Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Vi takker våre kolleger for nyttig diskusjoner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for å gi protein komplekser. Vi erkjenner finansiering fra det føderale ministeriet for utdanning og forskning (BMBF, sikk program, 03Z22HN22), den europeiske Regional utvikling midler (EFRE, ZS/2016/04/78115) og den MLU Halle-Wittenberg CS og finansiering fra Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) til A.P.

Forfatterne ikke avsløre.

Protokoller gis for masse massespektrometri-baserte strukturelle analyser av flere delenhet protein komplekser. De to teknikkene, beskrevet i protokollen, hovedsakelig gir utfyllende resultater og er godt egnet til å få innsikt i de strukturelle ordningene innenfor protein (-ligand) komplekser som er vanskelig å studere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri gir innsikt i protein stoichiometries samt protein interaksjoner ved å analysere subcomplexes og stabil samhandling moduler. Cross-Linking, derimot, gir informasjon om direkte kontakt nettsteder. Avhengig av kryss-linker brukes, en viss fleksibilitet kan eller bør inkluderes i analysen.
De angitte protokollene er generelt lett å utføre og ikke tidkrevende. Hele protokollen kan utføres innen en uke og kan brukes til nesten alle protein komplekser, selv om en viss proteinet er nødvendig for vellykket analyse. Eksempel forberedelse er enkelt og krever ikke spesielt renset protein komplekser. Men er en vanlig fallgruve forurensning av prøven under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Disse forurensing i de fleste tilfeller inkluderer keratins som stammer fra støv, hud og hår. Derfor ekstra forsiktighet som seg hansker og labfrakker, filtrerende egenskaper vandig buffere, og bruker høy renhetsgrad løsemidler bør tas under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Andre skadelige proteiner som chaperones er vanligvis introdusert under protein rensing, f.eksved affinitet koder. I disse tilfellene bør protein rensing forbedres, for eksempel ved å øke vask trinnene. I alle fall protein forurensing i utvalget er lett identifiseres under databasen søket ved å utelate taksonomi filteret (dvs.søke mot proteiner fra alle arter). Hvis bare noen peptider er observert (dvs.en lav protein dekning kan hente), selv om tilstrekkelig utvalg er tilgjengelig, kan det være nødvendig å bruke en annen proteinasen under fordøyelsen. Generelt gir Trypsin et tilstrekkelig antall peptider; men i noen tilfeller som membran proteiner eller membran domener av proteiner, antall tryptic cleavage områder reduseres og andre enzymer målretting hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.
Når det gjelder instrumentering kreves en spesielt modifisert instrument for native massespektrometri som opprettholder ikke-kovalente interaksjoner under overføring i gassform. Flere apparattyper er innført, inkludert Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens endret Q-ToF masse spektrometre er kommersielt tilgjengelig for opprinnelige massespektrometri siden flere år, sistnevnte ble nylig introdusert og i de fleste tilfeller krever spesialisert endring45. Men anvendelsen av høyoppløselige instrumenter tillatt studere binding av flere ligander og deres kvantifisering46,47 og er lovende for framtidige applikasjoner.
For å identifisere krysskoblet di-peptider av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri, brukes standard prosedyrer med noen modifikasjoner. Databasen søket er imidlertid den begrensende faktoren som spesialisert programvare kan sjelden håndtere store databaser, og redusert databaser som inneholder protein underenheter av komplekser kreves. Nyere studier brukt masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretting protein interaksjoner i hele cellen lysates48,49. Bruk av kjemiske cross-linkers som fragmentere tandem massespektrometri eksperimenter hovedsakelig gir lineær peptider (endret av kryss-linker) som kan identifiseres ved ytterligere fragmentering og databasen søker av lineær peptider, og dette reduserer søke tid og beregningsorientert søke plass. Men for å utføre disse eksperimentene, er en ion felle masse analyserer eller en hybrid masse spectrometer med en ion felle nødvendig. Generelt falske positiver er en viktig sak, valideres masse spektra av krysskoblet peptider ofte manuelt av kvaliteten av deres fragment spektra som strekker data analyse tid enormt. Utvikle robust scoring systemer som kan brukes uten ytterligere validering trinnene er derfor potensielle fremtidige anvendelser. En måte å forbedre dataanalyse og redusere antall falske positiver var innføringen av falske oppdagelsen rate beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasett50.
