Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Vi tackar våra kolleger för bra diskussioner. Vi tackar också Ilme Schlichting och Karl-Peter Hopfner för att tillhandahålla proteinkomplex. Vi erkänner finansiering från det federala departement för utbildning och forskning (BMBF, ZIK programme, 03Z22HN22), Europeiska regionala utvecklingsfonden (EFRE, ZS/2016/04/78115) och den MLU Halle-Wittenberg att C.S. och finansiering från Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) till A.P.

Författarna har något att avslöja.

Protokoll finns för mass spectrometry-baserade strukturanalys av flera subenhet proteinkomplex. Två metoder, som beskrivs i protokollet, mestadels leverera kompletterande resultat och är väl lämpade att få insikter i de strukturella arrangemangen inom protein (-ligand) komplex som är svåra att studera genom konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri levererar insikter i protein stoichiometries samt proteininteraktioner genom att analysera subcomplexes och stabil interaktion moduler. Bryggbindningen, däremot, ger information på direkt kontakt webbplatser. Beroende på den cross-linker används, en viss flexibilitet kan eller bör ingå i analysen.
De medföljande protokoll är i allmänhet lätt att utföra och inte tidskrävande. Hela protokollet kan utföras inom en vecka och kan tillämpas på nästan alla proteinkomplex, även om en viss mängd protein komplex krävs för framgångsrika analysen. Provberedning är enkel och kräver inte speciellt renat proteinkomplex. En vanlig fallgrop är dock kontaminering av provet under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Dessa föroreningar i de flesta fall inkluderar keratins som påbörjar från damm, hud eller hår. Därför extra vård som bär handskar och lab rockar, filtrerande aqueous buffertar, och med hjälp av hög renhet lösningsmedel bör tas under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Andra kontaminerande proteiner såsom chaperones införs oftast under protein rening, t.ex., när du använder affinitet taggar. I dessa fall bör protein rening förbättras, exempelvis genom att öka tvätt steg. I varje fall protein föroreningar i provet lätt identifieras under databas sökningen genom att utelämna filtret taxonomi (dvssöka mot proteiner från alla arter). Om bara några peptider observeras (dvs.en låg protein täckning kunde erhållas), trots att tillräckliga exempel finns, det kan vara nödvändigt att använda en annan proteinas under matsmältningen. I allmänhet ger Trypsin ett tillräckligt antal peptider; dock i vissa fall såsom membranproteiner eller membran domäner av proteiner, antalet tryptic klyvning platser minskas och andra enzymer som inriktning hydrofoba aminosyror är ett bättre val.
När det gäller instrumentering krävs ett särskilt modifierade instrument för infödda masspektrometri som upprätthåller icke-kovalenta interaktioner under överföringen in i gas-fas. Flera typer av mätinstrument har införts, inklusive Q-ToF och orbitrap instrument. Medan modifierade Q-ToF masspektrometrar finns kommersiellt tillgängliga för infödda masspektrometri sedan flera år, den senare endast nyligen introducerade och i de flesta fall kräver specialiserade ändring45. Dock tillämpningen av högupplösta instrument får studera bindningen av flera ligander och deras kvantifiering46,47 och är lovande för kommande ansökningar.
För att identifiera tvärbunden di-peptider av flytande kopplade kromatografi masspektrometri, kan standardförfaranden med några ändringar tillämpas. Databas sökningen är dock den begränsande faktorn som specialiserad programvara kan sällan ta itu med stora databaser och minskad databaser som innehåller protein subunitsna av komplexen krävs. Nyligen genomförda studier används mass spectrometry-cleavable cross-linkers inriktning proteininteraktioner i hela cellen lysates48,49. Användning av kemiska cross-linkers som fragment i tandem mass spectrometry experiment mestadels ger linjär peptider (modifierad av cross-linker), som kan identifieras genom ytterligare fragmentering och databas sökning av linjära peptider, och detta minskar Söktid och computational Sök rum. För att utföra dessa experiment, krävs en massa ion trap-analysator eller en hybrid masspektrometer med en ion trap dock. I allmänhet, eftersom falskt positiva resultat är en viktig fråga, verifieras masspektra av tvärbunden peptider ofta manuellt av kvaliteten på deras fragment spektra som sträcker sig data analys tid enormt. Utveckla robusta scoring system som kan tillämpas utan ytterligare åtgärder för validering är därför potentiella framtida tillämpningar. Ett sätt att förbättra dataanalys och att minska antalet falskt positiva var införandet av falsk upptäckten beräkningar och deras tillämpning på cross-linking datauppsättningar50.
