Name: real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

ونحن نشكر لارس Dölken لتقديم المشورة وضع العلامات 4sU لخلايا تي الأولية؛ إليزابيث غراف، وتوماس شوارزماير لمساعدة حاسمة في مكتبة الأجيال وتسلسل؛ ديرك إيك وأندرو Flatley لتوفير الأجسام المضادة رنابي و T الخلية؛ أ. هنرييت أوهلينهاوت وال [فرنزيسكا Greulich للحصول على مساعدة في إعداد المكتبة لرقاقة-seq؛ وأيده كارولين جيم فريدل المنح FR2938/7-1 و CRC 1123 (Z2) من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG)؛ وأيد جلاسماتشير الكه المنحة GL 870/1-1 من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) والمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD)، ميونيخ Zentrum هلمهولتز.

<ol>
	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

في السنوات الأخيرة، أصبح الجيش الملكي النيبالي-تسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) أداة قياسية لتحليل الكشف عن جميع داخل خلية أو الكائن حي1. ومع ذلك، فهم العملية برمتها من الخلايا تكييف استجابة لحافز/دواء معين، من الضروري تماما تحديد جميع العمليات الأساسية، بدءاً من النسخ مرناً للتجهيز، والدوران، والترجمة. لا يكاد يمكن أن تقاس التغيرات القصيرة الأجل في الجيش الملكي النيبالي النسخ بإجمالي رناسيق، نظراً للتغييرات في الجيش الملكي النيبالي إجمالي تعتمد على عوامل مثل الحمض النووي الريبي نصف حياة ونشاط النسخي، التي قالب فقيرة لتعكس تكيف الخلايا إلى الآثار البيئية2،3. وفي الواقع، تم وضع مجموعة متنوعة من التقنيات الجديدة للتسلسل التي تسمح بإجراء تحليل لمختلف خطوات عملية الجينات اللائحة4 عندما تقترن بالطريقة الصحيحة. ويصف هذا البروتوكول كيفية الجمع بين بعض تسلسل يسهل تطبيقها بدلاً من التقنيات التي تسمح لتتبع تنظيم الطبقات الأساسية مرناً بطريقة نسبية. لتحليل النشاط الترانسكربتي، وقد وصف مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل كاب-تحليل الجينات التعبير (كيج)5، واستطالة الأصلية نسخة التسلسل (صافي-seq)6وعلى نطاق الجينوم النووي التحضير (غرو-seq)7 , 8، فضلا عن بروموريديني-تسلسل (Bru-seq) و 4-ثيوريديني-تسلسل (seq-4sU)، التي تستخدم نواتج الأيض التي أدرجت حديثا في نسخها من الجيش الملكي النيبالي9،10، فقط على سبيل المثال لا الحصر. القفص ويحدد موقع بدء النسخ الدقيقة، seq صافي وغرو seq تقديم معلومات أكثر دقة حول قراءة الاتجاهات ويكشف seq 4sU (وهي الطريقة الموضحة هنا) إلا حديثا نسخها الجيش الملكي النيبالي. مع ذلك، 4sU seq حساسة للغاية ويمكن أن تطبق في أطر زمنية مختلفة لقياس كمية النشاط النسخي في تغيير نشاط الخلايا، فضلا عن التغيرات الكمية في تجهيز مرناً (الذي يحدث في غضون دقائق)9، 11،12. وعلاوة على ذلك، 4sU seq مثالية للجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي لحساب معدلات دوران الحمض النووي الريبي للجينات9. يضطلع نسخ مرناً بالثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابيي)، التي بدورها تتأثر بالعديد من العوامل، مثل عوامل النسخ والتعديلات هيستون وتفعيل/ريبريسورس العامة حتى يمكن أن تكون جزءا من النسخي المعقدة. لاختبار كيفية العديد من الجينات/المروج/محسن مناطق مرتبطة بعامل واحد، وضعت رقاقة seq، الذي هو الآن الطريقة القياسية لهذا الغرض، بسبب العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجارياً13. ومع ذلك، على الرغم من أن تشيبسيق يعطي معلومات واضحة بشأن تنظيم العوامل حيث ربط، أنها لا تعكس إذا كان الفعل يؤدي إلى تغييرات في النسخ14. ولذلك، أداء رقاقة seq مع 4sU seq هو مزيج مثالي لمثل هذه المسائل البيولوجية. تنظيم التعبير الجيني يمكن أن يحدث أيضا في مرحلة لاحقة، نظراً لمستويات البروتين ومرناً لا ترتبط بالضرورة15،16، مشيراً إلى تنظيم كبير محتمل على متعدية أو بوستترانسلاشونال مستوى، تبعاً للسياق. في عام 2011، الريبوسوم التنميط أدمجت أولاً بتسلسل الحمض النووي الريبي، وهو الأسلوب المفضل لقياس التغيرات التي تحدث في سرعة في البروتين، حيث لا تزال هناك بعض حدود حساسية مع الطيف الكتلي17الآن. في الواقع، أظهرت أسعار الترجمة التي تم الحصول عليها من هذه الأساليب لتقديم تقدير جيد نسبيا للتغييرات في مستويات البروتين (على الأقل قياس التغيرات الطويلة الأجل) والسماح بطريقة عرض أكثر تفصيلاً في عملية الترجمة، مثلاً تحديد الترجمة الجانب ابدأ، والبديل إطارات17. استخدام جميع الأساليب الأربعة اندماجي يمكن استخدامها في حالة مستقرة، بين مختلف أنواع الخلايا، أو في وقت-مسلسل التجربة الخلايا المتغيرة بسرعة11. هذا الاستخدام لمحة عامة على نطاق الجينوم للتغييرات في ربط عامل النسخ التي تؤثر على الحمض النووي الريبي النسخ وتجهيزها، والترجمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4sU-labeling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine (100 mg)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>13957-31-8</td>
			<td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &#8211;20&#176;C in aliquots of 50-500 &#181;l; do not refreeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121589</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72692005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72694005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>372978</td>
			<td>WARNING &#8211; HAZARDOUS TO HEALTH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00983.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>21341</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&#176;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634.1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td>Use in step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15&#160;ml centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &#215; g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &#8211; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32852</td>