Generelt, teknikerne beskrevet her kan suppleres med ytterligere massespektrometri teknikker (f.ekskovalente merking) øke utdataene fra analysen. Andre endringer og forbedringer av protokollene kan enkelt implementeres. Slik unravels sammenlignende cross-linking34 conformational endringer i samlingen protein. Videre utviklingen i native massespektrometri tillater i dag analyse av membran proteiner51,52 og deres samhandling med lipider28,52,53,54 . Ny bebyggelser av høyoppløselige masse spektrometre for native massespektrometri har utvidet programmet og ligand binding, f.eks, binding av lipider membran proteiner, kan nå inkluderes i analysen45, 46. i kombinasjon med beregningsorientert modellering tilnærminger, disse teknikkene kan levere strukturelle modeller av varierende oppløsning55. Hvis ingen krystall strukturer er tilgjengelig for de intakt komplisert eller enkelt underenheter, levere massespektrometri første innsikt i protein interaksjoner og topologien for ukjent komplekset. Avhengig av teknikkene som brukes og resultatene, finnes lav modeller av ukjent komplekset56,57,58. Hvis krystall strukturer eller homologi modeller er tilgjengelige, kan strukturelle informasjonen du mottok fra massespektrometri gi selv nær-innfødt modeller59.
Sammenlignet med andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen at det krever lite utvalg beløp, den kan håndtere heterogene prøver og gjelder protein komplekser av ubegrenset størrelse. I tillegg kan massespektrometri etterforskningen av dynamisk protein systemer. Forskjellige populasjoner av protein- eller proteinet som finnes i løsningen er vanligvis analysert sammen og derfor, i motsetning til med andre strukturelle teknikker som krever valg av bestemte befolkningsgrupper, alle konformasjonen opprettholdes under analyse og er assessable i ett eksperiment. Kvantitativ cross-linking tilnærminger ble nylig introdusert34,60,61 og er lovende for framtidige applikasjoner som beskriver conformational endringer under ulike forhold.

Strukturelle etterforskningen av protein samlinger har blitt spesielt viktig for forståelsen av cellulære prosesser. Følgelig er mange teknikker utviklet og forbedret i strukturell biologi1. Men er disse teknikkene noen ganger begrenset i sitt program på grunn av størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet protein komplekser under etterforskning. Massespektrometri kan håndtere disse utfordringene, og derfor dukket opp som et kraftig verktøy i strukturell biologi2,3,4,5. Den største fordelen av massespektrometri, er imidlertid muligheten til å entydig identifisere proteiner i komplekse og heterogene blandinger6. Dette proteiner er vanligvis fordøyd med endoproteinases og resulterende peptid blandingen er atskilt med flytende kromatografi og direkte elut i masse spectrometer. Peptid massene bestemmes senere og forløper ioner velges for ytterligere fragmentering av peptider. Proteiner identifiseres deretter søker peptid og tilsvarende fragment massene mot en kjent database. Denne prosedyren ikke bare lar identifikasjon av peptider/proteiner, men også deres post-translasjonell endringer som forårsaker en masse forskyvning av forløperen peptider og fragment ioner bærer endring7. Noen av de mange teknikkene i strukturelle massespektrometri er basert på dette prinsippet4,8. For eksempel fot merking teknikker som hydrogen deuterium exchange9,10, kjemiske merking strategier11,12eller hydroksyl radikale utskrift13,14 , gir innsikt i overflaten tilgjengelighet av proteiner under visse betingelser.
En annen teknikk er (kjemisk) cross-linking involverer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten gjennom deres funksjonelle grupper. For dette er kjemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansatt15,16. Etter cross-linking, proteiner er vanligvis hydrolyzed med proteaser og krysskoblet di-peptider analyseres av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri. Identifikasjon av cross-linking produkter av database søker, men krever bruk av spesialisert programvare som sammenhengende peptid sekvenser av ulike proteiner og ulike regioner17,18,19. Bruk av kjemiske cross-linkers har fordelen at det kan brukes til nesten alle protein kompleks av interesse og krever ikke innlemmelse av UV-activatable aminosyrer, som bare kan nås når uttrykke protein interesse vertsceller. Slik cross-linking er et allsidig verktøy og var vellykket ansatt i mange strukturelle studier selv store protein samlinger20.
