Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Vi takker vores kolleger for nyttige diskussioner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for at give proteinkomplekser. Vi anerkender støtte fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning (BMBF, ZIK programmet, 03Z22HN22), den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRE, ZS/2016/04/78115) og MLU Halle-Wittenberg C.S. og finansiering fra the Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) at A.P.

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Protokoller leveres til massespektrometri-baseret strukturel analyse af multi subunit proteinkomplekser. De to teknikker, beskrevet i protokollen, for det meste levere supplerende resultater og er velegnet til at få indsigt i de strukturelle ordninger inden for protein (-ligand) komplekser, som er vanskelige at studere af konventionelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri leverer indblik i protein stoichiometries samt protein interaktioner ved at analysere subcomplexes og stabil interaktion moduler. Cross-Linking, på den anden side giver oplysninger om direkte kontakt websteder. Afhængigt af tværs linker anvendes en vis fleksibilitet kan eller bør indgå i analysen.
De angivne protokoller er generelt nemme at udføre og ikke tidskrævende. Hele protokollen kan udføres inden for en uge og kan anvendes på næsten alle proteinkomplekser, selv om en vis mængde af protein kompleks er nødvendige for vellykket analyse. Forberedelse af prøver er enkel og kræver ikke specifikt oprenset proteinkomplekser. Dog er én fælles faldgrube kontaminering af prøven under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Disse forureninger i de fleste tilfælde omfatter keratiner, der stammer fra støv, hud eller hår. Ekstra pleje såsom iført handsker og lab frakker, filtrerende vandig buffere, og ved hjælp af høj renhed opløsningsmidler bør derfor tages under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Andre forurenende proteiner som chaperoner er som regel indført under protein oprensning, f.eks.når du bruger affinitet tags. I disse tilfælde, bør protein oprensning forbedres, for eksempel ved at øge vaske trin. Under alle omstændigheder protein forureninger i stikprøven er let identificeres under til databasesøgning ved at udelade filteret taksonomi (dvs.søge mod proteiner fra alle arter). Hvis kun et par peptider overholdes (dvs., en lav protein dækning kunne opnås), selv om tilstrækkelig prøven er tilgængelig, det kan være nødvendigt at bruge en anden proteinase under fordøjelsen. Generelt giver Trypsin et tilstrækkeligt antal peptider; men i nogle tilfælde som Membranproteiner eller membran domæner af proteiner, reduceres antallet tryptic kavalergang websteder og andre enzymer målretning hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.
Med hensyn til instrumentering kræves en særligt modificerede instrument for indfødte massespektrometri, som bevarer ikke-kovalente interaktioner under overførsel til gas-fase. Flere instrumenttyper er blevet indført, herunder Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens modificerede Q-ToF massespektrometre er kommercielt tilgængelige for indfødte massespektrometri da flere år, sidstnævnte var først for nylig indført og i de fleste tilfælde kræver specialiseret ændring45. Men anvendelsen af høj opløsning instrumenter tilladt at studere binding af flere ligander og deres kvantificering46,47 og er lovende for fremtidige ansøgninger.
For at identificere krydsbundet di-peptider ved liquid chromatography-koblet massespektrometri, kan standard procedurer med få ændringer anvendes. Men til databasesøgning er den begrænsende faktor som specialiseret software kan sjældent behandle store databaser og reduceret databaser indeholdende protein-underenheder af komplekser er påkrævet. Nylige undersøgelser anvendes masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretning protein interaktioner i hele cellen lysates48,49. Brugen af kemiske cross-linkers, der fragmenterer i tandem massespektrometri eksperimenter for det meste giver lineær peptider (ændret ved tværs linker), som kan identificeres ved yderligere fragmentering og database søgning af lineære peptider, og det reducerer Søg efter tid og beregningsmæssige søgning plads. Men for at udføre disse eksperimenter, en ion trap masse analyzer eller en hybrid massespektrometer med en ion trap er påkrævet. I almindelighed, som falske-positiver er et vigtigt spørgsmål, er massespektre af krydsbundet peptider ofte valideret manuelt af kvaliteten af deres fragment spektre, som udvider data analyse tid enormt. Udvikle robuste scoring systemer, der kan anvendes uden yderligere validering trin er derfor potentielle fremtidige applikationer. En måde at forbedre dataanalyse og reducere antallet af falsk-positive var indførelsen af falsk opdagelse sats beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasæt50.