			<td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td>Optional; includes Buffer RLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Macs Streptavidin Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-074-101</td>
			<td>Store at 4&#176;C, includes &#181;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability and stress assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9033</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab26</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-EIF2a (Ser51)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9721</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BH3I-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B 8809</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4sU Washing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA precipitation buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td rowspan="3">Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&#160;&#215;&#160;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430 R</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>One stand holds 8 &#181;Macs columns.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>ML204T</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel iBase Power System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G6400UK</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G4020-01</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2201</td>
			<td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribosome Profiling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPYSC12116 (Yeast)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPHMR12126 (Mammalian)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-25 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZG126 or MRZG12324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(High Sensitivity DNA Kit)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Already needed for 4sU-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other consumables and equipment are listed in the User guide</td>
			<td>!!!</td>
			<td></td>
			<td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Plus Marker</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Formaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Add to a final concentration of 1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP library preparation kit</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK8504</td>
			<td>Or use the kit of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-901-393-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBRgreen Master mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase, DNase free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-119915001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE pH 8.0</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (ChIP grade if possible)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Histon H3K36me3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or antibody of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding/Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP IP buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&#160;mM EDTA; 16.7&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT up to 6 months</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer I</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer II</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&#160;mM EDTA; 20&#160;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer III</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.25&#160;M LiCl; 1% NP-40; 1&#160;mM EDTA; 10&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>use this instrument for electrophoretical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or tubes special for your sonication device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &#181;l each tube)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand for tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

عند التنشيط، تغيير الخلايا سريعاً على البرامج الفنية، ومن ثم صورتها التعبير الجيني. تحدث تغييرات هائلة في التعبير الجيني، على سبيل المثال، خلال التمايز الخلوي و morphogenesis والتحفيز الوظيفي (مثل تنشيط الخلايا المناعية)، أو بعد التعرض للمخدرات وعوامل أخرى من البيئة المحلية. اعتماداً على نوع التحفيز والخلية، هذه التغيرات تحدث بسرعة وعلى أي مستوى ممكن لتنظيم الجينات. عرض جميع العمليات الجزيئية للخلية المستجيبة لنوع معين من مدمني المخدرات التحفيز واحدة من أصعب المهام في البيولوجيا الجزيئية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يتيح التحليل المتزامن لطبقات متعددة من تنظيم الجينات. قارنا، على وجه الخصوص، عامل النسخ ملزمة (الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن-تسلسل (الرقائق-seq)) والنسخ دي نوفو (4-ثيوريديني-تسلسل (4sU-seq))، وتجهيز مرناً، ودوران، فضلا عن الترجمة (الريبوسوم إنشاء تشكيل جانبي). وبالجمع بين هذه الأساليب، من الممكن لعرض مسار عمل مفصلة والجينوم على نطاق المنظومة.
