Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Wij danken onze collega's voor nuttige discussies. Wij danken ook Ilme Schlichting en Karl-Peter Hopfner voor het verstrekken van eiwitcomplexen. Wij erkennen dat financiering uit het federale ministerie voor onderwijs en onderzoek (goedgekeurd, ZIK programma, 03Z22HN22), de Europese regionale ontwikkelingsfondsen (EFRE, ZS/2016/04/78115) en de MLU Halle-Wittenberg C.S. en financiering van de Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) naar A.P.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Protocollen zijn voorzien van massa spectrometrie gebaseerde structuuranalyse van multi subeenheid eiwitcomplexen. De twee technieken, beschreven in het protocol, meestal aanvullende resultaten en zijn zeer geschikt inzichten te krijgen in de structurele regelingen binnen eiwit (-ligand) complexen die moeilijk te bestuderen door conventionele structurele technieken. Native massaspectrometrie levert inzicht in eiwit stoichiometries evenals eiwitinteractie door het analyseren van subcomplexes en stabiele interactie modules. Cross-linking, aan de andere kant, levert informatie op directe contact sites. Afhankelijk van de cross-linker gebruikt, een zekere flexibiliteit kan of moet worden opgenomen in de analyse.
De meegeleverde protocollen zijn in het algemeen gemakkelijk uit te voeren en niet tijdrovend. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd binnen een week en kan worden toegepast op vrijwel alle eiwitcomplexen, hoewel, een bepaalde hoeveelheid het eiwit complex vereist is voor succesvolle analyse. Bereiding van de monsters is eenvoudig en vereist geen specifiek gezuiverde eiwitcomplexen. Één gemeenschappelijke pitfall is echter een besmetting van het monster tijdens de bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde eiwit identificatie. Deze verontreinigingen in de meeste gevallen omvatten keratines, die afkomstig van stof, huid of haar zijn. Daarom, extra zorg zoals het dragen van handschoenen en Labjassen, filtrating waterige buffers, en het gebruik van hoge zuiverheid oplosmiddelen moeten worden genomen tijdens de bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde eiwit identificatie. Andere contaminerende eiwitten zoals chaperones zijn meestal geïntroduceerd tijdens EiwitReiniging, bijvoorbeeldbij het gebruik van affiniteit tags. In deze gevallen moet eiwitreiniging worden verbeterd, bijvoorbeeld door het verhogen van wassen stappen. In ieder geval eiwit verontreinigingen in de steekproef tijdens de database zoeken gemakkelijk worden geïdentificeerd door het weglaten van de taxonomie-filter (dat wil zeggen, zoeken tegen proteïnen van alle soorten). Als slechts een paar peptiden in acht worden genomen (d.w.z., de dekking van een laag eiwitgehalte kan worden verkregen), ook al voldoende monster beschikbaar is, kan het nodig zijn om te gebruiken een verschillende proteïnase tijdens de vertering. In het algemeen levert trypsine een voldoende aantal peptiden; echter in sommige gevallen zoals membraaneiwitten of membraan domeinen van eiwitten, het aantal al decollete sites wordt verminderd en andere enzymen gericht op hydrofobe aminozuren zijn een betere keuze.
Op het gebied van instrumentatie is een bijzonder gewijzigde instrument vereist voor inheemse massaspectrometrie die beweert van niet-covalente interacties tijdens de overdracht in de gas-fase. Instrument verschillende bijgekomen, waaronder Q-ToF en orbitrap instrumenten. Terwijl gemodificeerde Q-ToF massaspectrometers commercieel beschikbaar zijn voor native massaspectrometrie sinds verscheidene jaren, de laatste pas onlangs zijn geïntroduceerd en in de meeste gevallen vereisen gespecialiseerde wijziging45. Echter de toepassing van hoge resolutie instrumenten mogen studeren binding van meerdere liganden en hun kwantificering46,47 en is veelbelovend voor toekomstige toepassingen.
