Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

אנו מודים עמיתינו לדיונים מועיל. אנו מודים גם Ilme Schlichting, Hopfner קרל-פיטר לאספקת חלבון תסביכים. אנו להכיר מימון ממשרד הפדרלי עבור חינוך ומחקר (BMBF, זיק התוכנית, 03Z22HN22), את אירופה אזורי פיתוח קרנות (EFRE, ז/2016/04/78115), את MLU האלה-ויטנברג C.S., מימון טרסט (109854/658 Z/15/Z) כדי אקולוגיה

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקולים ניתנים עבור מסה ספקטרומטר מבוססי ניתוח מבנה של מתחמי יחידה משנית רב חלבון. שתי הטכניקות, שמתואר הפרוטוקול, בעיקר לספק תוצאות משלימים, מותאמים במיוחד כדי לקבל תובנות לגבי הסידורים מבניים בתוך חלבון (-ליגנד) מתחמי אשר קשה ללמוד על ידי טכניקות מבניים שגרתיות. ספקטרומטר מסה יליד מספק תובנות חלבון stoichiometries, כמו גם אינטראקציות חלבון על-ידי ניתוח subcomplexes ומודולים אינטראקציה יציב. Cross-linking, מצד שני, התשואות מידע באתרי קשר ישיר. בהתאם מחדש פעם, גמישות מסוימת יכולים או צריכים להיכלל הניתוח.
הפרוטוקולים שסופקו הם באופן כללי קל לביצוע, לא גוזלת זמן. פרוטוקול כולה יכולה להתבצע תוך שבוע, ניתן להחיל על מתחמי כמעט כל חלבון, אמנם, סכום מסוים של החלבונים הדרושים לניתוח מוצלח. הכנת הדוגמא היא פשוטה, לא דורשת במפורש חלבון מטוהרים מתחמי. עם זאת, אחד מכשול נפוץ הוא זיהום של המדגם במהלך הכנת הדוגמא לזיהוי חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה. אלה מציג ברוב המקרים כוללים keratins אשר מקורן אבק, העור או השיער. לכן, טיפול נוסף כגון לובש כפפות, חלוקים, filtrating מאגרי מימית, ושימוש טוהר גבוהה ממיסים יש לנקוט במהלך הכנת הדוגמא לזיהוי חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה. לחלבונים מזהמים אחרים כגון מלווים בדרך כלל הציג במהלך טיהור חלבון, למשל, כאשר באמצעות תגי קירבה. במקרים אלה, טיהור חלבון צריך להיות שיפור, למשל על ידי הגדלת כביסה צעדים. בכל מקרה, חלבון מציג במדגם בקלות מזוהים במהלך החיפוש מסד נתונים על-ידי השמטת את המסנן טקסונומיה (קרי, חיפוש נגד חלבונים של כל המינים). אם רק כמה פפטידים שנצפו (קרי, כיסוי חלבון נמוכה יכול להשיג), אף-על-פי מדגם מספיק זמין, שיהיה צורך להשתמש proteinase שונים במהלך תהליך העיכול. באופן כללי טריפסין מניב מספר מספיק של פפטידים; עם זאת, במקרים מסוימים כגון קרום חלבונים או קרום תחומים של חלבונים, מספר האתרים פצילות tryptic מצטמצם, אנזימים אחרים מיקוד חומצות אמינו הם בחירה טובה יותר.
מבחינת המכשור, נגינה שונה במיוחד נדרש יליד ספקטרומטר מסה אשר שומרת על אינטראקציות אי-קוולנטיות במהלך העברת לשלב-הגז. מספר סוגי כלי הוכנסו, כולל מכשירים Q-תוף ו- orbitrap. בעוד ששונה Q-תוף ספקטרומטרים המוני זמינים מסחרית עבור ילידי ספקטרומטר מסה מאז מספר שנים, האחרון רק לאחרונה הוכנסו ודורשים ברוב המקרים השינוי מיוחדים45. עם זאת, היישום של כלים ברזולוציה גבוהה מותר ללמוד קשירה של ליגנדים מרובים ו46,שלהם כימות47 , הוא מבטיח עבור יישומים עתידיים.