I allmänhet, de tekniker som beskrivs här kan kompletteras med ytterligare masspektrometri tekniker (t.ex., kovalent märkning) att öka produktionen från analysen. Andra ändringar och förbättringar av protokollen kan enkelt implementeras. Som sådan unravels jämförande tvärbindande34 konfirmerande förändringar i sammansättningen protein. Ytterligare utveckling i native masspektrometri tillåter numera analys av membranet proteiner51,52 och deras interaktioner med lipider28,52,53,54 . Ny utveckling av högupplösta masspektrometrar för infödda masspektrometri har utvidgat tillämpningen och ligand bindande, t.ex., bindande av lipider till membranproteiner, kan nu tas med i analys45, 46. i kombination med datormodellering metoder, dessa tekniker kan leverera strukturella modeller av varierande upplösning55. Om ingen kristallstrukturer finns för intakt komplex eller enda subunitsna, kan masspektrometri leverera första insikter proteininteraktioner och okänd komplex topologi. Beroende på de tekniker som används och de resultat som erhållits, kan lågupplösta modeller av okänd komplexet erhållas56,57,58. Om kristallen strukturerar eller homologi modeller finns tillgängliga, kan strukturell information från masspektrometri ge även nära-native modeller59.
I jämförelse med andra strukturella tekniker, masspektrometri har fördelen att det kräver låg prov belopp, det kan hantera heterogena prover och är tillämplig på proteinkomplex av obegränsad storlek. Dessutom kan masspektrometri utredningen av dynamiska protein system. Olika populationer av protein eller proteinkomplex som finns i lösningen analyseras vanligen tillsammans och därför, till skillnad från med andra strukturella tekniker som kräver urval av vissa populationer, alla konformationer bibehålls under analys och är taxeras i ett experiment. Kvantitativa tvärbindande metoder var nyligen införda34,60,61 och är lovande för framtida tillämpningar som beskriver konfirmerande förändringar under olika förhållanden.

Strukturella undersökningen av protein aggregat har blivit särskilt viktigt för förståelsen av cellulära processer. Följaktligen har många, tekniker utvecklats och förbättrats i strukturbiologi1. Dessa tekniker är dock ibland begränsade sin ansökan på grund av storlek, flexibilitet eller heterogenitet av proteinkomplex under utredning. Masspektrometri kan ta itu med dessa utmaningar och därför växte fram som ett kraftfullt verktyg i strukturbiologi2,3,4,5. Den största fördelen med masspektrometri, är dock förmågan att otvetydigt identifiera proteiner även i komplexa och heterogena blandningar6. För detta ändamål proteiner rötas oftast med endoproteinases och den resulterande peptid blandningen separeras genom vätskekromatografi och direkt elueras in masspektrometer. Peptid massan bestäms därefter och föregångare joner väljs för ytterligare fragmentering av peptiderna. Proteiner är sedan identifierade genom forskande peptid och motsvarande fragment massorna mot en känd databas. Detta förfarande inte bara tillåter identifiering av peptider/proteiner men också deras post-translationella modifieringar som orsakar en massa förskjutning av föregångare peptiderna och fragment jonerna bär den ändring7. Några av de många teknikerna i strukturella masspektrometri bygger på denna princip4,8. Till exempel fot märkning tekniker såsom väte deuterium exchange9,10, kemisk märkning strategier11,12, eller hydroxyl radikala utskrift13,14 , ge insikter i ytan tillgängligheten av proteiner under vissa förutsättningar.
En annan teknik är (kemisk) cross-linking med kovalenta sammanlänkningen av aminosyror i närheten genom deras funktionella grupper. För detta är kemiska reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyror sysselsatta15,16. Efter bryggbindningen, proteinerna är vanligtvis hydrolyseras med proteaser och tvärbunden di-peptider analyseras av flytande kopplade kromatografi masspektrometri. Identifiering av bryggbindningen produkter av databasen söka, men kräver användning av specialiserad programvara som sammanfogar peptid sekvenser av olika proteiner och olika regioner17,18,19. Användning av kemiska cross-linkers har fördelen att den kan användas till nästan varje protein komplex av intresse och inte kräver införlivande av UV-activatable aminosyror, som bara kan uppnås när uttrycker proteinet av intresse i värdceller. Som sådan, cross-linking är ett mångsidigt verktyg och användes framgångsrikt i många strukturella studier även stora protein aggregat20.