Massespektrometri av intakt protein komplekser (også kalt "native" massespektrometri), derimot, omfatter analyse av intakt proteiner og protein komplekser uten hydrolyse i peptider. Det avslører komposisjon, heterogenitet, støkiometri, topologi og delenhet interaksjoner protein komplekser21,22. I kombinasjon med ion mobilitet lar innfødt massespektrometri videre fastsettelse av deres konformasjon23,24. Dette gjør det et kraftig verktøy for strukturelle etterforskningen av protein komplekser som er vanskelig å vurdere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri krever imidlertid analyse buffere som opprettholde ikke-kovalente protein interaksjoner under electrospray ionisering. Dette oppnås vanligvis ved hjelp av vandig, flyktige buffere som ammonium acetate25. I tillegg er instrument endringer nødvendig for å hindre dissosiasjon under overføring i gassform masse spectrometer26. Brukt på denne måten, ble mange (stor) protein komplekser analysert. Imponerende eksempler er studiene intakt ribosomer27, ATP synthases28eller virus29.
Kombinasjonen av innfødte massespektrometri og cross-linking vist på tidligere studier. For eksempel stoichiometries av Anstandsdame komplekser, inkludert en uventet Hsp70 dimer, kan hentes fra massespektrometri eksperimenter av intakt protein komplekser, mens kjemiske cross-linking avslørt arrangementer av proteiner i den samlinger30,31. I en annen studie, ble effekter av post-translasjonell modifikasjoner på en intakt ATP syntase komplekse studert. Native massespektrometri gitt innsikt i protein kompleks stabiliteten i tilstedeværelse eller fravær av fosforylering eller acetylation32,33. En komparativ cross-linking strategi34 da avslørt conformational endringer av proteinet under forskjellige betingelser.
Her gir vi protokollene for protein identifikasjon av massespektrometri, (kjemisk) cross-linking og innfødt massespektrometri, inkludert dataanalyse og fortolkning (figur 1). Kombinasjonen av utfyllende resultatene fra disse metodene med hjelp av to godt karakterisert protein komplekser er demonstrert35. Våre protokollen kan brukes til alle protein samling som kan renses på visse renhet og konsentrasjon. Tilnærmingen er i noen tilfeller begrenset av data analysen av cross-linking data, dvs., størrelsen på databasen ansatt, som bestemmer de nødvendige søke plass og tid. I tillegg manualen godkjenningen av identifiserte cross-links er ofte nødvendig og ytterligere reduserer produksjonen. Innfødt massespektrometri er stort sett begrenset av prøven kvalitet, f.eks, buffere og addukter brukes under rensing og muligheten til å utveksle dem av vandige og flyktige buffere. Protein komplekser renset for strukturell analyse vanligvis har imidlertid kvaliteten kreves for vellykket analyse med våre protokoller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

Proteiner samhandle med deres ligander til skjemaet aktiv og dynamisk samlinger som utfører ulike cellulære funksjoner. Klargjørende disse interaksjonene er derfor grunnleggende for forståelsen av cellulære prosesser. Men mange protein komplekser er dynamiske samlinger og er ikke tilgjengelig med konvensjonelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrar til strukturelle etterforskningen av disse samlingene, og spesielt kombinasjonen av ulike masse spectrometric teknikker gir verdifull innsikt i deres strukturelle arrangement.
I denne artikkelen vi beskriver programmet og kombinasjon av to utfyllende masse spectrometric teknikker, nemlig kjemiske cross-linking kombinert med massespektrometri og innfødt massespektrometri. Kjemisk cross-linking innebærer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten ved hjelp av kjemiske reagenser. Etter fordøyelsen med proteaser, krysskoblet di-peptider identifiseres massespektrometri og protein interaksjoner nettsteder er avdekket. Native massespektrometri er derimot analysen av intakt protein samlinger i gassform av en masse spectrometer. Det avslører protein stoichiometries som protein og ligand interaksjoner. Begge teknikkene derfor gir utfyllende informasjon om strukturen i protein-ligand samlinger og kombinasjonen vist seg kraftig i tidligere studier.