כדי לזהות di צולבים-פפטידים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית, ניתן ליישם נהלי עם כמה שינויים. עם זאת, החיפוש מסד נתונים הוא הגורם המגביל כפי תוכנות מיוחדות רק לעתים רחוקות יכול להתמודד עם מסדי נתונים גדולים, והוא מופחת מסדי נתונים המכיל את החלבוניות של מתחמי נדרשים. מחקרים שנעשו לאחרונה בשימוש cross-linkers מסה ספקטרומטר-cleavable מיקוד אינטראקציות חלבון ב התא כולו lysates48,49. שימוש cross-linkers כימיים, זה קטע בניסויים ספקטרומטר מסה טנדם בעיקר התשואות ליניארי פפטידים (שונה על-ידי מחדש), אשר יכול להיות מזוהה על ידי פיצול נוסף ומפחיתה את מסד הנתונים חיפוש של פפטידים ליניארי, וזה חיפוש חיפוש חישובית מרחב וזמן. עם זאת, לביצוע הניסויים, מנתח המונית של מלכודת יונים או ספקטרומטר מסה היברידית עם מלכודת יונים נדרש. באופן כללי, כמו שווא-תוצאות חיוביות גם נושא חשוב, ספקטרה המונית של פפטידים צולבים לעיתים קרובות אומתו באופן ידני על פי איכות שלהם ספקטרה פרגמנט אשר מרחיב את זמן ניתוח נתונים והצרפתית. פיתוח מערכות הניקוד חזקה שניתן להחיל ללא עוד צעדים אימות ולכן הם יישומים אפשריים בעתיד. דרך אחת לשפר את ניתוח נתונים וכדי להקטין את מספר חיובי השווא היה כניסתה של חישובי שיעור גילוי שקר ויישומם cross-linking ערכות נתונים50.
באופן כללי, מהטכניקות שתוארו כאן יכול בכשלי בטכניקות ספקטרומטר מסה נוספת (למשל, תיוג קוולנטיות) כדי להגדיל את הפלט של הניתוח. שינויים ושיפורים אחרים של הפרוטוקולים ניתן ליישם בקלות. ככזה cross-linking השוואתי34 פורמת הסתגלותי שינויים בהרכבה חלבון. התפתחויות נוספות ספקטרומטריית יליד כיום לאפשר הניתוח של קרום חלבונים51,52 והאינטראקציה שלהם עם שומנים28,52,53,54 . פיתוחים חדשים של ספקטרומטרים המוני ברזולוציה גבוהה עבור ילידי ספקטרומטר מסה הרחיבו את היישום, איגוד ליגנד, למשל, איגוד של ליפידים קרום חלבונים, כעת ניתן לכלול ניתוח45, 46. בשילוב עם גישות דוגמנות חישובית, טכניקות אלה יכולים לספק מודלים מבניים של שינוי רזולוציה55. אם אין מבנים קריסטל זמינים עבור subunits ללא פגע מורכבות או יחיד, ספקטרומטר מסה יכול לספק תובנות הראשון אינטראקציות חלבון ואת הטופולוגיה של המתחם לא ידוע. בהתאם של טכניקות השתמשו התוצאות המתקבלות, מודלים ברזולוציה נמוכה של המתחם לא ידוע ניתן להשיג56,57,58. אם קריסטל מבנים או הומולוגיה דגמים זמינים, המידע המבני שהתקבל ספקטרומטר מסה יכולות להניב אפילו קרובה לשפת אם מודלים59.
