Name: combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Biz bizim meslektaşları yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Biz de Ilme Schlichting ve Karl-Peter Hopfner protein kompleksleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Federal Bakanlıktan eğitim ve araştırma için fon kabul (BMBF, ZIK programı, 03Z22HN22), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (EFRE, ZS/2016/04/78115) ve MLU Halle-Wittenberg C.S. ve Wellcome Trust (109854/658 finansman Z/15/Z) A.P. için

Yazarlar ifşa gerek yok.

İletişim kuralları kütle spektrometresi tabanlı yapısal analizi çok alt birim protein kompleksleri için sağlanır. İletişim kuralında, açıklanan iki teknikleri, çoğunlukla tamamlayıcı sonuçlar ve protein içinde yapısal düzenlemeler anlayışlar kazanmak için uygundur (-ligand) tarafından geleneksel yapı teknikleri eğitim zor olan kompleksleri. Yerel kütle spektrometresi subcomplexes ve istikrarlı etkileşim modülleri analiz ederek protein stoichiometries yanı sıra protein etkileşimleri içine anlayışlar sunar. İlişkilendirerek, öte yandan, doğrudan ilgili siteler hakkında bilgi verir. Bağlı olarak kullanılan cross-linker, belirli bir esneklik olabilir veya analize dahil.
Genel olarak gerçekleştirmek kolay ve değil zaman alıcı sağlanan kurallarıdır. Tüm iletişim kuralı bir hafta içinde çalıştırılabilir ve belirli bir miktarda protein kompleksi başarılı analiz için gerekli olmasına rağmen hemen hemen tüm protein kompleksleri için uygulanabilir. Numune hazırlama basittir ve özellikle saf protein kompleksleri gerektirmez. Ancak, yaygın bir hatadır kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında örnek kirlenme var. Çoğu durumda bu contaminations toz, deri veya saç kaynaklanan keratins içerir. Bu nedenle, eldiven ve laboratuvar mont giyiyor gibi ilave, Sulu arabellekleri filtrating ve yüksek saflıkta çözücüler kullanılarak kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında özen gösterilmelidir. Benzeşme Etiketler kullanırken chaperones gibi bulaşıcı diğer proteinler protein arıtma sırasında örneğin, genellikle tanıtılmaktadır. Bu gibi durumlarda, protein saflaştırma, örneğin çamaşır adımları artırarak geliştirilmesi. Her durumda, örnekteki protein contaminations kolayca veritabanı arama sırasında taksonomi filtre ihmal olarak tanımlanır (Yani, tüm türlerden proteinler karşı arama). Eğer sadece birkaç peptidler gözlenir (Yani, düşük protein kapsama elde edilebilir), yeterli örnek kullanılabilir olsa bile, farklı bir İndinavir sindirim sırasında kullanmak gerekli olabilir. Genel olarak tripsin peptidler yeterli sayıda verir; Ancak, membran proteinlerinin veya proteinlerin membran etki alanları gibi bazı durumlarda tryptic bölünme sitelerin sayısı azalır ve hidrofobik amino asitler hedefleme diğer enzimler daha iyi bir seçimdir.
Araçları açısından, özellikle değiştirilmiş bir enstrüman gaz fazına aktarmadan kovalent olmayan etkileşimleri tutar yerli kütle spektrometresi gereklidir. Q-ToF ve orbitrap aletler dahil olmak üzere çeşitli araç türleri getirilmiştir. Değiştirilmiş Q-ToF Kütle Spektrometre Sistemleri beri birkaç yıl için yerel kütle spektrometresi ticari olarak mevcut olmakla birlikte, ikinci ancak son zamanlarda kullanılmaya başlanan ve çoğu durumda özel değişiklik45gerektirir. Ancak, uygulama yüksek çözünürlüklü aletleri bağlama birden çok ligandlar ve onların miktar46,47 eğitim izin ve gelecekteki uygulamalar için umut verici.
Çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi tanımlamak için birkaç değişiklik ile standart yordamlar uygulayabilirsiniz. Ancak, veritabanı arama sınırlayıcı bir faktör olarak özel yazılım nadiren büyük veritabanları ile başa çıkabilirim ve kompleksleri protein alt içeren azaltılmış veritabanları gerekli olur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kullanılan Kütle spektrometresi yarilabilir cross-linkers protein etkileşimler tüm hücre lysates48,49hedefleme. Tandem kütle spektrometresi deneylerde çoğunlukla parçası kimyasal cross-linkers kullanımı daha fazla parçalanma tarafından tanımlanan, (cross-linker tarafından değiştirilmiş) doğrusal peptidler verimleri ve doğrusal peptidler ve bu veritabanı arama azaltır arama süresi ve Hesaplamalı Arama alanı. Ancak, bu deneyler gerçekleştirmek için bir iyon kapanı kitle Analyzer'ı veya bir melez Kütle Spektrometre ile bir iyon kapanı gereklidir. Yanlış-mutlak önemli bir konu olduğundan, genel olarak, çapraz bağlı peptidler kitle spectra kez el ile veri analiz süresini son derece uzanan kalitesi onların parçası spectra ile doğrulanır. Daha fazla doğrulama adımları bu nedenle potansiyel gelecekteki uygulamalar olmadan, uygulanacak sağlam puanlama sistemlerinin geliştirilmesi. Veri Çözümleme geliştirmek ve yanlış-mutlak sayısını azaltmak için bir yol yanlış bulma oranı hesaplamalarını ve veri kümeleri50cross-linking üzere giriş oldu.
Genel olarak, burada açıklanan teknikler daha fazla kütle spektrometresi teknikleri ile tamamlanmaktadır (örneğin, kovalent etiketleme) analizi çıktısı artırmak için. Diğer değişiklikler ve geliştirmeler iletişim kurallarının kolayca uygulanabilir. Bu nedenle karşılaştırmalı cross-linking34 protein derlemesinde konformasyon değişiklikleri unravels. Daha fazla yerel kütle spektrometresi gelişmeler günümüzde membran proteinleri51,52 analizi ve onların etkileşim lipidler28,52,53,54 ile izin . Yüksek çözünürlüklü Kütle Spektrometreleri yerli kütle spektrometresi için yeni gelişmeler uygulama ve ligand taşıması, örneğin, lipitler membran proteinlerinin için bağlama genişletilmiş var, şimdi analiz45', dahil edilebilir 46. sayısal modelleme yaklaşımlar ile birlikte, bu tekniklerin çözünürlük55değişen Yapısal modeller sunabilirsiniz. Hiçbir Kristal yapıları olduğu gibi karmaşık veya tek alt birimleri için kullanılabilir varsa, kütle spektrometresi ilk yorumlara protein etkileşimleri ve bilinmeyen karmaşık topoloji teslim edebilirsiniz. Kullanılan teknikler ve elde edilen sonuçlar bağlı olarak, düşük çözünürlüklü modeller bilinmeyen kompleks56,57,58elde edilebilir. Kristal yapıları veya homoloji modelleri kullanılabiliyorsa, kütle spektrometresi alınan yapısal bilgi bile yakınındaki yerli modelleri59yol açabilir.
Diğer yapısal teknikleri ile karşılaştırıldığında, kütle spektrometresi avantajı vardır bu düşük örnek gerektiren, türdeş olmayan örnekleri ile başa çıkabilirim ve Sınırsız büyüklükte protein kompleksleri için geçerlidir. Ayrıca, kütle spektrometresi dinamik protein sistemleri araştırma sağlar. Çözüm içinde protein veya protein kompleksi farklı nüfus genellikle birlikte analiz edilir ve bu nedenle, farklı olarak belirli nüfusun seçimi gerektiren diğer yapısal teknikleri ile tüm biçimler sırasında korunur analiz ve olan bir deneyde değerlendirilebilir. Kantitatif yaklaşımlar cross-linking son zamanlarda tanıtılan34,60,61 ve gelecekteki uygulamalar farklı koşullar altında konformasyon değişiklikleri açıklayan için umut verici.