Als u wilt identificeren kruislings gekoppelde di-peptiden door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie, kunnen standaardprocedures met enkele wijzigingen worden toegepast. Echter, de database zoeken is de beperkende factor als gespecialiseerde software kan zelden omgaan met grote databases en verminderde databases met de eiwit subeenheden van de complexen zijn vereist. Recente studies gebruikt massa spectrometrie-cleavable cross-linkers eiwitinteractie in hele cel lysates48,49richt. Het gebruik van chemische cross-linkers dat in tandem massaspectrometrie experimenten meestal fragment levert lineaire peptiden (gewijzigd door de cross-linker), die kunnen worden geïdentificeerd door verdere versplintering en database zoeken van lineaire peptiden, en dit vermindert zoektijd en computationele zoekruimte. Echter, voor het uitvoeren van deze experimenten, een massale analysator van ion trap of een hybride massaspectrometer met een ion trap is vereist. In het algemeen, zijn vals-positieven zijn een belangrijke kwestie, massaspectra van kruislings gekoppelde peptiden vaak gevalideerd handmatig door de kwaliteit van hun fragment spectra die gegevens analyse tijd enorm uitbreidt. Het ontwikkelen van robuuste scoren systemen die kunnen worden toegepast zonder verdere validatiestappen derhalve potentiële toekomstige toepassingen zijn. Unidirectioneel om data-analyse en het aantal vals-positieven te verminderen was de introductie van valse ontdekking tarief berekeningen en de toepassing ervan op datasets50dwarsbinding.
In het algemeen, de hier beschreven technieken kunnen worden aangevuld met verdere massaspectrometrie technieken (bijvoorbeeldcovalente labelen) te verhogen van de output van de analyse. Andere aanpassingen en verbeteringen van de protocollen kunnen gemakkelijk worden geïmplementeerd. Als zodanig ontrafelt vergelijkende cross-linking34 conformationele veranderingen in de vergadering van de eiwitten. Verdere ontwikkelingen in de inheemse massaspectrometrie toestaan tegenwoordig de analyse van membraan eiwitten51,52 en hun interacties met lipiden28,52,53,,54 . Nieuwe ontwikkelingen van high-resolution massaspectrometers voor inheemse massaspectrometrie hebben uitgebreid de toepassing en ligand bindende, bijvoorbeeld, binding van lipiden aan membraaneiwitten, kunnen nu worden opgenomen in de analyse45, 46. in combinatie met computationele modellering benaderingen, kunnen deze technieken leveren structurele modellen van verschillende resolutie55. Als geen kristalstructuren beschikbaar voor de intact complexe of één subeenheden zijn, kan massaspectrometrie leveren eerste inzichten in eiwit interacties en de topologie van het onbekende complex. Afhankelijk van de gebruikte technieken en de verkregen resultaten, kunnen met een lage resolutie modellen van het onbekende complex worden verkregen van56,57,58. Als kristalstructuren of homologie modellen beschikbaar zijn, kan de structuurgegevens van massaspectrometrie ontvangen zelfs in de buurt van-native modellen59opleveren.
In vergelijking met andere structurele technieken, massaspectrometrie heeft het voordeel dat het vereist lage monster bedragen, kan omgaan met heterogene monsters en is van toepassing op eiwitcomplexen van onbeperkte grootte. Verder, staat massaspectrometrie het onderzoek van dynamische eiwit systemen. Verschillende bevolkingsgroepen van het eiwit of eiwit complex die bestaan in oplossing meestal samen worden geanalyseerd en daarom, in tegenstelling tot met andere structurele technieken waarvoor selectie van bepaalde bevolkingsgroepen, alle conformaties worden gehandhaafd tijdens analyse en zijn verifieerbare in één experiment. Kwantitatieve cross-linking benaderingen werden onlangs geïntroduceerde34,60,,61 en zijn veelbelovend voor toekomstige toepassingen beschrijven conformationele wijzigingen onder verschillende omstandigheden.