לעומת טכניקות מבניים אחרים, ספקטרומטר מסה יש היתרון כי היא דורשת כמויות מדגם נמוך, הוא יכול להתמודד עם דגימות הטרוגנית, החלים על חלבון קומפלקסים של גודל ללא הגבלה. בנוסף, ספקטרומטר מסה מאפשר החקירה של חלבון דינמי מערכות. אוכלוסיות שונות של חלבון או החלבונים הקיימות בפתרון בדרך כלל מנותחים יחד, לכן, שלא כמו עם טכניקות מבניות אחרות הדורשות מבחר של אוכלוסיות מסוימות, שכל הייצורים החיים נשמרים במהלך ניתוח והם למהירים בניסוי אחד. גישות cross-linking כמותית היו הציג לאחרונה34,60,61 , מבטיחים עבור יישומים עתידיים המתאר שינויים הסתגלותי בתנאים שונים.

החקירה מבנית של חלבון הרכבות הפך חשוב במיוחד להבנת תהליכים תאיים. כתוצאה מכך, רבים, טכניקות יש כבר פיתח ומשופר ביולוגיה מבנית1. עם זאת, שיטות אלה מוגבלים לפעמים ביישום שלהם עקב גודל, גמישות או הטרוגניות של מתחמי חלבון תחת חקירה. ספקטרומטר מסה יכולה להתמודד עם האתגרים הללו ו, לכן, הגיח ככלי רב עוצמה ביולוגיה מבנית2,3,4,5. היתרון הגדול ביותר של ספקטרומטר מסה, עם זאת, היא היכולת לזהות חלבונים אפילו בתערובת הטרוגנית ומורכבת6חד משמעית. למטרה זו, חלבונים מתעכלים בדרך כלל עם endoproteinases ואת התערובת המתקבלת פפטיד הוא המופרדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, eluted ישירות לתוך ספקטרומטר מסה. פפטיד גושים לאחר מכן נקבע, קודמן יונים שנבחרו עבור פיצול נוסף של פפטידים. חלבונים מזוהים ואז על ידי חיפוש פפטיד וגושים שבר המתאים מול מסד נתונים הידועים. הליך זה מאפשר לא רק הזיהוי של פפטידים/חלבונים, אלא גם את השינויים post-translational אשר גורמים לשינוי בנפח גדול של פפטידים של קודמן, היונים פרגמנט נושאת את השינוי7. כמה מן הטכניקות רבים מבני ספקטרומטריית מבוססים על העיקרון הזה,4,8. למשל, תיוג טכניקות כגון מימן דאוטריום exchange9,10, כימי תיוג אסטרטגיות11,12, או רדיקלי הידרוקסיל רגליים ההדפסה13,14 , לתת תובנות הנגישות משטח של החלבונים בתנאים מסוימים.
טכניקה נוספת היא (כימית) cross-linking מעורבים ניגודים קוולנטיות חומצות אמינו בסמיכות דרך קבוצות פונקציונליות שלהם. בשביל זה, ריאקטיבים כימיים, ריאגנטים UV-activatable, או חומצות אמינו הם מועסקים15,16. לאחר cross-linking, החלבונים הם בדרך כלל הידרוליזה עם פרוטאזות, di צולבים-פפטידים מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית. הזיהוי של cross-linking מוצרים על-ידי מסד חיפוש, לעומת זאת, מחייב שימוש תוכנות מיוחדות אשר לשרשר פפטיד רצפים של חלבונים שונים באזורים שונים17,18,19. שימוש cross-linkers כימיים יש יתרון שזה יכול להיות מועסק מתחם חלבון כמעט בכל עניין, לא דורשת שילוב של חומצות אמינו UV-activatable, אשר תושג רק כאשר הבעת החלבון עניין בתוך התאים המארחים. ככזה, cross-linking הוא כלי רב-תכליתי, הועסק בהצלחה במחקרים מבניים רבים של חלבונים גדולים הרכבות20.