Protein derlemeler yapısal incelenmesi özellikle hücresel süreçleri anlamak için önemli hale gelmiştir. Sonuç olarak, birçok teknikleri geliştirilmiş ve Yapısal Biyoloji1' geliştirilmiş. Ancak, bu teknikler bazen onların uygulama boyutu, esneklik veya protein kompleksleri soruşturma altında heterojen nedeniyle sınırlıdır. Kütle spektrometresi bu zorlukları ile başa çıkabilirim ve bu nedenle, Yapısal Biyoloji2,3,4,5güçlü bir araç olarak ortaya çıktı. Kütle spektrometresi, en büyük avantajı ise belirsizliğe yer bırakmadan proteinler bile karmaşık ve heterojen karışımları6' tanımlama yeteneği. Bu amaçla, proteinler genellikle endoproteinases ile sindirmek ve elde edilen peptid karışımı sıvı Kromatografi tarafından ayrılmış ve doğrudan Kütle Spektrometre eluted. Peptid kitleler daha sonra belirlenir ve öncü iyonlar daha fazla peptidler parçalanma için seçilir. Proteinler sonra arama peptid ve bilinen bir veritabanında karşılık gelen parçası kitleler tarafından tanımlanır. Bu yordam sadece peptidler/protein değil, aynı zamanda bir kitle değişim habercisi peptidler ve değişiklik7taşıyan parçası iyonları neden onların translasyonel modifikasyonlar kimliği verir. Bazı yapısal kütle spektrometresi birçok teknikler üzerinde bu ilke4,8temel alır. Örneğin, hidrojen döteryum Satım9,10gibi teknikleri etiketleme, kimyasal etiketleme stratejileri11,12veya radikal hidroksil ayak baskı13,14 , yüzey erişilebilirlik belirli koşullar altında proteinlerin içine anlayışlar verebilir.
(Amino asitlerin birbirine yakın onların fonksiyonel gruplar aracılığıyla kovalent bağ içeren cross-linking kimyasal) başka bir tekniktir. Bunun için istihdam15,16kimyasal reaktifler, UV alınabilen reaktifler veya amino asitler vardır. İlişkilendirerek sonra proteinler genellikle proteaz ile hidrolize ve çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi analiz edilir. Cross-linking ürünler arama, veritabanı tarafından kimlik ancak, çeşitli proteinler ve birbirinden farklı bölgeler17,18,19peptid dizileri bir arada özel yazılım kullanımı gerektirir. Kimyasal cross-linkers kullanımı ilgi hemen hemen her protein kompleksi için istihdam ve does değil istemek sadece protein konak hücreleri ilgi ifade edilirken elde edilebilir ve UV alınabilen amino asitler, birleşme avantajı vardır. Bu nedenle, cross-linking çok yönlü bir araçtır ve başarıyla birçok yapısal bile büyük protein derlemeler20çalışmalarda istihdam edildi.
Kütle spektrometresi (bazen olarak adlandırılır 'Yerel' kütle spektrometresi) olduğu gibi protein kompleksleri, diğer taraftan, peptidler sağlam protein ve protein kompleksleri hidroliz olmadan analizini içerir. Kompozisyon, heterojenlik, stoichiometry, topoloji ve alt birim etkileşimleri protein kompleksleri21,22ortaya koymaktadır. İyon hareketlilik ile birlikte, yerel kütle spektrometresi daha da onların uyum23,24tayini sağlar. Bu geleneksel yapı teknikleri tarafından değerlendirmek zordur protein kompleksleri yapısal incelenmesi için güçlü bir araç sağlar. Ancak, yerel kütle spektrometresi kovalent olmayan protein etkileşimleri electrospray iyonlaşma sırasında korumak analiz arabellekleri gerektirir. Bu genellikle sulu, uçucu arabellekleri amonyum asetat25gibi kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, araç değişiklikler ayrılma Kütle Spektrometre26gaz fazına iletim sırasında önlemek gereklidir. Bu şekilde uygulanan, birçok (büyük) protein kompleksleri analiz edildi. Sağlam ribozomlara27, ATP synthases28veya virüs29çalışmaları etkileyici örnekleridir.
Yerel kütle spektrometresi ve cross-linking önceki çalışmalarda özellikle başarılı oldu. Kimyasal cross-linking proteinler arasında düzenlemelerin ortaya iken Örneğin, refakatçi kompleksleri, beklenmedik bir Hsp70 dimer dahil olmak üzere stoichiometries olduğu gibi protein kompleksleri kütle spektrometresi deneylerden elde edilebilir derlemeler30,31. Farklı bir çalışmada, karmaşık bir bozulmamış ATP sentaz üzerinde translasyonel modifikasyonlar etkileri incelenmiştir. Yerel kütle spektrometresi protein kompleksi istikrar anlayışlar fosforilasyon veya asetilasyon32,33içinde sağlanan. Karşılaştırmalı cross-linking strateji34 sonra farklı koşullar altında karmaşık proteinin konformasyon değişiklikler ortaya çıkar.