Het structurele onderzoek van eiwit assembly's is bijzonder belangrijk voor het begrijpen van cellulaire processen geworden. Bijgevolg, veel, technieken zijn ontwikkeld en verbeterd in structurele biologie1. Deze technieken zijn echter soms beperkt in hun toepassing als gevolg van de heterogeniteit van de eiwitcomplexen onderzochte, grootte en flexibiliteit. Massaspectrometrie kan omgaan met deze uitdagingen en daarom, naar voren gekomen als een krachtig instrument in structurele biologie2,,3,,4,5. Het grootste voordeel van de Spectrometrie van de massa, is echter de mogelijkheid om proteïnen zelfs in complexe en heterogene mengsels6ondubbelzinnig te identificeren. Te dien einde eiwitten zijn meestal verteerd met endoproteinases en het resulterende mengsel van peptide is gescheiden door vloeistofchromatografie en rechtstreeks in de massaspectrometer geëlueerd. Peptide massa's worden vervolgens vastgesteld en voorloper ionen zijn geselecteerd voor verdere versnippering van de peptiden. Eiwitten worden vervolgens geïdentificeerd door zoeken peptide en overeenkomstige fragment massa's tegen een bekend database. Deze procedure kunt niet alleen de identificatie van peptiden/eiwitten maar ook hun posttranslationele modificaties die leiden tot een massale verschuiving van de voorloper van peptiden en de uitvoering van de wijziging7fragment-ionen. Sommige van de vele technieken in structurele massaspectrometrie zijn gebaseerd op dit principe4,8. Bijvoorbeeld, voet labeling technieken zoals waterstof: deuterium exchange9,10, chemische labeling strategieën11,12, of hydroxyl radicaal afdrukken13,14 , geven inzicht in de oppervlakte toegankelijkheid van de eiwitten onder bepaalde voorwaarden.
Een andere techniek is (chemische) dwarsbinding waarbij de covalente binding van aminozuren in de nabijheid door hun functionele groepen. Hiervoor zijn chemische reagentia, UV-gevechts reagentia of aminozuren werknemer15,16. Na de cross-linking, de eiwitten zijn meestal gehydrolyseerd met proteasen en kruislings gekoppelde di-peptiden zijn geanalyseerd door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie. De identificatie van producten van de cross-linking door database zoeken, echter, vereist het gebruik van gespecialiseerde software die aaneenschakelen peptide reeksen van verschillende eiwitten en uiteenlopende regio's17,18,19. Het gebruik van chemische cross-linkers heeft het voordeel dat het kan worden gebruikt om bijna elk eiwit complex van belang en vereist geen opneming van UV-gevechts aminozuren, die alleen bereikt kan worden als uiting van de proteïne van belang in de cellen van de gastheer. Als zodanig, dwarsbinding is een veelzijdig instrument en werd met succes werkzaam in vele structurele studies van zelfs grote eiwit assemblages20.
De Spectrometrie van de massa van intact eiwitcomplexen (soms genoemd 'native' massaspectrometrie), aan de andere kant, omvat de analyse van intacte eiwitten en eiwitcomplexen zonder hydrolyse in peptiden. Het openbaart samenstelling, heterogeniteit stoichiometrie, topologie en subeenheid interacties van eiwit complexen21,22. In combinatie met ion mobiliteit kunt inheemse massaspectrometrie verder bepaling van hun conformatie23,24. Dit maakt het een krachtig hulpmiddel voor het structurele onderzoek van eiwitcomplexen, die moeilijk te beoordelen door conventionele structurele technieken. Native massaspectrometrie vereist echter analyse buffers, die niet-covalente eiwitinteractie tijdens electrospray ionisatie handhaven. Dit wordt meestal bereikt met behulp van waterige, vluchtige buffers zoals ammonium acetaat25. Daarnaast, zijn instrument wijzigingen noodzakelijk om te voorkomen dat dissociatie tijdens de overdracht in de gasfase van de massaspectrometer26. Op deze wijze wordt toegepast, werden veel (grote) eiwitcomplexen geanalyseerd. Indrukwekkende voorbeelden zijn de studies van intact ribosomen27, ATP synthases28of virussen29.
De combinatie van inheemse Spectrometrie van de massa en dwarsbinding bijzonder succesvol in eerdere studies gebleken. Bijvoorbeeld, de stoichiometries van de Chaperon complexen, met inbegrip van een onverwachte Hsp70 dimeer, kon worden verkregen uit experimenten van de Spectrometrie van de massa van de intact eiwitcomplexen, terwijl chemische dwarsbinding geopenbaard de regelingen van de eiwitten in de assembly's30,31. In een andere studie, werden de effecten van posttranslationele modificaties op een intact ATP-synthase complex bestudeerd. Native massaspectrometrie verschaft inzicht in de complexe eiwitstabiliteit in de aanwezigheid of afwezigheid van fosforylering of acetylation32,33. Een vergelijkende cross-linking strategie34 bleek vervolgens conformationele wijzigingen van het eiwit complex onder de verschillende omstandigheden.