Generelt er de teknikker, der beskrives her kan suppleres med yderligere massespektrometri teknikker (f.eks.kovalente mærkning) at øge outputtet fra analysen. Andre ændringer og forbedringer af protokollerne, der kan gennemføres let. Som sådan optrevler sammenlignende tværbindingsmidler34 konformationelle ændringer i protein-forsamling. Yderligere udviklinger i native massespektrometri i dag giver mulighed for analyse af membran proteiner51,52 og deres interaktioner med lipider28,52,53,54 . Nye udviklinger i høj opløsning massespektrometre for indfødte massespektrometri har udvidet den ansøgning og ligand bindende, fx, binding af lipider til Membranproteiner, kan nu medtages i analysen45, 46. i kombination med datamodellering tilgange, disse teknikker kan levere strukturelle modeller af varierende opløsning55. Hvis ingen crystal strukturer er tilgængelige for de intakte komplekse eller enkelt underenheder, kan massespektrometri levere første indsigt i protein interaktioner og topologi af ukendt komplekset. Afhængigt af de anvendte metoder og opnåede resultater, kan lav opløsning modeller af ukendt komplekset opnås56,57,58. Hvis krystal strukturer eller homologi modeller er tilgængelige, kan den strukturelle oplysninger modtaget fra massespektrometri udbytte selv nær-indfødte modeller59.
I forhold til andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen, at det kræver lave prøve beløb, det kan håndtere heterogene prøver og gælder for proteinkomplekser af ubegrænset størrelse. Desuden giver massespektrometri undersøgelsen af dynamisk protein systemer. Forskellige populationer af protein eller protein kompleks, der findes i løsningen bliver normalt analyseret sammen og derfor, i modsætning til andre strukturelle teknikker, som kræver udvalg af visse befolkningsgrupper, alle konformationer vedligeholdes under analyse og er evaluerbare i et eksperiment. Kvantitative tværbindingsmidler tilgange blev for nylig indført34,60,61 og er lovende for fremtidige ansøgninger der beskriver konformationelle ændringer under forskellige betingelser.

Den strukturelle undersøgelse af protein forsamlinger er blevet særlig vigtig for forståelsen af cellulære processer. Derfor, mange teknikker har udviklet og forbedret i strukturbiologi1. Men disse teknikker er undertiden begrænset i deres ansøgning på grund af størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet af proteinkomplekser under undersøgelsen. Massespektrometri kan håndtere disse udfordringer, og derfor opstod som et kraftfuldt værktøj i strukturbiologi2,3,4,5. Den største fordel ved massespektrometri, men er evnen til at utvetydigt identificere proteiner selv i komplekse og heterogene blandinger6. Med henblik herpå, proteiner er normalt fordøjes med endoproteinases og den resulterende peptid blanding er adskilt af væskekromatografi og direkte elueret i den massespektrometer. Peptid masserne bestemmes efterfølgende og forløber ioner er markeret for yderligere fragmentering af peptider. Proteiner er derefter identificeres ved søgning peptid og tilsvarende fragment masserne mod en kendt database. Denne procedure ikke kun tillader identifikation af peptider/proteiner, men også deres posttranslationelle modifikationer, som forårsager en masse Skift forløber peptider og fragmentioner transporterer ændring7. Nogle af de mange teknikker i strukturelle massespektrometri er baseret på dette princip4,8. For eksempel, fod mærkning teknikker såsom brint deuterium exchange9,10, kemiske mærkning strategier11,12, eller hydroxyl radikale udskrivning13,14 , give indsigt i den overflade tilgængelighed af proteiner under visse betingelser.
En anden teknik er (kemiske) danne tvaerbindinger, der involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af gennem deres funktionelle grupper. For dette er kemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansat15,16. Efter danne tvaerbindinger, proteiner er normalt hydrolyseret med proteaser og krydsbundet di-peptider er analyseret af liquid chromatography-koblet massespektrometri. Identifikation af tværbindingsmidler produkter-databasen til søgning, men kræver brugen af specialiseret software, som sammenkæde peptid sekvenser af forskellige proteiner og forskelligartede regioner17,18,19. Brugen af kemiske cross-linkers har den fordel, at det kan anvendes til næsten alle protein kompleks af interesse og ikke kræver indarbejdelse af UV-activatable aminosyrer, som kun kan opnås, når at udtrykke protein af interesse i værtsceller. Som sådan cross-linking er et alsidigt værktøj og var med held ansat i mange strukturelle undersøgelser af selv store protein forsamlinger20.