Burada, protein tanımlama için kütle spektrometresi, (kimyasal) cross-linking ve veri analizi ve yorumu (şekil 1) dahil olmak üzere yerel kütle spektrometresi tarafından protokolleri sağlamak. Tamamlayıcı sonuçları iki iyi karakterize protein kompleksleri yardımıyla bu yöntemlerle elde edilen gösterdiği35birleşimidir. Bizim iletişim kuralı belirli saflık ve konsantrasyon saf herhangi bir protein bütünleştirilmiş uygulanabilir. Yaklaşım veri, Yani, veritabanının boyutunu cross-linking veri analizi tarafından sınırlı bazı durumlarda, gerekli arama uzay ve zaman belirler istihdam edilmektedir. Buna ek olarak, belirlenen çapraz bağlantıları el ile doğrulama kez gereklidir ve çıkış daha da azaltır. Yerel kütle spektrometresi çoğunlukla örnek kalite, örneğin, arabellekleri tarafından sınırlıdır ve adducts onları sulu ve uçucu arabellekleri tarafından Döviz için arıtma ve olasılığını sırasında kullanılan. Ancak, yapısal analiz için genellikle saf protein kompleksleri bizim protokol ile başarılı analiz için gerekli kalite var.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

Proteinlerin çeşitli hücresel işlevlerini gerçekleştirecek formu etkin ve dinamik derlemeler için onların ligandlar etkileşim. Bu etkileşimler elucidating bu nedenle hücresel süreçleri anlamak için esastır. Ancak, birçok protein kompleksleri dinamik derlemeler ve konvansiyonel yapısal teknikleri tarafından erişilebilir değildir. Kütle spektrometresi bu derlemeler yapısal araştırmaya katkıda bulunur ve özellikle çeşitli kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi kendi Yapısal düzenleme değerli içgörüler sunar.
Bu makalede, biz uygulama ve iki tamamlayıcı kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi tanımlamak, yani kimyasal cross-linking kütle spektrometresi ve yerel kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Kimyasal cross-linking amino asitlerin birbirine yakın kovalent bağ kimyasal reaktifler kullanarak içerir. Sonra sindirim proteaz ile çapraz bağlı di-peptidler kütle spektrometresi tarafından tanımlanır ve protein etkileşimleri ele geçen sitelerdir. Yerel kütle spektrometresi Öte yandan bir Kütle Spektrometre gaz aşamasında olduğu gibi protein derlemeler analizidir. Protein stoichiometries yanı sıra protein ve ligand etkileşimleri ortaya koymaktadır. Her iki tekniğin de bu nedenle protein-ligand derlemeler ve onların birlikte önceki çalışmalarda güçlü olduğunu kanıtladı yapısını tamamlayıcı bilgi sunar.

Yapısal proteinler ve onlar formu kompleksleri onların işlevini anlamak için temel analizidir. Boyutu ne olursa olsun ilgi hemen hemen her karmaşık uygulanabilir veya heterojenite örnek kütle spektrometresi yapısal soruşturma için önemli ölçüde katkıda bulunur. Protokol iki iyi karakterize protein kompleksleri kullanarak örnekler; ilk olarak, hetero-dodecamer RvB1/B2 C. thermophilum ve saniye, hetero-octameric CPS E. colikarmaşık.
İlk kez, iki kompleksleri protein bileşenleri tespit. Bunun için proteinler SDS-PAGE tarafından (Şekil 2) ayrı kaldık ve jel bantları jel kesilmiş. Jel sindirimi proteinlerin sonra peptid karışımı tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi analiz edildi ve peptid ve parça kitleler veritabanı arama için tabi tutuldu. Bu iş akışını takip biz yüksek güven ile Yani, tüm protein alt iki kompleksleri, tespit peptidler makul peptid puanları ile çok sayıda yüksek sıra kapsama tüm protein alt (Tablo 1 için verimli gözlenmiştir ).