Masspektrometri av intakt proteinkomplex (kallas ibland ”inhemska” masspektrometri), å andra sidan, innebär analys av intakta proteiner och proteinkomplex utan hydrolys i peptider. Det avslöjar sammansättning, heterogenitet, stökiometri, topologi och subunit interaktioner protein komplex21,22. I kombination med ion rörlighet gör infödda masspektrometri ytterligare bestämning av deras konformation23,24. Detta gör det ett kraftfullt verktyg för strukturella utredning av proteinkomplex som är svåra att bedöma av konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri kräver dock analys buffertar som upprätthåller icke-kovalenta proteininteraktioner under elektrospray jonisering. Detta uppnås vanligen med hjälp av vattenhaltigt, flyktiga buffertar såsom ammonium acetat25. Ändringar av instrumentet är dessutom nödvändiga för att förhindra dissociation under överföringen till gasfas av masspektrometer26. Tillämpas på detta sätt, analyserades många (stor) proteinkomplex. Imponerande exempel är studier av intakt ribosomer27, ATP syntaser28eller virus29.
Kombinationen av infödda masspektrometri och cross-linking visat sig särskilt framgångsrik i tidigare studier. Exempelvis stoichiometries av förkläde komplex, inklusive en oväntad Hsp70 dimer, kunde erhållas från masspektrometri experiment av intakt proteinkomplex, medan kemiska cross-linking avslöjade arrangemangen av proteinerna i den församlingar30,31. I en annan studie studerades effekterna av post-translationella modifieringar på en intakt ATP synthase komplexa. Infödda masspektrometri finns insikter i protein komplex stabiliteten i närvaro eller frånvaro av fosforylering eller acetylering32,33. En jämförande tvärbindande strategi34 avslöjade sedan konfirmerande förändringar av protein komplex på olika villkor.
Här ger vi protokollen för protein identifiering av masspektrometri (kemisk) cross-linking och infödda masspektrometri, inklusive dataanalys och tolkning (figur 1). Kombinationen av kompletterande resultat från dessa metoder med hjälp av två välkarakteriserad proteinkomplex är påvisad35. Våra protokoll kan tillämpas på någon protein församling som kan renas vid vissa renhet och koncentration. Metoden är i vissa fall begränsas av dataanalys av cross-linking data, dvs, storleken på databasen anställd, som bestämmer tid och det krävs Sök. Dessutom manuell validering av identifierade tvärbindningar krävs ofta och ytterligare minskar produktionen. Infödda masspektrometri begränsas främst av provet kvaliteten, t.ex., buffertar och addukter används under rening och möjligheten för att utbyta dem av vattenfasen och flyktiga buffertar. Proteinkomplex som renas för strukturanalys vanligtvis har dock den kvalitet som krävs för framgångsrik analys med våra protokoll.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

Proteiner interagerar med deras ligander till formuläret aktiva och dynamiska sammansättningar som utför olika cellulära funktioner. Belysa dessa interaktioner är därför grundläggande för förståelsen av cellulära processer. Men många proteinkomplex är dynamiska sammansättningar och kan inte nås av konventionella strukturella tekniker. Masspektrometri bidrar till strukturella undersökningen av dessa församlingar, och särskilt kombinationen av olika massa spektrometriska tekniker ger värdefulla insikter i deras strukturella arrangemang.
I den här artikeln beskriver vi ansökan och kombination av två kompletterande massa spektrometriska tekniker, nämligen kemiska cross-linking tillsammans med masspektrometri och infödda masspektrometri. Kemiska tvärbindningsmedel innebär kovalent sammanlänkningen av aminosyror i närheten med hjälp av kemiska reagenser. Efter uppslutning med proteaser, tvärbunden di-peptider identifieras av masspektrometri och protein interaktioner webbplatser är avtäckt. Infödda masspektrometri är däremot analysen av intakt protein församlingar i gasfas av en masspektrometer. Det avslöjar protein stoichiometries samt protein och ligand interaktioner. Båda teknikerna levererar därför kompletterande information om strukturen på protein-ligand sammansättningar och deras kombination visat sig vara kraftfulla i tidigare studier.