Massespektrometri af intakt proteinkomplekser (undertiden kaldet 'native' massespektrometri), på anden side indebærer analyse af intakt proteiner og proteinkomplekser uden hydrolyse til peptider. Det afslører sammensætning, heterogenitet, støkiometrisk, topologi og subunit vekselvirkninger mellem protein komplekser21,22. I kombination med ion mobilitet tillader indfødte massespektrometri yderligere bestemmelse af deres kropsbygning23,24. Dette gør det et stærkt værktøj til den strukturelle undersøgelse af proteinkomplekser, der er vanskelige at vurdere af konventionelle strukturelle teknikker. Men indfødte massespektrometri kræver analyse buffere, der fastholder ikke-kovalente protein interaktioner under electrospray Ionisation. Dette opnås normalt ved hjælp af vandig, flygtige buffere såsom ammonium acetat25. Derudover er instrument ændringer nødvendige for at undgå dissociation under transmission i gasfasen af massespektrometer26. Anvendes på denne måde, blev mange (store) proteinkomplekser analyseret. Imponerende eksempler er studier af intakt ribosomer27, ATP synthases28eller vira29.
Kombinationen af indfødte massespektrometri og danne tvaerbindinger succes især i tidligere undersøgelser. For eksempel, stoichiometries af anstandsdame komplekser, herunder en uventet Hsp70 dimer, kunne være fremstillet af massespektrometri eksperimenter af intakt proteinkomplekser, mens kemiske cross-linking afslørede ordningerne af proteiner i den assemblies30,31. I en anden undersøgelse, blev virkningerne af posttranslationelle modifikationer på en intakt ATPsyntase komplekse undersøgt. Native massespektrometri givet indsigt i protein kompleks stabilitet i tilstedeværelse eller fravær af fosforylering eller acetylation32,33. En sammenlignende tværbindingsmidler strategi34 afslørede derefter konformationelle ændringer af protein kompleks under forskellige forhold.
Her give vi protokollerne for protein identifikation af massespektrometri, (kemiske) cross-linking og indfødte massespektrometri, herunder data-analyse og fortolkning (figur 1). Kombinationen af supplerende resultaterne fra disse metoder ved hjælp af to godt karakteriseret proteinkomplekser er demonstreret35. Vores protokol kan anvendes til enhver protein forsamling, som kan renses på visse renhed og koncentration. Metoden er i nogle tilfælde begrænset af dataanalyse for danne tvaerbindinger data, dvs, størrelsen af databasen ansat, som bestemmer den krævede Søg tid og rum. Derudover manuel validering af konstaterede cross-links er ofte nødvendig og yderligere reducerer produktionen. Native massespektrometri er for det meste begrænset af prøven kvalitet, fx, buffere og adukter anvendes under rensning og mulighed for at udveksle dem af vandige og flygtige buffere. Proteinkomplekser renset for strukturel analyse normalt har dog kvalitetskrav for vellykket analyse med vores protokoller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

Proteiner interagere med deres ligander form aktiv og dynamisk forsamlinger, som udfører forskellige cellulære funktioner. Belyse disse interaktioner er derfor grundlæggende for forståelsen af cellulære processer. Men mange proteinkomplekser er dynamisk forsamlinger og er ikke tilgængelige af konventionelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrager til den strukturelle undersøgelse af disse forsamlinger, og især kombinationen af forskellige massespektrometriske metoder leverer værdifuld indsigt i deres strukturelle arrangement.
I denne artikel, vi beskriver anvendelsen og kombination af to supplerende massespektrometriske metoder, nemlig kemiske cross-linking kombineret med massespektrometri og indfødte massespektrometri. Kemiske cross-linking involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af ved hjælp af kemiske reagenser. Efter fordøjelse med proteaser, tværbundet di-peptider er identificeret ved massespektrometri og protein interaktioner websteder er udækket. Indfødte massespektrometri er til gengæld analysen af intakt protein forsamlinger i gasfasen af et massespektrometer. Det afslører protein stoichiometries samt protein og ligand interaktioner. Begge teknikker derfor levere supplerende oplysninger om strukturen af protein-ligand forsamlinger og deres kombination viste sig magtfulde i tidligere undersøgelser.