ספקטרומטר מסה של חלבון שלם מתחמי (מכונה לעתים 'מקורי' ספקטרומטר מסה), לעומת זאת, כולל הניתוח של חלבונים שלמים, מתחמי חלבון ללא הידרוליזה לתוך פפטידים. היא מגלה קומפוזיציה, הטרוגניות, סטויכיומטריה, טופולוגיה, יחידת משנה אינטראקציות של חלבונים מתחמי21,22. בשילוב עם יון ניידות, יליד ספקטרומטר מסה נוספת מאפשרת קביעה של23,שלהם קונפורמציה24. דבר זה הופך לכלי רב עוצמה החקירה מבנית של מתחמי חלבון שקשה להעריך על ידי טכניקות מבניים שגרתיות. עם זאת, יליד ספקטרומטר מסה מחייבת ניתוח מאגרי המקיימות אינטראקציות חלבון קשרי ערכיות במהלך ספקטרומטריית electrospray יינון. זו מושגת בדרך כלל על-ידי שימוש מאגרי מימית, נדיפים כגון אמוניום אצטט25. בנוסף, מכשיר שינויים נחוצים למנוע דיסוציאציה במהלך שידור לתוך השלב גז של ספקטרומטר מסה26. החלת בדרך זו, נותחו רבים מתחמי חלבון (גדול). הדוגמאות המרשימות הם המחקרים של ריבוזומים שלמים27, ATP synthases28או וירוסים29.
השילוב של יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking הוכיח מוצלח במיוחד במחקרים קודמים. למשל, stoichiometries של מתחמי המלווה, כולל דיימר Hsp70 לא צפויה, יכול להיות המתקבל ניסויים ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם, בעוד cross-linking כימי חשף את הסידורים של החלבונים ב הרכבות30,31. במחקר אחר, ההשפעות של שינויים post-translational שלם ATP סינתאז מורכבים נחקרו. ספקטרומטר מסה יליד מסופקים תובנות יציבות קומפלקס חלבונים נוכחות או היעדרות של32,של זרחון או acetylation-33. השוואתי cross-linking אסטרטגיה34 גילה הסתגלותי שינויים של החלבונים בתנאים שונים.
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקולים לזיהוי חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה cross-linking (כימית), יליד ספקטרומטר מסה, כולל ניתוח נתונים ופרשנות (איור 1). השילוב של תוצאות משלימים המתקבל בשיטות אלה בעזרת שני מתחמי חלבון מאופיין היטב הוא והפגינו35. פרוטוקול שלנו ניתן ליישם כל הרכבה חלבון אשר יכול להיטהר על טוהר של ריכוז מסוימים. הגישה במקרים מסוימים מוגבל על ידי ניתוח נתונים של cross-linking נתונים, קרי, גודל מסד הנתונים של מועסק, אשר קובע את הזמן והמרחב נדרש חיפוש. בנוסף, אימות ידני של חוצה קישורים מזוהה לעתים קרובות נדרש, מקטין עוד יותר את הפלט. ספקטרומטר מסה מקורית בעיקר מוגבל על ידי דגימת איכות, למשל, מאגרים, adducts נהגה במהלך טיהור ועל האפשרות להחליף אותם על ידי מאגרי מימית ולא יציבה. עם זאת, מתחמי חלבון מטוהרים עבור ניתוח מבנה בדרך כלל יש את האיכות הנדרש לצורך ניתוח מוצלח עם פרוטוקולים שלנו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

חלבונים אינטראקציה עם שלהם ליגנדים ל טופס פעיל ודינמי הרכבות שמבצעים תאיים שונים. אינטראקציות אלה שחקרתי לכן יסוד על ההבנה של תהליכים תאיים. עם זאת, רבים מתחמי חלבון הרכבות דינמיות הינם אינם נגישים באמצעות טכניקות מבניים שגרתיות. ספקטרומטר מסה תורמת החקירה מבנית של מהרכבות אלה, במיוחד את השילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric מספק תובנות לתוך הסידור מבניים שלהם.