تسلسل الحمض النووي الريبي يدون حديثا ينصح خاصة عند تحليل سرعة تكييف أو تغيير الأنظمة، حيث يصور هذا النشاط الترانسكربتي من جميع الجينات خلال وقت التعرض 4sU (بغض النظر عما إذا كانوا حتى-أو دوونريجولاتيد). بالإضافة إلى ذلك يسمح اندماجي استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع والتنميط الريبوسوم في حساب معدلات الدوران وترجمة الرنا. ويتيح تحليل Bioinformatic نتائج التسلسل الفائق للعديد من الوسائل لتحليل وتفسير البيانات. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن أيضا تتبع الربط كوترانسكريبشونال والبديلة، اكتفى هنا بذكر عدد قليل من النتائج المحتملة.
يمكن تطبيق النهج الموحد المذكور هنا للكائنات نموذج مختلفة أو أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، ونحن توفير بروتوكولات مفصلة لكل أسلوب استخدامها، بما في ذلك عمليات مراقبة الجودة، ومناقشة المشاكل والمخاطر المحتملة.

4 سو العلامات: التحقق من الأمثل 4 شروط وضع العلامات سو (المبرمج، والإجهاد النووية، الإجهاد هيولى) والوقت وتركيز: يمكن أن تمنع إنتاج وتصنيع الرنا الريباسي مستويات عالية من 4sU والحث على الإجهاد هيولى فضلا عن النووية30. ولذلك، ينبغي اختبار خلايا فائدة للإجهاد الناجم عن 4sU فضلا عن المبرمج. يوصي بإجراء تحليل لطخة غربية لتصور تراكم p53، الذي يشير إلى التوتر النووي، زيادة مستويات والرمات-EIF2a الذي عرض هيولى الإجهاد والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحليلاً للمبرمج. يمكن استخدام مستويات مرتفعة والتعرض المطول ل 4sU أو الأدوية مثل ثابسيجارجين أو زرنيخيت للحث على الإجهاد الخلوية. للحث على موت الخلايا المبرمج أو، تعامل الخلايا مع BH3I-1 (500 نانوغرام/ميليلتر) أو المحتضنة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية (صدمة الحرارة). أنيكسين V/7-عاد تلطيخ استخدمت لتحديد خلايا الميت (7-الإغراق) وأبوبتوتيك (أنيكسين V). وضع العلامات في المختبر تولد خلايا Th1 أولية ح 0.5 مع 500 ميكرون 4sU (تركيز نهائي) أو ح 1 مع 200 ميكرومتر 4sU لا يدفع علامات الإجهاد الخلوية لا المبرمج (الشكل 1) لكن يؤدي إلى إدماج 4sU كافية.