Den strukturella analysen av proteiner och komplexen bildar de är grundläggande för att förstå deras funktion. Masspektrometri bidrar avsevärt till den strukturella undersökningen i att det kan tillämpas på nästan varje komplex av intresse oavsett storlek eller prova heterogenitet. Vi exemplifiera protokollet med hjälp av två välkarakteriserad proteinkomplex; första, hetero-dodecamer RvB1/B2 från C. thermophilum och andra, hetero-octameric CPS komplexa från E. coli.
Det första identifierat vi protein komponenterna i de två komplex. För detta, proteinerna var åtskilda av SDS-PAGE (figur 2) och gel banden klipptes från gelen. När i-gel matsmältningen av proteiner, peptid blandningen analyserades av flytande kopplade kromatografi masspektrometri peptid och fragment massorna utsattes för databas sökning. Efter detta arbetsflöde, vi identifierat alla proteinsubenheter av de två komplex med högt förtroende, dvs., observerades ett stort antal peptider med rimliga peptid poäng ger hög sekvens täckning för alla proteinsubenheter (tabell 1 ).
Vi analyserade sedan intakt RvB1/B2 komplex av infödda masspektrometri (figur 3A). Masspektrum avslöjade två arter, en på ungefär 8 000 m/z och en annan art på cirka 11.000-12.000 m/z. Beräknade massorna för dessa arter motsvarar hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ringen (cirka 310 kDa) och den dodecameric dubbel-ring (RvB1)6(RvB2)6 (cirka 620 kDa). Både topp-serien visar två populationer; dessa kommer från en blandning av hans-taggade och otaggade RvB2 subenheter i komplexen. En kristallstruktur för RvB1/B2 komplexa erhölls tidigare36 och visar ordningen av dubbel-ringen (figur 3B). Den infödda masspektrum bekräftar därför stökiometri av den intakta dodecamer och dessutom avslöjar ett stabilt komplex i sub. Dessutom identifieras samexisterande populationer.
För att identifiera protein interaktion platser i RvB1/B2 komplex, tvärbunden vi kemiskt renade komplexet med BS3 cross-linker. Vi titreras först mängden BS3 under tvärbindande reaktionen att bestämma den optimala koncentrationen. BS3 är amine-specifika och kovalent länkar lysin sida kedjor samt N-termini av proteiner. Tvärbindande reaktionen följdes av SDS-PAGE (figur 2A). Icke-kors-länkade anläggningen visade både RvB1 och RvB2 subenheter. Att lägga till BS3 reaktionsblandningen orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteiner som resulterar i protein band på högre molekylvikt. SDS gelen visar att ökande mängder BS3 ger högre belopp av tvärbunden arter medan icke-kors-länkade proteinsubenheter reduceras. Vi har sedan skär banden protein från gelen och följt protokollet som anges ovan för att identifiera protein interaktion platser. En exempel spektrum av en tvärbunden di-peptid visas (figur 3 c). Spektrumet visar y-ion serie båda peptider som bekräftar detta protein samspel. Totalt har vi fått 14 proteininteraktioner, inklusive fyra tvärbindningar mellan subenheter RvB1 och RvB2 och två tvärbindningar mellan två kopior av RvB2 (tabell 2). Resultaten från BS3 cross-linking visualiseras i en interaktion nätverk (figur 3D) visar inom molekylära interaktioner samt interaktioner mellan olika subenheter. Inom molekylär tvärbindningar föreslår att både RvB1 och RvB2 subenheter vik i sätt att N - och C-terminal domäner finns i närheten. Observera att inom molekylära interaktioner inte kan särskiljas från Inter molekylära interaktioner av den samma subenheten i detta fall. Mellan molekylär tvärbindningar mellan de två subunitsna observerades också. Av dessa kan två mellan molekylär tvärbindningar mellan RvB1 och RvB2 visualiseras i strukturen validera metoden tvärbindande. De andra mellan molekylär tvärbindningar ligger i flexibla slingor som inte ingår i kristallstrukturen. Vi har även identifierat två tvärbindningar i RvB2 som innehåller samma peptid sekvenser. Dessa tvärbindningar kan entydigt klassas som mellan molekylär som de måste härröra från två kopior av samma protein (figur 3D). Våra tvärbindande experiment avslöja protein interaktion platser inom komplex men också inom de proteinsubenheter ger insikter i deras strukturella arrangemang som kunde också bekräftas av befintliga kristallstrukturen (figur 3B).