במאמר זה, אנו מתארים את יישום, שילוב של שתי טכניקות המוני spectrometric משלימים, כלומר cross-linking כימי בשילוב עם ספקטרומטר מסה, יליד ספקטרומטר מסה. Cross-linking כימי כרוך ניגודים קוולנטיות חומצות אמינו בסמיכות באמצעות ריאקטיבים כימיים. לאחר העיכול עם פרוטאזות, di צולבים-פפטידים מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה, אתרי אינטראקציות חלבון חשופה. ספקטרומטר מסה מקורית מצד הוא הניתוח של חלבון שלם הרכבות בשלב גז של ספקטרומטר מסה. היא מגלה stoichiometries חלבון, כמו גם אינטראקציות חלבון וליגנד. בשתי הטכניקות ולכן מספקים מידע משלים על המבנה של החלבון-ליגנד הרכבות, שילוב שלהם הוכיח עוצמה במחקרים קודמים.

ניתוח מבנה של חלבונים ו את מתחמי שהם יוצרים הוא יסוד להבנת תפקידם. ספקטרומטר מסה תורמת במידה ניכרת החקירה מבניים כי זה יכול להיות מיושם כמעט בכל מתחם עניין ללא קשר לגודל או מדגם הטרוגניות. להדגים לנו את הפרוטוקול באמצעות שני מתחמי חלבון מאופיין היטב; ראשית, הטרו-dodecamer RvB1/B2 thermophilum ג ו שנייה, CPS הטרו-octameric מורכבים מ- e. coli.
ראשית, זיהינו את מרכיבי החלבון שני מתחמי. בשביל זה, החלבונים היו מופרדים על ידי עמודים מרחביות (איור 2), ג'ל להקות נחתכו של הג'ל. לאחר עיכול בתוך ג'ל של החלבונים, התערובת פפטיד נותחה על ידי ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית, ההמונים פפטיד, פרגמנט היו נתונים לחיפוש מסד הנתונים. בעקבות זרימת עבודה זו, זיהינו כל החלבוניות של שני מתחמי עם ביטחון עצמי גבוה, קרי, מספר גבוה של פפטידים עם ציונים סבירים פפטיד נצפתה מניב רצף גבוה כיסוי עבור כל החלבוניות (טבלה 1 ).
ואז ניתחנו את ללא פגע RvB1/B2 מורכבים באמצעות ספקטרומטר מסה מקורי (איור 3 א). הקשת המוני חשף שני מינים, אחד בכל כ 8,000 מ/z ו זן אחר-כ 11,000-12,000 מ/z. ההמונים מחושב עבור מינים אלה תואמים את הטבעת3 3(RvB2) hexameric (RvB1) (כ 310 kDa) ו dodecameric שתי טבעות (RvB1)6(RvB2)6 (כ- 620 kDa). סדרת הפסגה בשני להראות שתי האוכלוסיות; אלה מקורן תערובת של subunits RvB2 שלו מתויגים ולא מתויגים, מתחמי. מבנה הגביש עבור RvB1/B2 מורכבים בעבר הושג36 , מציג את הסידור של הטבעת הכפול (איור 3B). הספקטרום המוני מקורית ולכן מאשרת את סטויכיומטריה של dodecamer שלמות, יתר על כן מגלה תת קומפלקס יציב. בנוסף, אוכלוסיות הקיימים מזוהים.