Den strukturelle analyse af proteiner og komplekser danner de er grundlæggende for at forstå deres funktion. Massespektrometri bidrager betydeligt til den strukturelle undersøgelse i, at det kan anvendes på næsten alle kompleks af interesse uanset størrelse eller prøve heterogenitet. Vi eksemplificere protokollen ved hjælp af to godt karakteriseret proteinkomplekser; første, hetero-dodecamer RvB1/B2 fra C. thermophilum og for det andet, den hetero-octameric CPS komplekse fra E. coli.
Først, vi identificeret proteinkomponenter af de to komplekser. For dette, proteiner var adskilt af SDS-PAGE (figur 2) og gel bands blev skåret fra gel. Efter-gel fordøjelsen af proteiner, peptid blandingen blev analyseret af liquid chromatography-koblet massespektrometri og peptid og fragment masserne blev udsat for database søgning. Efter denne arbejdsproces, vi identificeret alle protein underenheder af de to komplekser med høj tillid, dvs., et stort antal af peptider med rimelig peptid scoringer blev observeret giver høj sekvens dækning for alle protein subunits (tabel 1 ).
Derefter analyserede vi den intakte RvB1/B2 kompleks af indfødte massespektrometri (figur 3A). Den masse spektrum afslørede to arter, en på ca 8.000 m/z og en anden arter på ca 11.000-12.000 m/z. De beregnede masserne for disse arter svarer til hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ring (cirka 310 kDa) og den dodecameric dobbelt-ring (RvB1)6(RvB2)6 (ca. 620 kDa). Både peak serie viser to befolkninger; disse stammer fra en blanding af hans mærkede og umærkede RvB2 underenheder i komplekser. En krystalstruktur for RvB1/B2 komplekse blev tidligere fremstillet36 og viser placeringen af dobbelt-ring (figur 3B). De indfødte masse spektrum bekræfter derfor støkiometrisk af den intakte dodecamer og desuden afslører en stabil sub kompleks. Derudover er co-eksisterende populationer identificeret.
For at identificere protein interaktion websteder i RvB1/B2 kompleks, tværbunden vi kemisk renset komplekset med BS3 tværs linker. Vi først titreres mængden af BS3 under den tværbindingsmidler reaktion til at bestemme den optimale koncentration. BS3 er Amin-specifikke og kovalent links lysin sidekæder samt N-termini af proteiner. Den tværbindingsmidler reaktion blev fulgt af SDS-PAGE (figur 2A). Den ikke-cross-linked kompleks viste både RvB1 og RvB2 underenheder. Tilføje BS3 til reaktionsmiljøet forårsaget kovalente sammenkobling af de proteiner, hvilket resulterer i protein bands på højere molekylvægt. SDS gel viser, at stigende mængder af BS3 give større mængder af krydsbundet arter, mens ikke-Kors-forbundet protein underenheder er reduceret. Vi så skar protein bånd fra gel og fulgte protokollen i henhold ovenfor for at identificere protein interaktion websteder. Et eksempel spektrum af en krydsbundet di-peptid er vist (figur 3 c). Spektret viser y-ion serie af begge peptider bekræfter dette protein interaktion. I alt, vi fik 14 protein interaktioner, herunder fire cross-links mellem underenheder RvB1 og RvB2 og to cross-links mellem to kopier af RvB2 (tabel 2). Resultater fra BS3 cross-linking er visualiseret i en interaktion netværk (figur 3D) viser intra molekylære interaktioner samt interaktioner mellem forskellige underenheder. Intra molekylære cross-links tyder på, at både RvB1 og RvB2 subunits fold på en måde, at N - og C-terminale domæner er i umiddelbar nærhed. Bemærk, at intra molekylære interaktioner ikke kan skelnes fra Inter molekylære interaktioner af de samme underenheder i dette tilfælde. Inter molekylære cross-links mellem de to subunits blev også observeret. Af disse kunne to indbyrdes molekylære cross-links mellem RvB1 og RvB2 visualiseres i strukturen validerer den tværbindingsmidler tilgang. De andre indbyrdes molekylære cross-links er placeret i fleksible sløjfer, som ikke er medtaget i krystalstruktur. Vi identificerede også to cross-links i RvB2 der indeholder de samme peptid sekvenser. Disse cross-links kan utvetydigt klassificeres som Inter molekylære som de skal stamme fra to kopier af den samme protein (figur 3D). Vores tværbindingsmidler eksperimenter afsløre protein interaktion websteder inden for komplekset, men også inden for protein-underenheder giver indsigt i deres strukturelle arrangement, som kunne også bekræftes af den eksisterende krystalstruktur (figur 3B).
