Name: real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

אנו מודים לארס Dölken לייעוץ להקים 4sU תיוג עבור תאי T הראשי; אליזבת גראף, תומאס Schwarzmayr לעזרה קריטי ב ספריית דורות ורצף; דירק Eick, אנדרו פלטלי על מתן נוגדנים RNAPII ו תא T; (ש ע) הנרייטה Uhlenhaut, פרנציסקה Greulich לעזרה כהכנה ספריית שבב-seq; קרוליין ג פרידל נתמכה על ידי מענקים FR2938/7-1 ו- CRC 1123 (Z2) מ דויטשה פתוח (DFG); אלקה Glasmacher נתמכה על ידי המענק GL 870/1-1 פתוח דויטשה (DFG) וממרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD), מינכן זנטרום הלמהולץ.

<ol>
	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ניתוח התהליך כולו של הכונה יש צורך להבין עיבודים הסלולר בתגובה גירוי ספציפי או טיפול. שילוב של RNA הכולל-seq, 4sU-seq ריבוזום פרופיל, צ'יפ-seq בנקודות זמן שונות מוביל ניתוח מקיף של התהליכים העיקריים של הכונה לאורך זמן. הבנה עמוקה של תהליכים ביולוגיים נדרש להגדיר את הגדרת הניסוי, כמו גם נקודות זמן אופטימלי.
מאז שיטות ללמוד הכונה לשפר במהירות, פרוטוקולים אלה ניתן להתאים לשינויים מהירים. למרות זאת, הם מספקים את השיטות הכי חשוב ללמוד ג'ין בסיסי מנגנוני רגולציה בכל סוג של תא. כאן, אנו נדון כמה מלכודות ו עובדות צריך לשקול בעת שימוש בשיטות אלה.
תאים: התאים חייבים להיות מאוד מעשית, אם משתמש ראשי תאים מבודדים, הטוהר של אוכלוסיות תאים יש להבטיח (למשל, FACS ןועברל העיקרי T תאים). התאים ואפילו מעט לחוץ יכול להשפיע על התוצאות של שיטות אלה רצף רגיש מאוד להפחית את כמות לאחרונה משועתקים או מתורגמת RNA ו להוביל המפרט לא רצויים של תגובת המתח בתוצאות רצף. מהירות צנטריפוגה המוזכרים בפרוטוקול זה כדי הצניפה תאים ממוטב העיקרי בתאי T. לפיכך, להתאים את המהירות בהתאם לסוג התא.
4 סו השפעות על פיזיולוגיה של התא: בנוסף האפשרויות הנ עבור אימות של ההפרעות מינימלי כדי פיסיולוגיה תאית על תוספת 4sU, ניתוח נוסף ו/או נוספים ניתן לבצע, במיוחד כאשר מספרי הטלפון הנייד מוגבלים. השפעות על התפשטות תאים יכולים להיבדק על-ידי אימות זמן הכפלה של תאים על-ידי רק לספור תאים עם תוויות ללא תווית. אינדוקציה nucleolar מתח יכול להיבדק גם על ידי ניתוח תא מורפולוגיה ויה immunofluorescence מכתים של nucleolin ואת הגרעינים. כדי להמשיך ולאמת את ההשפעה של 4sU, ביטוי גנים הכללית שינו ניתן למדוד על-ידי התאמת לקרוא ספירות שכותרתו RNA הכולל ל RNA הכולל ללא תווית.
תא מספרים: עבור במבחנה שנוצר בתאי T, אנו ממליצים החל לפחות את כמות התאים המצוין בטבלה 2. לבחור נאותה מספרים לפי שיטת בהתאם לסוג של תאים. מאז תאי T יש פחות הציטופלסמה ו- RNA לעומת תאים אחרים, ככל הנראה כמויות נמוכות של תאים אחרים יהיה הולם. עבור שבב-seq, מספרי הטלפון הנייד תלויים מאד הנוגדן בשימוש ואת רמת ביטוי של החלבון עניין בתוך התאים. היסטון או שבב RNAPII, תאים fewe יכול לשמש, ואילו מספרי הטלפון הנייד צריך להיות מוגברת כאשר משתמשים גורמי שעתוק, במיוחד אם הם באים לידי ביטוי ברמות נמוכות.
4 סו-תיוג ו RNA biotinylation: בעת שימוש תאים חסיד, תיוג 4sU ויכולה להיות מכוונת כפי שתואר על ידי Rädle et al. 19 מאז תאים 4sU לשלב במהירות רבה, זה ניתן להוסיף ישירות אל המדיום של השעיה, מחסידי או תאים חסיד למחצה.
מומלץ להתחיל את biotinylation עם 60-80 µg של RNA. ובכל זאת, כמויות נמוכות של RNA יכול לשמש, למרות שאנחנו לא האם בדק עבור פחות מ-30 µg. מוסיפים את coprecipitant של (למשל, GlycoBlue) כאשר מאיצים RNA אם בגדר קשה לראות. דאפי. et al. הראו גם את ביוטין מופעל methylthiosulfonate (MTS-ביוטין) בצורה יעילה יותר מגיב עם התווית על-ידי 4sU RNA מאשר HPDP-ביוטין31. לפיכך, ייתכן שווה לשקול מעבר MTS-ביוטין, במיוחד, עבור ההתאוששות של RNAs קטן, אשר נוטים להיות פחות משקעים uridine (עיין פרוטוקול biotinylation שהוזכרו על ידי דאפי ואח; ראה טיהור של התווית על-ידי 4sU RNA, נהלים ניסויית).