Biz o zaman yerli kütle spektrometresi (şekil 3A) tarafından olduğu gibi RvB1/B2 karmaşık analiz edildi. Kütle spektrumu iki tür, bir yaklaşık 8.000 m/z ve başka bir tür yaklaşık 11.000-12.000 m/zsaptandı. Bu türler için hesaplanan kitleler hexameric (RvB1)3(RvB2)3 yüzük (yaklaşık 310 kDa) ve dodecameric çift-ring (RvB1)6(RvB2)6 (yaklaşık 620 kDa) karşılık gelir. Her iki tepe serinin iki popülasyonun gösterisi; Bunlar onun etiketli ve etiketsiz RvB2 alt birimleri komplekslerinde karışımı kaynaklı. RvB1/B2 karmaşık için kristal yapısı daha önce36 elde edildi ve çift-ring (şekil 3B) yerleşimi gösterir. Yerel kitle spektrum olduğu gibi dodecamer stoichiometry bu nedenle onaylar ve ayrıca istikrarlı bir alt kompleksi ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, ortak mevcut nüfus tanımlanır.
RvB1/B2 kompleks içinde protein etkileşim siteleri belirlemek için biz kimyasal olarak saf karmaşık BS3 cross-linker ile cross-linked. İlk BS3 miktarı en yüksek konsantrasyonu belirlemek için cross-linking reaksiyonu sırasında titre. BS3 Amin özgü ve kovalent bağlantılar lizin yan zincirleri gibi proteinlerin N termini olduğunu. Cross-linking tepki SDS-PAGE tarafından (şekil 2A) izledi. Çapraz bağlantılı kompleks RvB1 ve RvB2 alt birimleri gösterdi. BS3 reaksiyon karışıma ekleyerek protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan proteinlerin kovalent bağ neden oldu. SDS jel çapraz bağlı protein alt azalır iken BS3 miktarda artan çapraz bağlı türler daha yüksek miktarlarda verim gösterir. Daha sonra jel protein grup kesmek ve protein etkileşim siteleri tanımlamak için yukarıda verilen protokolü takip ettim. Bir çapraz bağlı di-peptid bir örnek spektrum (şekil 3 c) gösterilir. Yelpazenin her iki peptidler bu protein etkileşimi teyit y-iyon dizi gösterir. Toplamda, alt birimleri RvB1 ve RvB2 ve RvB2 iki kopyası arasındaki iki çapraz bağlantıları arasında dört çapraz bağlantıları da dahil olmak üzere 14 protein etkileşimler elde edilen (Tablo 2). BS3 sonuçlarından Cross-linking intra moleküler etkileşimleri yanı sıra farklı alt birimleri arasındaki etkileşimleri gösteren bir etkileşim ağı (şekil 3D) içinde görüntülenir. İntra moleküler çapraz bağlantıları tavsiye ederim RvB1 ve RvB2 alt birimleri N ve C terminali etki alanları yakın bir şekilde katlayın. Dikkat, intra moleküler etkileşimler aynı alt birim arası moleküler etkileşim bu durumda seçkin olduğunu. İki alt birimleri arasında arası moleküler çapraz bağlantıları da tespit edildi. Bunlar cross-linking yaklaşım doğrulama yapısı içinde RvB1 ve RvB2 arasında iki arası moleküler çapraz bağlantıları görüntülenmeyecektir. Diğer arası moleküler çapraz bağlantıları kristal yapısı içinde bulunmayan esnek döngüler içinde yer alır. Biz de aynı peptid dizileri içeren iki çapraz bağlantıları RvB2 içinde tespit. Bu çapraz bağlantıları belirsizliğe yer bırakmadan aynı protein (şekil 3D) iki kopyasını kaynaklanan gerekir arası moleküler olarak sınıflandırılabilir. Bizim cross-linking deneyler protein etkileşim siteleri kompleksi içinde aynı zamanda varolan kristal yapısı (şekil 3B) tarafından da teyit kendi Yapısal düzenleme anlayışlar sağlayan protein alt içinde ortaya koyuyor.
Biz okudu ikinci protein kompleksi CPS yapıldı. Yerel kitle spektrum (şekil 4A) üç protein kompleksleri arasında 6000 ve 12.000 m/zsaptandı. 640 kDa en büyük karmaşık olduğu gibi hetero-octamer karşılık gelir. Daha küçük kompleksleri iki alt kompleksleri temsil eder; küçük ve büyük CPS altbirimden (160 kDa) ve her alt birim (320 kDa) iki kopyasını içeren bir heteroseksüel tetramer dimer. Bu alt komplekslerin protein derleme içine ilk anlayışlar teslim; Yani, büyük ve küçük alt birimleri doğrudan temas (hetero-dimer tarafından ortaya gibi) ve tetramer iki dimer bir ürün olabilir. Sağlam CPS karmaşık yapısal düzenleme hakkında daha fazla bilgi elde etmek için tandem kütle spektrometresi (MS/MS) hetero-octamer ve heteroseksüel tetramer gerçekleştirilen. Her iki durumda da habercisi küçük alt birim derleme (4B rakam) çevre içinde yer aldığını öne üzerinden ayrışmış küçük alt birim. Gerçekten de, küçük alt birim kullanılabilir kristal yapısı (şekil 4 c)44periferik.