כדי לזהות אתרי אינטראקציית חלבון במתחם RvB1/B2, אנחנו מבחינה כימית קישורים צולבים המתחם מטוהרים עם BS3 מחדש. קודם, אנחנו טיטרציה את כמות BS3 במהלך התגובה cross-linking כדי לקבוע ריכוז אופטימלי. BS3 הוא ספציפי אמין covalently קישורים ליזין לצד שרשראות וכן N-טרמיני של חלבונים. התגובה cross-linking בעקבות מרחביות-דף (איור 2 א). המתחם שאינם מקושרים הצלב הראה subunits הן RvB1 והן RvB2. הוספת BS3 לתערובת התגובה גרמה קוולנטיות הצמדה של החלבונים וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. הג'ל מרחביות מראה כי כמויות הולכות וגדלות של BS3 להניב כמויות גבוהות יותר של מינים צולבים בזמן שאינם מקושרים הצלב החלבוניות מופחתים. אנחנו לאחר מכן לחתוך את להקות חלבון בג'ל, עקב פרוטוקול הכלול לעיל כדי לזהות אתרי אינטראקציית חלבון. הספקטרום דוגמה של די-פפטיד צולבים מוצג (איור 3C). הספקטרום מציג סדרת y-יון של שני פפטידים המאשרת את אינטראקציית חלבון. בסך הכל, השגנו אינטראקציות חלבון 14, כולל ארבעה חוצה קישורים בין שני חוצה קישורים בין שני עותקים של RvB2 subunits RvB1 ו- RvB2 (טבלה 2). התוצאות של BS3 cross-linking הם דמיינו ברשת אינטראקציה (איור 3D) מציג האינטראקציות התוך מולקולרית, כמו גם אינטראקציות בין subunits שונים. אינטרה-מולקולרית חוצה קישורים מראים כי הן RvB1 והן RvB2 subunits מקפלים דרך כי N - ו C-מסוף תחומים הן בסמיכות. שימו לב, כי האינטראקציות התוך המולקולרי לא יכול להבחין בין האינטראקציות הבין-מולקולריות של יחידת משנה אותו במקרה זה. בנוסף נצפו הבין-מולקולרי חוצה קישורים בין שני subunits. אלה, שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין RvB1 לבין RvB2 יכול ניתן לאבחן במבנה אימות הגישה cross-linking. חוצה קישורים בין-מולקולריים אחרים נמצאים בלולאות גמיש אשר אינם כלולים למבנה הגבישי. זיהינו גם חוצה קישורים שני ב RvB2 המכיל את רצפי פפטיד זהה. חד משמעית ניתן לסווג אלה חוצה קישורים כמו הבין-מולקולריים כפי שהם חייבים מקורם שני עותקים של החלבון אותו (דמות תלת-ממד). ניסויים cross-linking שלנו לחשוף אתרים אינטראקציית חלבון בתוך המתחם, אלא גם בתוך את החלבוניות לספק תובנות הסידור מבניים שלהם, זה גם יכול להיות מאושרות על ידי המבנה הקיים קריסטל (איור 3B).
המתחם החלבון השני שלמדנו היה CPS. הקשת המוני מקורי (איור 4A) חשף שלושה מתחמי חלבון בין 6,000 ו- 12,000 מ/z. המתחם הגדול של 640 kDa מקביל הטרו-octamer ללא פגע. מתחמי קטן יותר מייצגים שני מתחמי משנה; דימר של קטנים וגדולים CPS subunits (160 kDa), הטרו-tetramer המכיל שני עותקים של כל יחידה משנית (320 kDa). מתחמי משנה אלה לספק תובנות הראשון לתוך מכלול חלבון; כלומר, subunits קטנים וגדולים במגע ישיר (כפי הנגלית הטרו-דימר), tetramer יכול להיות תוצר של הדימרים שני. כדי לקבל מידע נוסף על ההסדר המבני ב- CPS שלמים מורכבים, ביצענו ספקטרומטר מסה טנדם (MS/MS) של הטרו-octamer, הטרו-tetramer. בשני המקרים, יחידת משנה קטנים לזהויות של קודמן רומז כי יחידת משנה קטן ממוקם בפריפריה של ההרכבה (איור 4B). אכן, יחידת משנה קטן הוא היקפי ב- מבנה (איור 4C) קריסטל זמין44.
