفاوتة القرار55. إذا كانت لا توجد هياكل الكريستال متوفرة للوحدات الفرعية المعقدة أو واحدة سليمة، يمكن أن يحقق الكتلي الأولى ثاقبة تفاعلات البروتين والطوبولوجيا من المجمع غير معروف. اعتماداً على التقنيات المستخدمة والنتائج المحققة، نماذج منخفضة الدقة من المجمع غير معروف ويمكن الحصول على56،،من5758. إذا كانت تتوفر هياكل الكريستال أو نماذج التماثل، يمكن أن تسفر عن المعلومات الهيكلية التي وردت من الطيف الكتلي نماذج حتى قرب أصلي-59.
بالمقارنة مع غيرها من التقنيات الهيكلية، الطيف الكتلي مزية أن فإنه يتطلب كميات منخفضة عينة، فإنه يمكن التعامل مع العينات غير متجانسة ولا ينطبق على مجمعات البروتين من حجم غير محدود. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح الكتلي للتحقيق في نظم البروتين الحيوي. عادة ما يتم تحليل مختلف قطاعات السكان من البروتين أو البروتين المعقدة الموجودة في الحل معا وذلك، خلافا مع التقنيات الهيكلية الأخرى التي تتطلب الاختيار لفئات معينة من السكان، والتشكلات جميع الاحتفاظ بها خلال التحليل ويتم تقييمه في تجربة واحدة. النهج العابرة للربط الكمي قد أدخل مؤخرا34،،من6061 وتبشر بالخير للمستقبل تطبيقات تصف التغييرات conformational تحت ظروف مختلفة.

وأصبح التحقيق الهيكلية للتجميعات البروتين أهمية خاصة لفهم العمليات الخلوية. ونتيجة لذلك، العديد من تقنيات قد تم تطوير وتحسين في علم الأحياء الهيكلية1. ومع ذلك، هذه التقنيات في بعض الأحيان محدودة في تطبيقها بسبب الحجم أو المرونة أو عدم تجانس البروتين المجمعات قيد التحقيق. ويمكن التعامل مع هذه التحديات الكتلي، ولذلك، برز كأداة قوية في علم الأحياء الهيكلية2،3،،من45. أكبر ميزة الكتلي، غير أن القدرة على تحديد البروتينات حتى في الخلائط المعقدة وغير متجانسة6لا لبس فيه. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم عادة هضم البروتينات مع اندوبروتيناسيس والخليط الببتيد الناتجة مفصولة بواسطة كروماتوغرافيا سائلة والتيد مباشرة إلى مطياف كتلة. الببتيد الجماهير يتقرر فيما بعد والسلائف الأيونات يتم تحديدها من أجل مزيد من تجزؤ الببتيدات. ثم يتم تعريف البروتينات بواسطة الببتيد البحث والمناظرة بلغة الجماهير ضد قاعدة معروفة. لا يسمح هذا الإجراء تحديد الببتيدات/البروتينات ولكن أيضا على التعديلات بوستترانسلاشونال التي تسبب تحول شامل من الببتيدات السلائف والايونات جزء يحمل التعديل7. وتستند بعض تقنيات كثيرة في هيكلية الكتلي هذا المبدأ4،8. على سبيل المثال، وصف تقنيات مثل الهيدروجين الديوتريوم تبادل9،10،11،استراتيجيات وضع العلامات الكيميائية12، أو الهيدروكسيل جذرية القدم الطباعة13،14 ، تعطي أفكاراً في إمكانية الوصول إلى السطح من البروتينات في ظل ظروف معينة.
أسلوب آخر (الكيميائية) العابرة للربط التي تشمل الربط التساهمي من الأحماض الأمينية بالقرب من خلال مجموعات وظيفية. لهذا، هي الكواشف الكيميائية أو كواشف الأشعة فوق البنفسجية أكتيفاتابل الأحماض الأمينية العاملين15،16. بعد العابرة للربط، وعادة ما يتم تحلل البروتينات مع البروتياز و cross-linked di-الببتيدات يتم تحليلها بواسطة السائل إلى جانب اللوني الكتلي. ومع ذلك، يتطلب تحديد المنتجات العابرة للربط بقاعدة بيانات البحث، استخدام البرمجيات المتخصصة التي سلسلة الببتيد تسلسل مختلف البروتينات ومناطق متباينة17،،من1819. استخدام المواد الكيميائية كروسلينكيرس يتميز بأنه يمكن أن تستخدم لمجمع البروتين تقريبا كل الاهتمام ولا تتطلب إدماج أحماض الأمينية أكتيفاتابل الأشعة فوق البنفسجية، التي يمكن أن تتحقق فقط عند التعبير عن بروتين الفائدة في الخلايا المضيفة. على هذا النحو، العابرة للربط هو أداة مرنة واستخدمت بنجاح في العديد من الدراسات الهيكلية ل التجميعات البروتين كبيرة حتى20.
الكتلي من مجمعات البروتين سليمة (تسمى في بعض الأحيان 'أصلية' الطيف الكتلي)، من ناحية أخرى، ينطوي على تحليل البروتينات سليمة والبروتين المجمعات دون التحلل المائي في الببتيدات. أنها تكشف عن تشكيل وعدم التجانس، stoichiometry، الطوبولوجيا وفرعية لتفاعلات البروتين المجمعات،من21إلى22. في تركيبة مع التنقل أيون، يسمح الكتلي الأصلية زيادة العزم على تشكيل23،24. وهذا يجعلها أداة قوية للتحقيق الهيكلية للبروتين المجمعات التي يصعب تقييمها بالأساليب الهيكلية التقليدية. مع ذلك، يتطلب أصلي الكتلي تحليل المخازن المؤقتة التي تحافظ على تفاعلات البروتين غير التساهمية خلال التأين اليكتروسبراي. ويتم ذلك عادة باستخدام المخازن المؤقتة مائي، متقلبة مثل خلات الأمونيوم25. وباﻹضافة إلى ذلك، تعديلات أداة ضرورية لمنع الانفصال من خلال الانتقال إلى مرحلة الغاز مطياف كتلة26. يطبق في هذه الطريقة، حللت العديد من مجمعات البروتين (كبير). ومن أمثلة مثيرة للإعجاب الدراسات ريبوسوم سليمة27أو ATP سينثاسيس28أو29من الفيروسات.
مجموعة أصلية الطيف الكتلي والعابرة للربط نجاحا خاصة في الدراسات السابقة. على سبيل المثال، ستويتشيوميتريس المجمعات والوصيفة، بما في ذلك ديمر Hsp70 غير متوقع، يمكن الحصول عليها من تجارب الكتلي من المجمعات البروتين سليمة، بينما العابرة للربط الكيميائية كشفت عن ترتيبات للبروتينات في التجميعات30،31. وفي دراسة مختلفة، درست آثار التعديلات بوستترانسلاشونال على سليمة ATP synthase معقدة. قدمت أصلي الكتلي ثاقبة استقرار البروتينات المعقدة في وجود أو عدم وجود الفسفرة أو أسيتيليشن32،33. ثم كشف استراتيجية cross-linking مقارن34 التغييرات conformational من البروتين المعقدة ظروف مختلفة.
هنا، نحن نقدم البروتوكولات لتحديد البروتين الكتلي والعابرة للربط (المواد الكيميائية)، وأصلي الكتلي، بما في ذلك تحليل البيانات وتفسيرها (الشكل 1). المزيج من التكميلية النتائج المتحصل عليها من هذه الأساليب مع مساعدة مجمعين البروتين تتسم جيدا هو أظهر35. لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على أي تجميع البروتين الذي يمكن تنقيته في النقاء وتركيز معينة. النهج المتبع في بعض الحالات المحدودة بتحليل البيانات من البيانات، أيحجم قاعدة البيانات العابرة للربط يعمل، الذي يحدد مساحة البحث المطلوب والوقت. وباﻹضافة إلى ذلك، التحقق اليدوي من الصلات المحددة المطلوبة في كثير من الأحيان وكذلك يقلل من الإخراج. الكتلي الأصلية يقتصر معظمها نوعية العينة، مثلاً، ومخازن و adducts المستخدمة أثناء تنقية وإمكانية تبادل لهم من مخازن مائي ومتقلبة. ومع ذلك، قد مجمعات البروتين المنقي للتحليل الهيكلي عادة الجودة المطلوبة لتحليل ناجحة مع البروتوكولات لدينا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