Kimyasal BS3 cross-linker kullanarak cross-linking da gerçekleştirildi. Artan miktarda kullanarak, CPS alt birimleri kovalent bağ geliştirilmiş oldu. Proteinlerin sindirimi ve yukarıda açıklandığı gibi peptidler analiz sonra birçok protein etkileşimleri büyük alt birim ve küçük alt birim içinde bir hibrid içinde (Tablo 2) elde edilmiştir. Ayrıca, benzer şekilde RvB1/B2 karmaşık, büyük CPS alt birim iki kopyası arasındaki iki arası moleküler çapraz bağlantılar bulduk. Bu çapraz bağlantıları her C-terminal yan yana karşı karşıya iki büyük alt birimleri yerleştirin. Bir önceki çalışmada, yapısal kütle spektrometresi ve sayısal modelleme35, biz hangi büyük olasılıkla iki büyük alt birim tarafından onaylanmış kopyalarını arabiriminden kaynaklanan üç ek etkileşimleri büyük alt birim olarak tespit kristal yapısı ve elde edilen modeli (şekil 4 c ve Tablo 2). Bu etkileşimler CPS çekirdek düzenlenmesi dört büyük alt birimleri oluşan karmaşık olanak sağlar. Ancak, küçük ve büyük alt birimleri arasında hiçbir arası alt birim çapraz bağlantıları tespit edildi. Kullanılabilir kristal yapısı (şekil 4 c) inceleyerek, hangi açıklayabilir büyük alt birim ve periferik küçük alt birimleri oluşan kompleks tetrameric çekirdek arasındaki etkileşim yüzey çok küçük olduğunu ortaya çıkıyor arası alt birim etkileşimleri olmaması. Bu küçük alt birim kolayca sağlam kompleksler küçük bağlama arabirimi nedeniyle büyük olasılıkla gelen ayrışıp gösterdi yerli kütle spektrometresi tarafından doğrulanır. Yine de, CPS karmaşık kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi birlikte protein etkileşimleri kendi Yapısal düzenleme (şekil 4 d) araştırma izin.
Birlikte ele alındığında, yerel kütle spektrometresi ve kimyasal çapraz bağlı peptidler, kitle spektrometrik tanımlaması ile birleştiğinde cross-linking kombinasyonu her iki örnek kompleksleri yapısal düzenlemenin sulandırma sağlar. Kimyasal ilişkilendirerek ortaya protein alt, örneğin etkileşim RvB1 ve RvB2 arasında veya CPS, tetrameric çekirdek içinde düzenlenmesi sırasında yerel kütle spektrometresi protein stoichiometries sağlam kompleksleri, teslim ve yaygın subcomplexes. CPS, kendisi için hiçbir arası moleküler etkileşim iki alt birimleri arasında kimyasal cross-linking tarafından gözlenen durumunda büyük her alt birim bir küçük alt (şekil 4 d) ile etkileşim yerli kütle spektrometresi öneriyor. Tandem kütle spektrometresi önerilen bir karmaşık ve her iki alt birimleri arasında küçük bir arabirim küçük alt birimi periferik yerleşim.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı yerel kütle spektrometresi ve cross-linking. Her iki tekniğin de tamamlayıcı sonuçlar. Yerel kütle spektrometresi stoichiometries ve etkileşim modülleri ortaya koymaktadır iken, cross-linking kompleksleri içerisinde protein etkileşim siteleri anlayışlar verir. Not Yalnızca kimyasal cross-linking ikili etkileşimleri ortaya koymaktadır. (A) yerel kütle spektrometresi ilk adımda uçucu ve sulu arabellek filtre cihazları veya jel filtrasyon sütunları kullanarak Exchange'e arabellek olduğunu. Kütle spektrometresi sağlam protein kompleksleri, sonra kendi stoichiometry ortaya koymaktadır. Tandem kütle spektrometresi deneylerde periferik alt birimleri ayrışmış. (B) kimyasal cross-linking için protein kompleksi cross-linking reaktif ile inkübe. Çapraz bağlı protein sonra tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi daha sonra analiz peptidler içine sindirmek. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Şekil 2: SDS-sayfa, çapraz bağlı RvB1/B2 (A) ve CPS (B) kompleksleri. (A) 2.5 µM RvB1/B2 jel lane yüklü. BS3 konsantrasyonu çeşitli. Sigara çapraz bağlı RvB1/B2 yaklaşık 50 kDa iki protein alt gösterir. BS3 yanı sıra protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan protein alt kovalent bağ neden oldu. Çapraz bağlı türler miktarı ile daha yüksek BS3 konsantrasyonları artar. Optimal koşullar cross-linking vurgulanan (kırmızı) vardır. (B) 10 µM CPS jel lane yüklü. Büyük (90 kDa) ve küçük (40 kDa) CPS alt birimleri elde edilir. BS3 yanı sıra protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan protein alt kovalent bağ neden oldu. Optimal koşullar cross-linking vurgulanan (kırmızı) vardır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Şekil 3: Yerel kütle spektrometresi ve kimyasal RvB1/B2 karmaşık cross-linking. (A) yerel kitle spektrum RvB1/B2 ortaya iki tür; sağlam dodecamer (Yani, (RvB1)6(RvB2)6) yaklaşık 11.000-12.000 m/z ve hexameric yüzük (RvB1)3(RvB2)3 yaklaşık 8.000 m/z. Her iki tür iki popülasyonun onun etiketli ve etiketsiz RvB2 kaynaklanan göster. Spektrum35değiştirildi. RvB1/B2 (B) kristal yapısı (PDB kimliği 4WVY) gösterilir. RvB1 ve RvB2 alternatif alt birimleri iki hexameric halkalar oluştururlar. (C) bir çapraz bağlı di-peptid parçalanma spektrum. N-terminus RvB1, çapraz bağlı, RvB1. K23 ile her iki peptidler (kırmızı ve mavi) için y-iyon serisi elde edilmiştir. RvB1/B2 karmaşık elde (D) içi ve arası protein etkileşimler. Intra-net çapraz bağlantılar kırmızıyla gösterilir inter-cross-links mavi renkle gösterilir. Eklemek hangi kristal yapısı (yeşil, INSERT) görüntülenmeyecektir RvB1 ve RvB2 alt birimleri arasında iki arası moleküler çapraz bağlantıları gösterir. İki RvB2 kopya--dan kaynaklanan etkileşimleri mavi noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Şekil 4: Yerel kütle spektrometresi ve kimyasal CPS cross-linking. (A) CPS gösterir yerel kütle spektrumu üç kompleksleri. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) ve hetero-octamer (640 kDa). Spektrum35değiştirildi. (B) tetrameric ve octameric CPS karmaşık ortaya ayrılma bir küçük CPS alt birimi Tandem kütle spektrometresi. (C) kristal yapısı CPS (PDB kimliği 1BXR) gösterilir. Büyük alt birimleri bir tetrameric oluşturmak ve küçük alt birimleri kompleksi çevre içinde yer alır. İki büyük alt birim kopyaları arasındaki arası moleküler çapraz bağlantıları (yeşil) gösterilir. Büyük ve küçük CPS alt birimleri (D) etkileşimleri. Yerel kütle spektrometresi subcomplexes ortaya ve küçük alt birim periferik konumunu göstermektedir. Kimyasal çapraz bağlantıları tetrameric temel düzenlemeler CPS gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo 1: veritabanı arama sonuçlarını. Proteinler sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi ve veritabanı arama tarafından tespit edilmiştir. Protein adları katılım numarası ve açıklaması gibi protein kitle verilir. Protein puanı, protein başına gözlenen spectra sayısı ve gözlenen peptid sıraların sayısını belirtir. En yüksek maskot peptidler puanları ile beş peptidler her protein alt birimi için listelenir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo 2: çapraz bağlantıları gözlenen RvB1/B2 ve CPS. Alt birimleri kompleksleri ve çapraz bağlı artıkları verilir. Hibrid türünü (Intra - veya arası moleküler) çakışan peptid sýra ya da bir önceki çalışma35ortaya çıktı. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies at JoVE.com

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...