בוצעה גם כימי cross-linking שימוש מחדש את BS3. באמצעות הגדלת כמויות, ניגודים קוולנטיות subunits CPS היה משופר. לאחר עיכול החלבונים וניתוח של פפטידים כמתואר לעיל, אינטראקציות חלבון רבים בתוך יחידת משנה גדולה של קישור אחד ב יחידת משנה קטנים התקבלו (טבלה 2). בנוסף, בדומה RvB1/B2 מורכבים, מצאנו שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין שני עותקים של יחידת משנה גדולה CPS. חוצה קישורים אלה מניחים את subunits גדול שני הניצבים זה מול זה על צדם C-מסוף. במחקר הקודם, שילוב ספקטרומטר מסה מבניים דוגמנות חישובית35, זיהינו שלושה נוספים באינטראקציה יחידת משנה גדולה שהיא כנראה מקורן הממשק של שני עותקים של יחידת משנה גדולה אומת על-ידי מבנה הגביש והן מהמודל שהושג (איור 4C ו לטבלה 2). אינטראקציות אלה מאפשרים את הסידור של הליבה CPS מורכבים בהיקף של ארבע subunits גדולים. אולם, נצפו לא חוצה קישורים בין יחידת משנה בין הקטנים של subunits גדול. על-ידי בדיקה של מבנה גבישי זמינים (איור 4C), מתברר כי השטח האינטראקציה בין הגרעין tetrameric של המתחם, המורכב של יחידת משנה גדולה, ו את היקפי subunits קטנה הוא קטן מאוד, מה שיכול להסביר העדר של אינטראקציות בין-יחידה משנית. זה אושר על ידי ילידי ספקטרומטר מסה אשר הראו כי יחידת משנה קטנים בקלות dissociates מ מתחמי שלם ככל הנראה עקב ממשק איגוד קטן. למרות זאת, אינטראקציות חלבון ב- CPS מורכבות משולבות cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה אפשר להסיק מסקנה הסידור שלהם מבניים (איור 4D).
יחדיו, השילוב של יליד ספקטרומטר מסה כימי cross-linking יחד עם המוני spectrometric זיהוי של פפטידים צולבים, מאפשרת שיחזור של ההסדר המבני של שני מתחמי דוגמה. בעוד cross-linking הכימי גילה סידור החלבוניות, למשל את האינטראקציות בין RvB1 לבין RvB2 או בתוך תוכו tetrameric של CPS, יליד ספקטרומטר מסה נמסר חלבון stoichiometries של מתחמי ללא פגע, subcomplexes נפוצה. במקרה של CPS, שעבורם אין האינטראקציות הבין-מולקולריות בין subunits שני יכול להיות שנצפו על ידי, cross-כימי linking ספקטרומטר מסה מקורי עולה כי בכל יחידה משנית גדולה אינטראקציה עם יחידת משנה קטן אחד (איור 4D). ספקטרומטר מסה טנדם הציע את מיקומה יחידת משנה קטנים המתחם, ממשק קטן בין שני subunits.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> איור 1: זרימת העבודה של יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking. בשתי הטכניקות לספק תוצאות משלימים. בעוד ספקטרומטר מסה מקורי חושף stoichiometries ומודולים אינטראקציה, cross-linking נותן תובנות האתרים אינטראקציית חלבון בתוך מתחמי. שימו לב כי כימי cross-linking רק חושף אינטראקציות בינארי. (א) בשלב הראשון של יליד ספקטרומטר מסה הוא מאגר exchange למאגר הפכפך ולא מימית באמצעות יחידות סינון או ג'ל סינון בעמודות. ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ואז מגלה סטויכיומטריה שלהם. בניסויים ספקטרומטר מסה טנדם, ציוד היקפי subunits הם חלופה מועדפת. (B) עבור, cross-כימי linking מודגרת החלבונים עם ריאגנט cross-linking. החלבונים צולבים מתעכלים ואז לתוך פפטידים אשר לאחר מכן מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> איור 2: מרחביות-עמוד קישורים צולבים RvB1/B2 (א) ו- CPS (ב) מתחמי. (א) 2.5 מיקרומטר RvB1/B2 היו טעונים לכל ליין ג'ל. הריכוז