Hier bieden wij de protocollen voor eiwit identificatie door massaspectrometrie (chemische) dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie, met inbegrip van data-analyse en interpretatie (Figuur 1). De combinatie van aanvullende resultaten verkregen uit deze methoden met behulp van twee goed gekarakteriseerd eiwitcomplexen is aangetoond dat35. Ons protocol kan worden toegepast op elke proteïne-assemblage die kan worden gezuiverd op bepaalde zuiverheid en concentratie. De aanpak is in sommige gevallen beperkt door data-analyse van gegevens, dat wil zeggen, de grootte van de database dwarsbinding werkzaam, die bepaalt dat de vereiste zoekruimte en tijd. Daarnaast handmatige validatie van geïdentificeerde cross-links wordt vaak vereist en verder beperkt de uitvoer. Native massaspectrometrie wordt meestal beperkt door de kwaliteit van de steekproef, bijvoorbeeld, buffers en adducten gebruikt tijdens de reiniging en de mogelijkheid om te wisselen ze door waterige en vluchtige buffers. Eiwitcomplexen gezuiverd voor structurele analyse meestal wel de vereiste voor succesvolle analyse met onze protocollen kwaliteit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

Eiwitten interactie met hun liganden voor vorm-actieve en dynamische samenstellen die verschillende cellulaire functies uitvoeren. Deze interacties ophelderen is daarom van fundamenteel belang voor het begrijpen van cellulaire processen. Zijn dynamische assemblages echter veel eiwitcomplexen en zijn niet toegankelijk door conventionele structurele technieken. Massaspectrometrie draagt bij aan het structurele onderzoek van deze vergaderingen, en met name de combinatie van diverse massaspectrometrische technieken levert waardevolle inzichten in hun structurele regeling.
In dit artikel beschrijven we de toepassing en de combinatie van twee complementaire massaspectrometrische technieken, namelijk chemische dwarsbinding gekoppeld aan massaspectrometrie en inheemse Spectrometrie van de massa. Chemische dwarsbinding betekent de covalente binding van aminozuren in de nabijheid met behulp van chemische reagentia. Na de spijsvertering met proteasen, kruislings gekoppelde di-peptiden zijn geïdentificeerd door massaspectrometrie en eiwit interacties sites zijn ontdekt. Native Spectrometrie van de massa is aan de andere kant de analyse van intacte eiwitten assemblages in de gasfase van een massaspectrometer. Het openbaart eiwit stoichiometries evenals eiwitten en ligand interacties. Beide technieken leveren daarom aanvullende informatie over de structuur van het eiwit-ligand verzamelingen en hun combinatie bewezen krachtige in eerdere studies.

De structuuranalyse van eiwitten en de zij vormen complexen is van fundamenteel belang voor het begrijpen van hun functie. Massaspectrometrie bijdraagt aanzienlijk aan de structurele onderzoek in dat het kan worden toegepast op bijna elk complex van belang ongeacht grootte of proeven van heterogeniteit. We illustreren het protocol met behulp van twee goed gekarakteriseerd eiwitcomplexen; Ten eerste, de hetero-dodecamer RvB1/B2 van C. thermophilum en ten tweede, de hetero-octameric CPS complex van E. coli.
Voor het eerst, we de onderdelen van de eiwitten van de twee complexen geïdentificeerd. Voor dit, de eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE (Figuur 2) en gel bands werden gesneden van de gel. Na-gel vertering van de eiwitten, de peptide mengsel werd geanalyseerd door vloeibare chromatografie-coupled Spectrometrie van de massa en peptide en fragment massa's werden onderworpen aan database zoeken. Na deze workflow, we geïdentificeerd alle eiwit subeenheden van de twee complexen met hoge vertrouwen, dat wil zeggen, een groot aantal peptiden met redelijke peptide scores werd waargenomen oplevert van de dekking van de hoge sequentie voor alle eiwit subeenheden (tabel 1 ).