الجيش الملكي النيبالي وسم وقت يمكن اختصارها أيضا (دي فايف دقيقة) مما يؤدي إلى زيادة قصيرة الأجل إينترونيك تسلسل مرات وضع العلامات مقارنة بفترة أطول. تصور معدلات الربط كوترانسكريبشونال، ينبغي أن لا تتجاوز مرات وسم 4sU 30 دقيقة. لمزيد من التفاصيل بشأن 4sUlabeling، الرجاء الرجوع إلى Rädle وآخرون. 19
مراقبة الجودة: سلامة الحمض النووي الريبي ذات أهمية كبيرة عند تجهيز الجيش الملكي النيبالي. الأكثر ملاءمة للتحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU بعد بيوتينيليشن بتحليل اليكتروفوريتيكال (انظر الجدول للمواد). النظر في التحقق من الحمض النووي الريبي المعزولة من الخطوة 2.2.2، خصوصا عند استخدامه لتسلسل مجموع الجيش الملكي النيبالي. يجب أن يكون رقم سلامة الحمض النووي الريبي (رين) إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي لمواصلة تجهيزها (الشكل 3).
يمكن أيضا استخدام تحليل اليكتروفوريتيكال للتحقق من الحمض النووي الريبي يدون حديثا. كن على علم أن يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي يحتوي على ررناس أقل نضجاً كبيرا مقارنة بمجموع الجيش الملكي النيبالي مع العصابات الرنا الريباسي نموذجي يجري بارزة أقل بكثير.
الريبوسوم التنميط: [بكر] تضخيم مكتبة كدنا: كدنا التضخيم (الخطوة 4.9.1) خطوة حاسمة لضمان تحقيق نتائج جيدة التسلسل. تحليل مكتبات تضخيم بتحليل اليكتروفوريتيكال. يبين عينة جيدة من مكتبات تضخيم ذروته حول bp 140-160 (الشكل 4 أ). كميات مفرطة من محول dimers ينبغي تجنبها (الشكل 4 باء)، ويجب تنقية تلك العينات كذلك استخدام الإجراء تنقية صفحة طبقاً للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (تنقية صفحة منتجات PCR). يمكن أن ينتج الكثير القالب أو عدد كبير جداً من PCR دورات التضخيم المفرط وتتميز بظهور بقع PCR المنتجات، عصابات الوزن الجزيئي أعلى مما كان متوقعا ومحول ديمر المنتجات (الشكل 4). لمعظم العينات 1-5 ميليلتر من كدنا سيركولاريزيد و 9 دورات PCR للتضخيم سوف تسفر عادة عن كميات كافية من المنتج بكر الصحيح.
رقاقة: القص الكروماتين: شروط القص الأمثل تحتاج إلى تعديل لكل نوع من الخلايا. تحديد شروط القص (مثلاً، عدد الدورات، طاقة عالية أو منخفضة) مقدما. استخدام نفس العدد من الخلايا ونفس وحدة التخزين لأغراض، الاختبار منذ أقل كثافة خلية يزيد من كفاءة الإمالة. في محاولة لتجنب أكثر-أو تحت-القص الكروماتين. أجزاء كبيرة من الكروماتين هائلة يمكن أن تؤثر على نتائج رقاقة من انسداد، والقص المفرط يمكن أن تدمر [ابيتوبس] على البروتين للفائدة، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة ملزم بالجسم. في هذه التجربة، وتحققت أفضل النتائج عندما كان الكسر الرئيسي من الكروماتين المنفصمة حوالي 1,000 بي بي أو أقل قليلاً (الشكل 5A).