של BS3 היו מגוונים. Non-קרוס-מקושרים RvB1/B2 מציג את שני החלבוניות כ 50 kDa. תוספת של BS3 גרם להצמדת קוולנטיות החלבוניות וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. כמות המינים צולבים מתגברת עם ריכוז גבוה של BS3. תנאים אופטימליים cross-linking הם מסומנים (אדום). (B) 10 מיקרומטר CPS היו טעון לכל ליין ג'ל. גדול (90 kDa) וקטנים (40 kDa) CPS subunits מתקבלים. תוספת של BS3 גרם להצמדת קוולנטיות החלבוניות וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. תנאים אופטימליים cross-linking הם מסומנים (אדום). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> איור 3: יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking הכימית של RvB1/B2 מורכבים. (א) הספקטרום המוני מקורי חושף שני מינים של RvB1/B2; שלמה dodecamer (קרי, (RvB1)6(RvB2)6) כ 11,000 עד 12,000 מ/z ו- hexameric הטבעת (RvB1)3(RvB2)3 כ 8,000 מ/z. בשני המינים מציגות שתי האוכלוסיות הנובע RvB2 שלו מתויגים ולא מתויגים. הספקטרום שונתה35. (B) הקריסטל מבנה של RvB1/B2 מוצג (מזהה PDB 4WVY). לסירוגין RvB1 ו RvB2 subunits בצורת שתי טבעות hexameric. (ג) פיצול הספקטרום של די-פפטיד צולבים. N-הסופית של RvB1 היה צולבים עם K23 של RvB1. y-יון סדרת התקבלו עבור שני פפטידים (אדום, כחול-ציאן). (ד) protein אינטרה בין אינטראקציות שהושג במתחם RvB1/B2. Intra-cross-קישורים מוצגים באדום, inter-cross-links מוצגים בכחול. הוסף מראה שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין subunits RvB1, RvB2, אשר יכול, ניתן לאבחן במבנה קריסטל (ירוק, הוספה). אינטראקציות שמקורן שני עותקים RvB2 מוצגים כקווים מנוקדים כחולים. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> איור 4: יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking כימי של CPS. (א) הספקטרום המוני מקורית של CPS מראה שלושה מתחמי. הטרו-דיימר (160 kDa), הטרו-tetramer (320 kDa), הטרו-octamer (640 kDa). הספקטרום שונתה35. (B) טנדם ספקטרומטר מסה tetrameric ו- octameric CPS מורכבים חשף הדיסוציאציה של יחידת משנה קטנה CPS. (ג) הקריסטל מבנה של CPS מוצג (מזהה PDB 1BXR). Subunits גדול יוצרים גרעין tetrameric, subunits קטנים הממוקמים בפריפריה של המתחם. הבין-מולקולרי חוצה קישורים בין שני עותקים של יחידת משנה גדולה מוצגים (ירוק). (ד) אינטראקציות של subunits CPS קטנים וגדולים. ספקטרומטר מסה מקורי חשף subcomplexes ומציעה ממיקום היקפיים יחידת משנה קטנים. חוצה קישורים כימי מצביעים על הסדרי tetrameric הליבה של CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
טבלה 1: תוצאות חיפוש במסד הנתונים. החלבונים אותרו באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית וחיפוש במסד הנתונים. השמות חלבון, ההצטרפות מספר, ואת תיאור, כמו גם חלבון מסה ניתנת. התוצאה חלבון מספר התצפיות ספקטרה לכל חלבון, מספר רצפי פפטיד שנצפה מפורטים. פפטידים חמש עם הציונים הגבוה של פפטידים הקמע מפורטים עבור כל יחידת משנה של חלבונים. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
בטבלה 2: חוצה קישורים שנצפתה RvB1/B2 ו- CPS. מקבלים את subunits את מתחמי, משקעי צולבים. סוג קישור (אינטרה - או הבין-מולקולרי) התגלה רצפים פפטיד חופפים או המחקר הקודם של35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...