Wij vervolgens de intact RvB1/B2 complexe geanalyseerd door inheemse massaspectrometrie (figuur 3A). De massaspectrum bleek twee soorten, één op ongeveer 8000 m/z en een andere soort op ongeveer 11.000-12.000 m/z. De berekende massa's voor deze soorten komen overeen met de hexameer (RvB1)3(RvB2)3 ring (ongeveer 310 kDa) en de dodecameric dubbel-ring (RvB1)6(RvB2)6 (ongeveer 620 kDa). Beide serie van de peak Toon twee populaties; Deze zijn afkomstig uit een mengsel van Zijne-gelabeld en niet-gecodeerde RvB2 subeenheden in de complexen. Een kristalstructuur voor de RvB1/B2 complex was eerder verkregen36 en toont de rangschikking van de dubbele-ring (figuur 3B). De inheemse massaspectrum bevestigt derhalve de stoichiometrie van de intact dodecamer en bovendien blijkt een stabiele sub complex. Bovendien, worden co-existing populaties geïdentificeerd.
Om te identificeren eiwit interactie sites in de RvB1/B2-complex, wij chemisch kruiselings gekoppelde het gezuiverde complex met BS3 cross-linker. We eerst de hoeveelheid BS3 getitreerd tijdens de cross-linking reactie te bepalen van de optimale concentratie. BS3 is amine-specifieke covalent Verwijzigingen lysine zijketens alsmede de N-termini van eiwitten. De cross-linking reactie werd gevolgd door SDS-PAGE (figuur 2A). De niet-cross-unit linked complex toonde subeenheden van zowel RvB1 als RvB2. BS3 toe te voegen aan het reactiemengsel veroorzaakt covalente koppeling van de eiwitten resulterend in eiwit bands op hoger molecuulgewicht. De gel SDS toont dat stijgende hoeveelheden BS3 hogere bedragen kruislings gekoppelde soorten opleveren, terwijl niet-kruis-unit linked eiwit subeenheden worden beperkt. Vervolgens gesneden van de eiwit-bands uit de gel en het protocol moeten eiwit interactie sites hierboven gevolgd. Het spectrum van een voorbeeld van een kruislings gekoppelde di-peptide wordt weergegeven (Figuur 3 c). Het spectrum toont beide bevestiging van deze interactie eiwit peptiden reeks y-ion. In totaal, verkregen we 14 eiwitinteractie, met inbegrip van vier cross-links tussen subeenheden RvB1 en RvB2 en twee cross-links tussen twee kopieën van RvB2 (tabel 2). De resultaten van BS3 dwarsbinding worden gevisualiseerd in een netwerk met interactie (figuur 3D) tonen intra moleculaire interacties, alsmede de interacties tussen de verschillende subeenheden. Intra moleculaire cross-links suggereren dat zowel RvB1 als RvB2 subeenheden op een manier vouwen dat de N - en C-terminaal domeinen in de nabijheid zijn. Opmerking, dat intra moleculaire interacties van Inter moleculaire interacties van de dezelfde subeenheid in dit geval kunnen niet worden onderscheiden. Inter moleculaire cross-links tussen de twee subeenheden werden ook waargenomen. Hiervan kunnen twee inter moleculaire cross-links tussen RvB1 en RvB2 worden gevisualiseerd in de structuur het valideren van de cross-linking aanpak. De andere Inter moleculaire cross-links bevinden zich in flexibele loops, die niet zijn opgenomen in de kristalstructuur. Wij ook twee cross-links in RvB2 met de dezelfde peptide-sequenties geïdentificeerd. Deze cross-links kunnen ondubbelzinnig als inter moleculaire zoals zij afkomstig van twee exemplaren van hetzelfde eiwit (figuur 3D zijn moeten) worden ingedeeld. Onze cross-linking experimenten onthullen eiwit interactie plaatsen binnen het complex, maar ook binnen de eiwit subeenheden biedt inzichten in hun structurele regeling kan ook worden bevestigd door de bestaande kristalstructuur (figuur 3B).
De tweede eiwit complex dat we studeerde was CPS. De inheemse massaspectrum (figuur 4A) onthuld drie eiwitcomplexen tussen de 6000 en 12.000 m/z. Het grootste complex van 640 kDa komt overeen met de intact hetero-octamer. De kleinere complexen vertegenwoordigen twee sub complexen; het dimeer van de kleine en grote CPS subeenheden (160 kDa) en een hetero-tetrameer met twee kopieën van elke subeenheid (320 kDa). Deze sub complexen leveren eerste inzichten in de eiwit-vergadering; dat wil zeggen, de grote en kleine subeenheden staan in direct contact (zoals geopenbaard door de hetero-dimeer) en de tetrameer wellicht een product van twee Dimeren. Om te krijgen meer informatie over de structurele regeling in de complexe intact CPS, we tandem massaspectrometrie (MS/MS) van de hetero-octamer en de hetero-tetrameer uitgevoerd. In beide gevallen, de kleine subeenheid losgekoppeld van de voorloper suggereren dat de kleine subeenheid is gelegen in de periferie van de vergadering (figuur 4B). Inderdaad, de kleine subeenheid is perifere in de beschikbare kristal structuur (figuur 4C)44.