Strukturelle analysen av proteiner og komplekser de er grunnleggende for å forstå deres funksjon. Massespektrometri bidrar betydelig til strukturelle etterforskningen ved at det kan brukes til nesten alle kompleks rundt uansett størrelse eller prøve heterogenitet. Vi eksemplifiserer protokollen ved hjelp av to godt karakterisert protein komplekser; først, den hetero-dodecamer RvB1/B2 fra C. thermophilum og andre, den hetero-octameric CPS komplekse fra E. coli.
Først identifisert vi protein komponentene i to komplekser. For dette, proteiner var atskilt med SDS-siden (figur 2) og gel band ble kuttet fra gel. Etter-gel fordøyelsen av proteiner, peptid blandingen ble analysert av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri og peptid og fragment massene ble utsatt for databasen søker. Etter denne arbeidsflyten, vi identifisert alle protein underenheter av to komplekser med høy selvtillit, dvset høyt antall peptider med rimelig peptid score ble observert gir høy sekvens dekning for alle protein underenheter (tabell 1 ).
Vi deretter analysert intakt RvB1/B2 kompleks av innfødte massespektrometri (figur 3A). Mass spekteret avslørte to arter, en på ca 8000 m/z og en art på ca 11000-12 000 m/z. Beregnet massene for disse artene tilsvarer hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ringen (ca 310 kDa) og dodecameric dobbel-ring (RvB1)6(RvB2)6 (ca 620 kDa). Både topp-serien viser to bestander; Dette kommer fra en blanding av hans-merket og ukodede RvB2 tenkes i komplekser. En krystallstruktur for RvB1/B2 komplekse var tidligere fått36 og viser ordningen med dobbel-ringen (figur 3B). Opprinnelige masse spekteret derfor bekrefter støkiometri av intakt dodecamer og videre avslører en stabil sub kompleks. I tillegg identifiseres med eksisterende populasjoner.
For å identifisere protein samhandling områder i RvB1/B2 komplekset, krysskoblet vi kjemisk renset komplekset med BS3 kryss-linker. Vi først titreres mengden BS3 under cross-linking reaksjonen å bestemme optimale konsentrasjonen. BS3 er Amin-spesifikk og covalently koblinger lysin siden kjeder som N-termini proteiner. Cross-linking reaksjonen ble etterfulgt av SDS-siden (figur 2A). Ikke-krysskoblet komplekset viste både RvB1 og RvB2 underenheter. Å legge til BS3 reaksjonsblandingen forårsaket kovalente kombinasjon av proteiner som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. SDS gel viser at økende mengder BS3 gi høyere mengder krysskoblet arter mens ikke-krysskoblet protein underenheter reduseres. Vi kuttet protein bandene fra gel og fulgte protokollen angitt over, for å identifisere protein samhandling nettsteder. Et eksempel spekteret av en krysskoblet di-peptid vises (Figur 3 c). Spekteret viser y-ion rekke begge peptider bekrefter Samvirkingen protein. Totalt vi fikk 14 protein interaksjoner, inkludert fire cross-links mellom underenheter RvB1 og RvB2 og to cross-links mellom to kopier av RvB2 (tabell 2). Resultatene fra BS3 cross-linking kan visualiseres i et samspill nettverk (figur 3D) viser intra molekylære interaksjoner samt interaksjoner mellom ulike underenheter. Intra molekylær cross-links tyder på at både RvB1 og RvB2 underenheter kaster på en måte at N - og C-terminalen domener er i nærheten. Merk at intra molekylære interaksjoner ikke kan skilles fra Inter molekylære interaksjoner av den samme delenhet i dette tilfellet. Inter molekylær cross-links mellom de to underenheter ble også observert. Av disse kan to Inter molekylær cross-links mellom RvB1 og RvB2 visualiseres i strukturen validere cross-linking tilnærming. De andre Inter molekylær cross-links ligger i fleksible looper som ikke er inkludert i crystal strukturen. Vi har også identifisert to cross-links i RvB2 som inneholder den samme peptid sekvenser. Disse cross-links kan utvetydig være klassifisert som Inter molekylær som de må stammer fra to kopier av samme protein (figur 3D). Vår cross-linking eksperimenter avsløre protein samhandling områder i komplekset, men også i protein tenkes å gi innsikt i deres strukturelle ordning som kan også være bekreftet av den eksisterende krystallstruktur (figur 3B).