Den andra protein komplex som vi studerat var CPS. Den infödda masspektrum (figur 4A) avslöjade tre proteinkomplex mellan 6 000 och 12 000 m/z. Den största komplexet av 640 kDa motsvarar den intakt hetero-octamer. De mindre komplex representerar två sub komplex; dimeren av små och stora CPS subunitsna (160 kDa) och en hetero-tetramer som innehåller två kopior av varje subenhet (320 kDa). Dessa sub komplex leverera första inblick i församlingens protein; dvs, stora och små subunitsna är i direkt kontakt (som avslöjades av den hetero-dimeren) och tetramer kan vara en produkt av två dimerer. För att få mer information om den strukturella arrangemanget i intakt CPS komplex, utfört vi tandem masspektrometri (MS/MS) av den hetero-octamer och den hetero-tetramer. I båda fallen den små subuniten skiljas från den föregångare tyder på att den små subuniten ligger i peripheryen av församlingen (figur 4B). Den små subuniten faktiskt perifer i den tillgängliga kristall struktur (figur 4 c)44.
Kemiska cross-linking med den BS3 cross-linker utfördes också. Med ökande mängder, stärktes kovalent sammanlänkningen av CPS subunitsna. Efter matsmältningen av proteiner och analys av peptiderna som beskrivs ovan, erhölls många proteininteraktioner inom den stora subenheten och en korslänk i den små subuniten (tabell 2). Dessutom liknar RvB1/B2 komplex, Vi hittade två mellan molekylär tvärbindningar mellan två kopior av den stora CPS-subenheten. Dessa tvärbindningar placera två stora subunitsna inför varandra på högkant C-terminal. I en tidigare studie, identifierat att kombinera strukturella masspektrometri och datormodellering35, vi tre ytterligare interaktioner i den stora subuniten som troligen härstammar från gränssnittet för två kopior av den stora subuniten valideras av kristallstrukturen och erhållna modellen (figur 4 c och tabell 2). Dessa interaktioner kan arrangemanget av CPS kärnan komplex bestående av fyra stora subenheter. Dock observerades inga Inter subenhet tvärbindningar mellan lilla och de stora subenheter. Genom att inspektera tillgängliga kristallstrukturen (figur 4 c), blir det uppenbart att interaktion ytan mellan tetrameriskt kärnan av anläggningen, som består av den stora subenheten och perifera små subunitsna är mycket liten, vilket kan förklara avsaknad av Inter subenhet interaktioner. Detta bekräftas av infödda masspektrometri som visade att den små subuniten separerar lätt från de intakta komplex troligen på grund av en liten bindande gränssnitt. Dock tillåta proteininteraktioner i CPS komplex kombination från kemiska cross-linking och infödda masspektrometri härleda deras strukturella arrangemang (figur 4 d).
Kombinationen av infödda masspektrometri och kemiska cross-linking tillsammans med massa spektrometriska identifiering av tvärbunden peptider, sammantaget och tillåter beredning av strukturella arrangemang av båda exempel komplex. Medan kemiska cross-linking avslöjade arrangemang av proteinsubenheter, till exempel samspelet mellan RvB1 och RvB2 eller inom tetrameriskt kärnan i CPS, infödda masspektrometri levereras protein stoichiometries av intakt komplex och förhärskande subcomplexes. När det gäller CPS, för vilka inga mellan molekylära interaktioner mellan de två subunitsna kan observeras av kemiska bryggbindningen, föreslår infödda masspektrometri att varje stora subenheten interagerar med en liten subunit (figur 4 d). Tandem mass spectrometry föreslog den små subuniten i anläggningen och en liten gränssnitt mellan båda subunits perifera läge.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figur 1: arbetsflöde för infödda masspektrometri och cross-linking. Båda teknikerna levererar kompletterande resultat. Medan infödda masspektrometri avslöjar stoichiometries och interaktion moduler, ger cross-linking insikter i protein interaktion webbsidor i komplexen. Observera att kemiska cross-linking endast avslöjar binära interaktioner. (A) det första steget i native masspektrometri är buffert utbyte till en flyktig och vattenhaltiga buffert med filterenheter eller gel filtrering kolumner. Masspektrometri av intakt proteinkomplex sedan avslöjar deras stökiometri. I tandem mass spectrometry experiment dissocieras perifera subenheter. (B) för kemiska bryggbindningen, protein komplex inkuberas med en korslänkande reagens. Tvärbunden proteinerna rötas sedan till peptider som därefter analyseras av flytande kopplade kromatografi masspektrometri. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figur 2: SDS-PAGE av tvärbunden RvB1/B2 (A) och CPS b komplex. (A) 2,5 µM RvB1/B2 lastades per gel körfält. Koncentrationen av BS3 varierades. Icke-kors-länkade RvB1/B2 visar de två proteinsubenheter på cirka 50 kDa. Tillägg av BS3 orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteinsubenheter resulterar i protein band på högre molekylvikt. Tvärbunden arter är ökat med högre BS3 koncentrationer. Optimala tvärbindande förhållanden är markerade (röd). (B) 10 µM CPS lastades per gel körfält. Den stora (90 kDa) och små (40 kDa) CPS subenheter erhålls. Tillägg av BS3 orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteinsubenheter resulterar i protein band på högre molekylvikt. Optimala tvärbindande förhållanden är markerade (röd). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figur 3: Native masspektrometri och kemiska cross-linking av RvB1/B2 komplexa. (A) den infödda masspektrum avslöjar två arter av RvB1/B2; den intakta dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) vid cirka 11 000 och 12 000 m/z och hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ungefär 8 000 m/z. Båda arterna Visa två populationer som härrör från hans-taggade och otaggade RvB2. Spektrumet har ändrats från35. (B), kristallen strukturerar av RvB1/B2 visas (PDB-ID 4WVY). Subenheter omväxlande RvB1 och RvB2 och bildar två hexameric ringar. (C) fragmentering spektrum av en tvärbunden di-peptid. N-terminalen av RvB1 var tvärbunden med K23 av RvB1. y-ion serie erhölls för båda peptider (rött och cyan). (D) Intra - och inter - protein interaktioner erhålls i RvB1/B2 komplex. Mellan-Cross-Country-länkar visas i rött, inter-cross-links visas i blått. Skäret visar två mellan molekylär tvärbindningar mellan RvB1 och RvB2 subenheter som kan visualiseras i kristallstrukturen (grön, infoga). Interaktioner som härstammar från två RvB2 kopior visas som blå streckade linjer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figur 4: Native masspektrometri och kemiska cross-linking av CPS. (A) den infödda masspektrum av CPS visar tre komplex. Den hetero-dimeren (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) och den hetero-octamer (640 kDa). Spektrumet har ändrats från35. (B) Tandem masspektrometri av tetrameriskt och octameric CPS komplexa avslöjade dissociation av den små subuniten CPS. (C), kristallen strukturerar av CPS visas (PDB-ID 1BXR). De stora subenheter utgör ett tetrameriskt kärna och små subunitsna ligger i peripheryen av anläggningen. Mellan molekylär tvärbindningar mellan två kopior av den stora subuniten visas (grön). (D) interaktioner mellan stora och små CPS subunitsna. Infödda masspektrometri visade subcomplexes och föreslår ett perifert läge av den små subuniten. Kemiska tvärbindningar ange åtgärder i tetrameriskt kärna av CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: databasen sökresultat. Proteinerna identifierades av flytande kopplade kromatografi masspektrometri och databas sökning. Protein namnen, anslutningen nummer, samt beskrivning och protein massa ges. Den protein poängen, antal observerade spektra per protein och antalet observerade peptid sekvenser listas. De fem peptiderna med högsta maskot peptider poängen listas för varje protein delenhet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Tabell 2: tvärbindningar observerats i RvB1/B2 och CPS. Subunitsna av komplexen och tvärbunden rester ges. Typ av korslänk (intra - eller mellan molekylär) avslöjades från överlappande peptid sekvenser eller en tidigare studie35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Arkitekturen av proteinkomplex är avgörande för deras funktion. Kombinera olika massa spektrometriska tekniker visat kraftfull att studera deras församlingen. Vi tillhandahåller protokoll för kemiska cross-linking och infödda masspektrometri och visar hur dessa kompletterande tekniker hjälpa till att belysa arkitekturen av flera subenhet protein församlingar.

Att kombinera kemisk Cross-linking och masspektrometri av intakt proteinkomplex att studera arkitekturen av flera subenhet Protein församlingar

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering och Biofysikalisk studie av frukt nagelband

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetiskt kodade molekylära sonder för att studera G-proteinkopplade receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...