تتفاعل البروتينات مع يغاندس على شكل الجمعيات نشاطا وحيوية والاضطلاع بمختلف الوظائف الخلوية. ولتوضيح هذه التفاعلات أمرا أساسيا لفهم العمليات الخلوية. ومع ذلك، العديد من البروتين المجمعات التجميعات الحيوية ولا يمكن الوصول إليها باستخدام تقنيات الهيكلية التقليدية. الكتلي يسهم في التحقيق الهيكلية لهذه الجمعيات، ولا سيما أن الجمع بين مختلف التقنيات الجماعية والمطيافيه يسلم قيمة ثاقبة على الترتيب الهيكلي.
في هذه المقالة، نحن وصف التطبيق ومزيج من اثنين من التقنيات والمطيافيه جماعية متكاملة، هي العابرة للربط الكيميائية مقترنة بالطيف الكتلي وأصلي الطيف الكتلي. العابرة للربط الكيميائي يشمل الربط التساهمي من الأحماض الأمينية بالقرب من باستخدام الكواشف الكيميائية. بعد الهضم مع البروتياز، cross-linked دي-الببتيدات يتم تحديدها بواسطة الطيف الكتلي والبروتين التفاعلات بين المواقع اكتشفت. الكتلي الأصلية من ناحية أخرى هو تحليل للتجميعات البروتين سليمة في مرحلة الغاز مطياف كتلة. فإنه يكشف عن البروتين ستويتشيوميتريس، فضلا عن تفاعلات البروتين ويجند. ولذلك تسليم كلا تقنيات المعلومات التكميلية في بنية البروتين-يجند التجميعات والجمع بينهما أثبت قوية في الدراسات السابقة.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

الهندسة المعمارية لمجمعات البروتين ضروري لوظيفتها. الجمع بين مختلف التقنيات الجماعية والمطيافيه أثبتت أنها قوية لدراسة تلك الجمعية. توفر البروتوكولات العابرة للربط الكيميائي وأصلي الكتلي، وتبين كيف أن هذه التقنيات التكميلية تساعد على توضيح بنية تجميعات فرعية متعددة البروتين.

الجمع بين المواد الكيميائية العابرة للربط والطيف الكتلي لمجمعات البروتين سليمة لدراسة الهندسة المعمارية لتجميعات فرعية متعددة البروتين

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...