Den anden protein kompleks, som vi studerede var CPS. De indfødte masse spektrum (figur 4A) afsløret tre proteinkomplekser mellem 6.000 og 12.000 m/z. Den største kompleks af 640 kDa svarer til den intakte hetero-octamer. De mindre komplekser repræsenterer to sub komplekser; dimer af små og store CPS underenheder (160 kDa) og en hetero-tetramer indeholdende to kopier af hver af de underenheder (320 kDa). Disse sub komplekser levere første indsigt i protein forsamlingen; dvs., de små og store underenheder er i direkte kontakt (som afsløret af hetero-dimer) og tetramer kan være et produkt af to dimerer. For at få flere oplysninger om den strukturelle arrangement i den intakte CPS komplekse, udførte vi tandem massespektrometri (MS/MS) hetero-octamer og hetero-tetramer. I begge tilfælde, den lille underenhed adskilles fra den forløber, tyder på, at den lille underenhed er beliggende i periferien af forsamlingen (figur 4B). Ja, den lille underenhed er perifere i tilgængelige krystal struktur (figur 4 c)44.
Kemiske danne tvaerbindinger ved hjælp af BS3 tværs linker blev også udført. Ved hjælp af stigende mængder, blev den kovalente sammenkædning af CPS underenheder forbedret. Efter fordøjelsen af proteiner og analyse af peptider som beskrevet ovenfor, var mange protein interaktioner i de store subunit og én cross-link i den lille underenhed opnået (tabel 2). Derudover svarende til RvB1/B2 komplekse, vi fandt to indbyrdes molekylære cross-links mellem to kopier af den store CPS underenhed. Disse cross-links placere de to store underenheder overfor hinanden på deres C-terminal sider. I en tidligere undersøgelse, identificeret kombinerer strukturel massespektrometri og datamodellering35, vi tre yderligere interaktioner i de store subunit, som mest sandsynligt stammer fra interface to kopier af den store subunit valideret af krystalstruktur og den opnåede model (figur 4 c og tabel 2). Disse interaktioner tillade arrangement af CPS core kompleks bestående af fire store underenheder. Dog blev ingen Inter subunit cross-links mellem små og store underenheder observeret. Ved inspektion af de tilgængelige krystalstruktur (figur 4 c), bliver det klart, at interaktion overflade mellem tetramert kernen i komplekset, bestående af store subunit og de perifere lille underenheder er meget lille, hvilket kan forklare manglen indbyrdes subunit interaktioner. Dette bekræftes af indfødte massespektrometri, som viste, at den lille underenhed let tager fra de intakte komplekser mest sandsynligt på grund af en lille bindende interface. Ikke desto mindre tillade protein interaktioner i CPS komplekse kombineret fra kemiske cross-linking og indfødte massespektrometri udlede deres strukturelle arrangement (figur 4D).
Tilsammen, giver kombinationen af indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking kombineret med massespektrometriske identifikation af krydsbundet peptider, rekonstituering af den strukturelle arrangement af begge eksempel komplekser. Mens kemiske cross-linking afslørede arrangement af protein-underenheder, for eksempel samspillet mellem RvB1 og RvB2 eller inden for den tetramert kerne af CPS, native massespektrometri leveret protein stoichiometries af de intakte komplekser og udbredte subcomplexes. I forbindelse med CPS, som ikke indbyrdes molekylære interaktioner mellem de to subunits vil kunne bemærkes af kemiske cross-linking, tyder native massespektrometri på, at hver store subunit interagerer med én lille subunit (figur 4D). Tandem massespektrometri foreslog den perifere placering for den lille underenhed i komplekset og en lille interface mellem begge underenheder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figur 1: Workflow af indfødte massespektrometri og danne tvaerbindinger. Begge teknikker levere supplerende resultater. Mens indfødte massespektrometri afslører stoichiometries og interaktion moduler, giver danne tvaerbindinger indsigt i protein interaktion websteder inden for komplekser. Bemærk, at kemiske cross-linking kun afslører binære interaktioner. (A) det første skridt i native massespektrometri er buffer exchange til en flygtig og vandig buffer ved hjælp af filteret enheder eller gel filtrering kolonner. Massespektrometri af intakt proteinkomplekser afslører derefter deres støkiometrisk. I tandem massespektrometri eksperimenter, der perifere underenheder dissocieres. (B) For kemiske cross-linking, protein kompleks er inkuberes med en tværbindingsmidler reagens. De krydsrefererede proteiner er derefter fordøjet i peptider, som analyseres efterfølgende af liquid chromatography-koblet massespektrometri. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figur 2: SDS-PAGE af tværbundet RvB1/B2 (A) og CPS b komplekser. (A) 2,5 µM RvB1/B2 blev indlæst pr. gel lane. Koncentrationen af BS3 blev varieret. Non-cross-knyttet RvB1/B2 viser to protein-underenheder på ca 50 kDa. Tilsætning af BS3 forårsaget kovalente sammenkædning af protein-underenheder resulterer i protein bands på højere molekylvægt. Mængden af krydsbundet arter er steget med højere BS3 koncentrationer. Optimal tværbindingsmidler betingelser er fremhævet (rød). (B) 10 µM CPS blev indlæst pr. gel lane. Den store (90 kDa) og små (40 kDa) CPS underenheder er opnået. Tilsætning af BS3 forårsaget kovalente sammenkædning af protein-underenheder resulterer i protein bands på højere molekylvægt. Optimal tværbindingsmidler betingelser er fremhævet (rød). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figur 3: indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking af RvB1/B2 komplekse. (A) den oprindelige masse spektrum afslører to arter af RvB1/B2; den intakte dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) på ca. 11.000 til 12.000 m/z og hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ca 8.000 m/z. Begge arter viser to befolkningsgrupper som følge af hans mærkede og umærkede RvB2. Spektret er blevet ændret fra35. (B) krystal struktur af RvB1/B2 er vist (PDB ID 4WVY). Skiftevis RvB1 og RvB2 danner subunits to hexameric ringe. (C) fragmentering spektrum af en krydsbundet di-peptid. N-terminus af RvB1 var tværbundet med K23 af RvB1. y-ion serien blev opnået for både peptider (rød og cyan). (D) samhandelen og Inter-Diesel protein interaktioner er fremstillet i RvB1/B2-komplekset. Intra-Cross-Country-links vises med rødt, inter-cross-links er vist i blåt. Indsatsen viser to indbyrdes molekylære cross-links mellem RvB1 og RvB2 subunits, som kunne visualiseres i krystalstruktur (grøn, Indsæt). Samspil, der stammer fra to RvB2 kopier vises som blå prikkede linjer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figur 4: indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking af CPS. (A) den indfødte masse spektrum af CPS viser tre komplekser. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) og hetero-octamer (640 kDa). Spektret er blevet ændret fra35. (B) Tandem massespektrometri af tetramert og octameric CPS komplekse afslørede dissociation af små CPS subunit. (C) krystal struktur af CPS er vist (PDB ID 1BXR). De store underenheder udgøre en tetramert kerne og de lille underenheder er placeret i periferien af komplekset. Inter molekylære cross-links mellem to kopier af den store subunit er vist (grøn). (D) vekselvirkninger mellem de store og små CPS underenheder. Native massespektrometri viste subcomplexes og foreslår en perifer beliggenhed i den lille underenhed. Kemiske cross-links angive ordninger i den tetramert kerne af CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: Database søgeresultater. Proteinerne, der blev identificeret af liquid chromatography-koblet massespektrometri og database søgning. Navnene protein tiltrædelses-nummer, samt beskrivelse og protein masse er givet. Protein score, antallet af observerede spectra pr. protein og antallet af observerede peptid sekvenser er angivet. De fem peptider med højeste Mascot peptider scores er anført for hvert protein-underenheder. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Tabel 2: Cross-links observeret i RvB1/B2 og CPS. Underenheder af komplekser og de krydsrefererede rester er givet. Typen af cross-link (intra - eller Inter Molekylær) blev afsløret fra overlappende peptid sekvenser eller en tidligere undersøgelse35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Arkitektur af proteinkomplekser er afgørende for deres funktion. Kombinere forskellige massespektrometriske metoder vist sig magtfulde at studere deres forsamling. Vi leverer protokoller for kemiske cross-linking og indfødte massespektrometri og viser hvordan disse supplerende teknikker bidrage til at belyse arkitektur af multi subunit protein forsamlinger.

Kombinere kemisk Cross-linking og massespektrometri af intakt proteinkomplekser at studere arkitektur af multi subunit Protein forsamlinger

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering og Biofysisk Undersøgelse af Frugt neglebånd

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

En protokol til identifikation af protein-protein interaktioner Udfra<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk mærkning Immunoprecipitation, Kvantitativ massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodede Molecular Probes at studere G-protein-koblede receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...