Chemische dwarsbinding met behulp van de BS3 cross-linker werd ook uitgevoerd. Met behulp van steeds grotere hoeveelheden, werd de covalente binding van de CPS subeenheden verbeterd. Na vertering van de eiwitten en analyse van de peptiden zoals hierboven beschreven, zijn veel eiwit interacties binnen de grote subeenheid en één kruislings gekoppelde in de kleine subeenheid verkregen (tabel 2). Bovendien, vergelijkbaar met de complexe RvB1/B2, vonden we twee inter moleculaire cross-links tussen twee kopieën van de grote subeenheid van de CPS. Deze cross-links plaats de twee grote subeenheden tegenover elkaar aan de zijkanten van hun C-terminal. In een eerdere studie, structurele Spectrometrie van de massa en computationele modellering35, combineren wij drie extra interacties in de grote subeenheid die waarschijnlijk afkomstig van de interface van twee exemplaren van de grote subeenheid gevalideerd zijn door geïdentificeerd de kristalstructuur en de verkregen model (figuur 4C en tabel 2). Deze interacties kunnen de rangschikking van de CPS-kern complex bestaande uit vier grote subeenheden. Echter werden geen Inter subeenheid cross-links tussen de kleine en de grote subeenheden waargenomen. Door de inspectie van de beschikbare kristalstructuur (figuur 4C), blijkt dat het oppervlak van de interactie tussen het tetramere kern van het complex, bestaande uit de grote subeenheid, en de perifere kleine subeenheden erg klein is, wat kan verklaren de afwezigheid van Inter subeenheid interacties. Dit wordt bevestigd door inheemse massaspectrometrie, waaruit bleek dat de kleine subeenheid gemakkelijk van de meest waarschijnlijk te wijten aan een kleine bindende interface intact complexen distantieert. Niettemin laten eiwitinteractie in de CPS complexe combinatie van chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie afleiden van hun structurele regeling (Figuur 4 d).
Samen genomen, kunt de combinatie van inheemse Spectrometrie van de massa en chemische dwarsbinding in combinatie met massaspectrometrische identificatie van kruislings gekoppelde peptides, reconstitutie van de structurele regeling van beide voorbeeld complexen. Terwijl chemische dwarsbinding geopenbaard regeling van de subeenheden van eiwit, bijvoorbeeld de interactie tussen RvB1 en RvB2 of binnen het tetramere kern van CPS, Spectrometrie van de massa van de inheemse proteïne stoichiometries van de intact complexen geleverd en voorkomende subcomplexes. In het geval van CPS, waarvoor geen Inter moleculaire interacties tussen de twee subeenheden kon worden waargenomen door chemische dwarsbinding, suggereert inheemse massaspectrometrie dat elke grote subeenheid met een kleine subeenheid (Figuur 4 d samenwerkt). De Spectrometrie van de massa van de tandem voorgesteld de perifere ligging van de kleine subeenheid in het complex en een kleine interface tussen beide subeenheden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figuur 1: Workflow van inheemse Spectrometrie van de massa en dwarsbinding. Beide technieken leveren aanvullende resultaten. Hoewel inheemse massaspectrometrie stoichiometries en interactie modules onthult, geeft dwarsbinding inzicht in de eiwit interactie sites binnen de complexen. Merk op dat chemische dwarsbinding alleen binaire interacties onthult. (A) de eerste stap in native massaspectrometrie is buffer uitwisseling naar een buffer van het vluchtige en waterige met filter eenheden of gel filtratie kolommen. De Spectrometrie van de massa van de intact eiwitcomplexen dan openbaart hun stoichiometrie. In tandem massaspectrometrie experimenten, worden perifere subeenheden losgekoppeld. (B) voor chemische dwarsbinding, is het eiwit complex geïncubeerd met een cross-linking reagens. De kruislings gekoppelde eiwitten zijn vervolgens verteerd in peptiden die worden vervolgens geanalyseerd door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figuur 2: SDS-pagina van kruiselings