Det andre protein komplekset som vi studerte var CPS. Opprinnelige masse spekteret (figur 4A) avslørte tre protein komplekser mellom 6000 og 12 000 m/z. Det største komplekset av 640 kDa tilsvarer intakt hetero-octamer. Mindre komplekser representerer to sub komplekser; dimer av små og store CPS underenheter (160 kDa) og en hetero-tetramer som inneholder to kopier av hver delenhet (320 kDa). Disse sub komplekser levere første innsikt i protein forsamlingen; dvs.de store og små underenheter er i direkte kontakt (som åpenbart av hetero-dimer) og tetramer kan være et produkt av to dimers. For å få mer informasjon om strukturelle ordningen i intakt CPS komplekse, utført vi tandem massespektrometri (MS-/ MS) hetero-octamer og hetero-tetramer. I begge tilfeller, de små delenhet skilt fra den forløper tyder på at den lille delenhet ligger i utkanten av forsamlingen (figur 4B). Faktisk er de små perifere i tilgjengelig krystall struktur (figur 4C)44.
Kjemisk cross-linking bruker BS3 kryss-linker ble også fremført. Med økende mengder, ble kovalente koblingen av CPS underenheter forbedret. Etter fordøyelsen av proteiner og analyse av peptider som beskrevet ovenfor, ble mange protein interaksjoner i den store delenhet og en krysskobling i de små delenhet innhentet (tabell 2). I tillegg ligner RvB1/B2 komplekse, vi fant to Inter molekylær cross-links mellom to kopier av den store CPS delenhet. Disse cross-links sett de to store underenheter mot hverandre på deres C-terminalen sider. I en tidligere studie, identifisert strukturelle massespektrometri og beregningsorientert modellering35, vi tre ekstra samspill i den store delenhet som sannsynligvis stammer fra grensesnittet av to kopier av den store delenhet godkjent av krystallstruktur og fått modellen (figur 4C og tabell 2). Disse interaksjoner kan ordningen av CPS kjernen består av fire store underenheter. Men ble ingen mellom delenhet cross-links mellom små og store underenheter observert. Ved å undersøke de tilgjengelige krystallstruktur (figur 4C), blir det klart at samspillet mellom tetramerisk kjernen av komplekset, bestående av den store delenhet og de eksterne liten underenheter er svært liten, som kan forklare fravær av Inter delenhet interaksjoner. Dette er bekreftet av innfødte massespektrometri som viste at de små delenhet lett dissociates fra intakt komplekser mest sannsynlig skyldes en liten bindende grensesnitt. Likevel tillate protein interaksjoner i CPS komplekse kombinert fra kjemiske cross-linking og innfødt massespektrometri deducing deres strukturelle arrangement (Figur 4 d).
Samlet gir kombinasjonen av innfødte massespektrometri og kjemiske cross-linking kombinert med masse spectrometric identifikasjon av krysskoblet peptider, rekonstituering av strukturelle disponeringen av både eksempel komplekser. Mens kjemiske cross-linking avslørt arrangement av protein underenheter, for eksempel interaksjoner mellom RvB1 og RvB2 eller tetramerisk kjernen av CPS, innfødt massespektrometri levert protein stoichiometries av intakt komplekser og utbredt subcomplexes. Ved CPS, som ingen Inter molekylære interaksjoner mellom de to underenheter kunne observeres av kjemiske cross-linking, foreslår innfødt massespektrometri at hver store delenhet samhandler med en liten delenhet (Figur 4 d). Tandem massespektrometri foreslått eksterne plasseringen av de små delenhet i komplekset og et lite grensesnitt mellom begge underenheter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figur 1: arbeidsflyt innfødt massespektrometri og cross-linking. Begge teknikkene gir utfyllende resultater. Mens opprinnelig massespektrometri avslører stoichiometries og samhandling moduler, gir cross-linking innsikt i protein samhandling områder innenfor komplekser. Merk at kjemiske cross-linking bare avslører binære interaksjoner. (A) det første trinnet i native massespektrometri er buffer utveksling en flyktig og vandig buffer filter enheter eller gel filtrering kolonner. Massespektrometri av intakt protein komplekser så avslører sine støkiometri. I tandem massespektrometri eksperimenter, er perifere underenheter atskilt. (B) For kjemiske cross-linking, proteinet er ruges med en cross-linking reagens. Krysskoblede proteiner er deretter fordøyd i peptider som analyseres senere av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figur 2: SDS side av krysskoblet RvB1/B2 (A) og CPS (B) komplekser. (A) 2.5 µM RvB1/B2 var lastet per gel kjørefelt. Konsentrasjonen av BS3 var variert. Non-krysskoblet RvB1/B2 viser to protein underenheter på ca 50 kDa. Tillegg av BS3 forårsaket kovalente kombinasjon av protein underenheter som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. Mengden krysskoblet arter er økt med høyere BS3 konsentrasjoner. Optimale cross-linking forhold er markert (rød). (B) 10 µM CPS var lastet per gel kjørefelt. Den store (90 kDa) og små (40 kDa) CPS underenheter hentes. Tillegg av BS3 forårsaket kovalente kombinasjon av protein underenheter som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. Optimale cross-linking forhold er markert (rød). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figur 3: Native massespektrometri og kjemiske cross-linking av RvB1/B2 komplekse. (A) native mass spekteret avslører to arter av RvB1/B2; på intakt dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) på ca 11000 til 12.000 m/z og det hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ca 8000 m/z. Begge arter viser to bestander som følge av hans-merket og ukodede RvB2. Spekteret er endret fra35. (B) krystall strukturen til RvB1/B2 vises (PDB-ID 4WVY). Vekslende RvB1 og RvB2 danne underenheter to hexameric ringer. (C) fragmentering spekteret av en krysskoblet di-peptid. N-terminus av RvB1 var krysskoblet med K23 av RvB1. y-ion serien ble innhentet for begge peptider (rød og cyan). (D) Intra - og inter - protein interaksjoner innhentet i RvB1/B2 komplekset. Intra-cross-koblinger vises i rødt, inter-cross-links vises i blått. Sett inn viser to Inter molekylær cross-links mellom RvB1 og RvB2 underenheter som kan visualiseres i krystallstruktur (grønn, sett inn). Interaksjoner som kommer fra to RvB2 Kopier vises som blå stiplede linjer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figur 4: Native massespektrometri og kjemiske cross-linking av CPS. (A) native mass spekteret av CPS viser tre komplekser. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) og hetero-octamer (640 kDa). Spekteret er endret fra35. (B) Tandem massespektrometri av tetramerisk og octameric CPS komplekse avdekket dissosiasjon av små CPS delenhet. (C) krystall oppbygning CPS vises (PDB-ID 1BXR). De store underenheter danner en tetramerisk kjerne og de små underenheter ligger i utkanten av komplekset. Inter molekylær cross-links mellom to kopier av den store delenhet vises (grønn). (D) interaksjoner av store og små CPS underenheter. Innfødt massespektrometri avdekket subcomplexes og antyder en ekstern plassering av små delenhet. Kjemisk cross-links angir arrangementer i tetramerisk kjernen av CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: resultater. Proteiner ble identifisert ved flytende kromatografi-kombinert massespektrometri og databasen søke. Protein navnene, tiltredelse nummer, og beskrivelse samt protein masse er gitt. Protein score, antall observert spectra per protein og antall observert peptid sekvenser er oppført. Fem peptidene med høyeste maskot peptider score vises for hver protein delenhet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tabell 2: Cross-links observert i RvB1/B2 og CPS. Underenheter av komplekser og krysskoblet rester er gitt. Typen krysskobling (intra - eller Inter molekylær) ble avslørt fra overlappende peptid sekvenser eller en tidligere studie35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Arkitekturen av protein komplekser er nødvendig for sin funksjon. Kombinere ulike masse spectrometric teknikker vist seg kraftig å studere forsamlingen deres. Vi tilbyr protokoller for kjemiske cross-linking og innfødt massespektrometri og Vis hvordan disse utfyllende teknikker bidra til å belyse arkitektur multi delenhet protein samlinger.

Kombinere kjemisk Cross-linking og massespektrometri av intakt Protein komplekser å studere arkitektur multi delenhet Protein samlinger

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering og Biofysikalsk Study of Fruit neglebåndene

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifisering av protein komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

En protokoll for identifikasjon av protein-protein interaksjoner Basert på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolsk Merking, Immunoutfellingsanalyse, Quantitative massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodet Molekylær Sonder til Study G protein-koblede reseptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...