"رقاقة التحقق من" قبل قبكر: قبل البدء في الشريحة، فإنه من المستحسن اختبار إذا كان جسم المستخدمة مناسبة لشرائح (إذا كان ذلك ممكناً، استخدام رقاقة الصف الأجسام المضادة) برقاقة qPCR. تحقق من الرقائق للتسلسل ب qPCR قبل البدء في إعداد مكتبة (راجع الخطوة 5.6.5). كبسولة تفجير تصميم التي تربط إلى موقع هدف معروف من بروتين الفائدة. إذا كان الموقع الهدف المحدد ضمن جينات غير معروف، يمكن استخدام العديد من أزواج التمهيدي لفحص الجينات والعناصر التنظيمية المرتبطة بها. لرقاقة Th1 رنابي الخلايا إيفنج، الذي ترانسكريبتيونالي أوبريجولاتيد على التحفيز، والإشعال أكتين يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي. Sox9 و الأنسولين بمثابة عنصر تحكم سلبية، حيث لم يتم التعبير عن هذه الجينات في خلايا Th1 (الشكل 5 (ب)). تذكر أن لا تستخدم كبسولة تفجير إكسون الممتدة، التي عادة ما تستخدم ل qPCR مرناً. يمكن أيضا استخدام عنصر تحكم مفتش لإثبات خصوصية جسم المستخدمة. ويمكن قياس "الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد" مع فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). كميات من الحمض النووي نونسبيسيفيكالي ملزمة بمراقبة مفتش ينبغي إلى حد كبير أقل مقارنة بكمية الحمض النووي ملزمة بالضد المصلحة.
وإنشاء نسخ متماثلة: دليل على الأهمية البيولوجية: وينصح بشدة إجراء التجربة الحركية لجميع الأساليب بدءاً من نفس المجموعة من الخلايا التأكد من الخلايا لها نفس الهوية لجميع العينات غير المعالجة والمعالجة (الشكل 2). ومع ذلك، من المستحسن اتخاذ مختبرين صغيرة من النقاط الزمنية الرئيسية لكل طريقة لمقارنة العينات تكرار بيولوجية (مثلاً، من قبكر، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية). هذا يسمح بإجراء تقدير تقريبي إذا كان العلاج لكلا replicates استنساخه ويمكن الشروع في التسلسل. ينبغي إجراء التحقق من الصحة replicates عن طريق تحليل بيوينفورماتيكال. إمكانية تكرار نتائج النتائج يمكن تقييمها من حيث العلاقة بين قيم فبكم بين replicates وتصور استخدام التبعثر مؤامرات (الشكل 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> الشكل 1: تحقق ظروف المثلى وسم 4sU دون مقاومة فيزيولوجيا الخلية (الشكل من داوري et al. 11) (أ) الكشف عن الخلايا المبرمج بنظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل: في المختبر ولدت Th0 الخلايا عولجوا بتركيزات مختلفة من 4sU (بين قوسين) ح 0.5 و 1 ح ح 2، على التوالي. واستخدمت العلاج BH3I-1 لحمل المبرمج يحدده V أنيكسين، بينما استخدمت صدمة الحرارة (5 دقائق عند 95 درجة مئوية) للحث على موت الخلايا التي تحددها 7-عاد. (ب) تحليل لطخة غربية ل p53 4sU معاملة وتنشيط خلايا T: كانت وصفت عينات مع 200 ميكرومتر 4sU لوقت التنشيط، فيما عدا الوقت ح 0.5 نقطة التي وصفت مع 500 ميكرون 4sU المشار إليها. (ج) تحليل لطخة غربية EIF2a والرمات ومجموع EIF2a في تنشيط خلايا Th1 بنفس الشروط التي وصفها كما هو الحال في (ب). ثابسيجارجين كعنصر إيجابي. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> الشكل 2: نظرة عامة التخطيطي لإعداد الحركية لتعقب التغييرات على نطاق الجينوم يوضح هذا المخطط الإعداد للجمع بين 4sU seq مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط الريبوسوم، ورقاقة-seq لدراسة التغييرات على نطاق الجينوم عند معالجة الخلية. تجمع الخلايا وتوضع جانبا على العدد المطلوب من الخلايا لعنصر التحكم غير المعالجة. علاج الخلايا المتبقية وتقسيم لكل أسلوب ووقت نقطة. قم بتسمية الخلايا غير المعالجة أو المعالجة ل seq 4sU مع 4sU كما هو موضح. النقاط الزمنية وعينات لكل أسلوب يعتمد على مسألة بيولوجية محددة يجري بحثها. أخذ عينات لكل نقطة الوقت والأسلوب، واتبع الجزء المخصص من البروتوكول. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> الشكل 3: مراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU تم تحليل مجموع الجيش الملكي النيبالي وبيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خلايا Th1 المنشط في بيواناليزير. ترد الرنا الريباسي 18S والرنا الريباسي 28S وعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) بالصك لتحديد وحدة من الجيش الملكي النيبالي. ينبغي أن يكون رين إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> الشكل 4: بيواناليزير لمحات من الريبوسوم التنميط المكتبات مكتبة جيدة (A) A: يظهر العينة ذروتها في نطاق الحجم المتوقع (140-160 bp) وهناك حاجة إلى لا تنقية إضافية. (ب) هذا النموذج يظهر محول المفرطة ديمر تضخيم المنتج (120 شركة بريتيش بتروليوم) بالنسبة إلى المنتج المطلوب (bp 140-160). هذه المكتبة يتطلب المزيد من تنقية. (ج) نموذج تضخيم الإفراط: الوزن الجزيئي قمم أعلى من المتوقع وبقع بكر أمبليكونس مرئية (المشار إليها بواسطة الأسهم). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> الشكل 5: حجم الكروماتين الأمثل بعد القص والتحقق من شرائح من قبكر (أ) [اغروس] هلام الصورة يظهر حجم جزء الأمثل الكروماتين المنفصمة من ثلاث عينات المنفصمة لدورات 25 في سونيكاتور وتنقيته كما هو موضح من قبل في البروتوكول. (ب) تمثل نتائج Q PCR "شريحة رنابي" مجموع (مكافحة-الجيش الملكي النيبالي بول الثاني، 8WG16، ab817) كنسبة مئوية من المدخلات. وتستخدم كبسولة تفجير إيفنج و أكتين إيجابية بينما Sox9 و الأنسولين هي عناصر سلبية (كلا الجينات لم يتم التعبير عن تنشيط خلايا Th1). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> الشكل 6: مقارنة بين البيولوجية يتطابق (الشكل من داوري et al. 11) مؤامرة مبعثر الممثل مقارنة قيم التعبير (فبكم) بين وإنشاء نسخ متماثلة من ح 4 الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا (4sU) بعد التحفيز لتنشيط خلايا Th1. يشير الخط الأخضر إلى قيم فبكم متساوية وتتم الإشارة إلى ارتباط الرتب في كل الأرض.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>المدة لوضع العلامات (دقيقة)</td>
			<td>تركيز 4sU الموصى بها (ميكرومتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100-200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15-30</td>
			<td>500-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500-2000</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: أوصى بتركيزات 4sU (من Rädle، وآخرون- 19) تتم الإشارة إلى التركيزات الموصى بها 4sU لأوقات مختلفة لوضع العلامات.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الأسلوب</td>
			<td>عدد الخلايا</td>
			<td>كمية الحمض النووي الريبي</td>
		</tr>
<tr>
<td>وسم 4sU</td>
			<td>إيه تو × 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>الريبوسوم التنميط</td>
			<td>إيه تو x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>رقاقة-seq</td>
			<td>إيه تو × 107 -3 × 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: المبلغ المطلوب من الخلايا الأولية الحصول على الحد الأدنى من الخلايا الأولية المطلوبة لكل أسلوب. المبالغ يمكن أن يكون أقل عند استخدام أنواع الخلايا الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ويصف هذا البروتوكول اندماجي استخدام رقاقة seq 4sU seq، وتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع والريبوسوم التنميط لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. فإنه يمكن تتبع التغييرات في النسخ-عامل ملزم، النسخ حيثياته وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، ودوران والترجمة على مر الزمن، وعرض مسار الأحداث عموما في الخلايا المنشط و/أو المتغيرة بسرعة.

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...