gekoppelde RvB1/B2 (A) en CPS (B) complexen. (A) 2,5 µM RvB1/B2 werden geladen per rijstrook van de gel. De concentratie van BS3 was gevarieerd. Non-cross-linked RvB1/B2 toont de twee eiwitten subeenheden op ongeveer 50 kDa. Toevoeging van BS3 veroorzaakt covalente koppeling van de eiwit-subeenheden resulterend in eiwit bands op hoger molecuulgewicht. Het bedrag van kruislings gekoppelde soorten wordt verhoogd met hogere BS3 concentraties. Optimale cross-linking omstandigheden zijn gemarkeerde (rood). (B) 10 µM CPS werden geladen per rijstrook van de gel. De grote (90 kDa) en kleine (40 kDa) CPS subeenheden worden verkregen. Toevoeging van BS3 veroorzaakt covalente koppeling van de eiwit-subeenheden resulterend in eiwit bands op hoger molecuulgewicht. Optimale cross-linking omstandigheden zijn gemarkeerde (rood). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figuur 3: Native Spectrometrie van de massa en chemische dwarsbinding RvB1/B2 complexe. (A) de inheemse massaspectrum onthult twee soorten RvB1/B2; de intacte dodecamer (d.w.z., (RvB1)6(RvB2)6) op ongeveer 11.000 tot 12,000 m/z en de hexameer ring (RvB1)3(RvB2)3 op ongeveer 8000 m/z. Beide soorten tonen twee populaties die voortvloeien uit zijn-gelabeld en niet-gecodeerde RvB2. Het spectrum is gewijzigd van35. (B) het kristal structuur van RvB1/B2 blijkt (VOB-ID 4WVY). Wisselende RvB1 en RvB2 vormen subeenheden twee hexameer ringen. (C) fragmentatie spectrum van een kruislings gekoppelde di-peptide. De N-terminus van RvB1 was kruislings gekoppelde met K23 van RvB1 y-ion serie werden verkregen voor beide peptides (rood en cyaan). (D) Intra - en intersite - protein interacties verkregen in het complex van de RvB1/B2. Intra-Cross-Country-links worden weergegeven in het rood, inter-cross-links in blauw worden weergegeven. De insert toont twee inter moleculaire cross-links tussen RvB1 en RvB2 subeenheden die kunnen worden gevisualiseerd in de kristalstructuur (groen, insert). Interacties die afkomstig van twee exemplaren van de RvB2 zijn worden weergegeven als blauwe stippellijnen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figuur 4: Native Spectrometrie van de massa en chemische cross-linking van CPS. (A) de inheemse massaspectrum van CPS toont drie complexen. De hetero-dimeer (160 kDa), hetero-tetrameer (320 kDa) en de hetero-octamer (640 kDa). Het spectrum is gewijzigd van35. (B) Tandem Spectrometrie van de massa van het tetramere en octameric CPS complexe geopenbaarde dissociatie van de kleine subeenheid van de CPS. (C) het kristal structuur van CPS wordt weergegeven (VOB-ID 1BXR). De grote subeenheden vormen een tetramere kern en de kleine subeenheden bevinden zich in de periferie van het complex. Inter moleculaire cross-links tussen twee kopieën van de grote subeenheid staan (groen). (D) de interacties van de grote en kleine CPS subeenheden. Native Spectrometrie van de massa geopenbaard subcomplexes en stelt een perifere ligging van de kleine subeenheid. Chemische cross-links aanwijzingen omtrent in het tetramere kern van CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Tabel 1: Database zoekresultaten. De eiwitten werden geïdentificeerd door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie en de database te zoeken. De namen van eiwit, toetreding nummer, omschrijving alsmede eiwit massa krijgen. De eiwit-score, aantal waargenomen spectra per eiwit, en het aantal waargenomen peptide reeksen zijn opgenomen. De vijf peptiden met hoogste mascotte peptiden scores staan voor elke subeenheid van het eiwit. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Tabel 2: Cross-links waargenomen in RvB1/B2 en CPS. De subeenheden van de complexen en de kruiselings gekoppelde residuen worden gegeven. Het soort kruislings gekoppelde (intra - of inter moleculaire) werd geopenbaard uit overlappende peptide reeksen of een eerdere studie35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...