עבור ההתאוששות של RNA לאחרונה משועתקים, זה אפשרי להשתמש פאראמגנטיים חרוזים או RNA ניקוי חרוזים על פי בחירתך. תמיד לקחת בחשבון ערכות אלה עשויה או לא עשויה לטהר עבור RNAs ספציפיים. לדוגמה, אם אתה מעוניין miRNAs, שקול להשתמש ערכות ספציפי עבור לכידת miRNA ורצף.
כימות של RNA משועתקים החדש: לכמת במדויק RNA לאחרונה משועתקים, מדידה צריכה להתבצע על ידי fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). בתוך h 1 של חשיפה 4sU, שזה עתה משועתקים RNA מייצג כ- 1-4% של RNA הכולל. RNA משועתקים החדש של h 1 שכותרתו, תאי T מופעל מורכב ~ 90-94% של rRNA11.
ריבוזום פרופיל: בעת יצירת השיטה, קבענו כי באמצעות 1.5 x כמות נוקלאז מאשר הציע בפרוטוקול המקורי מבטיח ולעיכול תקין. כמו כן, ללא תופעות לוואי שדווחו עבור כמויות מוגברות של נוקלאז. מאז. זה די קשה כדי overdigest את RPFs בזמן שהם חלק הרנ א מחוייב ribosomal חלבונים, באפשרותך להגדיל עדיין מעט את הסכום titrate עיכול נוקלאז אופטימלית.
אם פחות מ-500 ng של RPF RNA התגלו ב שלב 4.4.2, חזור על דלדול rRNA ובריכת מטוהר RPFs עם עמודות ה-RNA נקיים & רכז-5. לחילופין, טען שני מדגמים זהים אחד לשני על הג'ל (שלב 4.5.3), פרוסות ג'ל בריכת במהלך RNA • תנאי של הג'ל (שלב 4.5.6).
מומלץ לחתוך את RPFs על ג'ל חזק ככל האפשר לחברי הלהקות nt 28, 30. פעולה זו מסייעת בהפחתת שברי לא רצויים rRNAs ו tRNAs, אשר מאוחר יותר להיות חלק מהספריה, להפחית את רצף קריאות עבור RPFs שלך.
מומלץ גם להימנע אור במהלך ג'ל טיהור UV. דבר זה יכול ליצור ניקס מקטעי רנ א, כמו גם הדימרים פירימידין, כי בסופו של דבר יכול להשפיע באופן חמור את ספריית והכנה רצף תוצאות.
ספריית הכנה ורצף של נתונים: ריבוזום פרופיל הפרוטוקול מאפשר ליצור ספריית cDNA מתאים רצף. דגימות שנוצרו על-ידי תיוג 4sU ניתן להשתמש ישירות להכנה ספריה עם כל ערכת רצפי RNA המתאים. מאז RNA לאחרונה משועתקים, במיוחד בעת שימוש קצר תיוג פעמים, עשויים שלא להיות polyadenylated, אין בחירה poly-A יש לבצעו. במקום זאת, אנו ממליצים rRNA דלדול למניעת הפחתת עומק רצף עבור המדגם בפועל. שימוש בתאי T, התחיל עם 400 ננוגרם של RNA לאחרונה משועתקים, סה כ (בהתאם הערכה, ראה חומרים), שבוצעה rRNA דלדול ואנו מופחתת מחזורי עבור הגברה PCR למזער את הטיית ה-PCR. הכנת ספריה יכולה להתבצע עם פחות חומר המוצא. עבור ספריית המורכבות מספר מחזורים PCR צריך להיות מוטבת.
עבור שבב-seq יש גם הרבה ערכות זמינים עבור ספריית הכנה. בספריה הידיים הכנה עבד טוב מתחיל עם 2 ng של ChIP הדנ א (ראה חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש). הקפד לבדוק את מדדים איזון צבע במהלך רצף. אנו ממליצים לעומק רצף של ≥40 x 10 קריאות6 , כל עבור 4sU-seq, הכולל RNA-seq, ודוגמאות שבב-seq ולאחר ≥80 x 106 קריאות עבור ריבוזום פרופיל הדגימות. העומק רצף תלוי המדגם וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם, ויש להתייחס בזהירות. כדי לנתח את קריאות intronic עבור החדרת cotranscriptional, 100 bp לזווג-קצה רצף צריך להיבחר.
רצף הטיה: רצף הפך תקן זהב בקביעת שינויים כלליים תמלול, תרגום או איגוד פקטור שעתוק. בתוך בשנים האחרונות שיטות קיימות דחפו לגבולות שלהם או טכניקות חדשות פותחו עבור קביעת רצף כמויות קטנות יותר ויותר ההתחלתי של RNA. זה דורש הגברה של cDNA, אשר מציג רעש או הטיה. לאחרונה, מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) פותחו השפעול לזהות כפילויות לראשונה על ידי ה-PCR. . לאחרונה, זה הוצגה UMIs רק במתינות לשפר כוח רצף ושיעור גילוי שווא על ביטוי גנים דיפרנציאלית32. למרות זאת, שקול להשתמש מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) עבור כל ספריות רצף לפקד עבור ספריית המורכבות, במיוחד כאשר החל כמויות נמוכות של RNA וכאשר מחזורים PCR רבים נדרשים.
מאגר ופתרונות מניות: חייבים להיות מוכנים כל מאגרים עבור 4sU-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בתנאים מחמירים נטולת RNase בעזרת נוקלאז ללא מים. מומלץ לקנות מראש ללא נוקלאז NaCl, טריס-HCl, EDTA, ציטראט נתרן ומים. כדי להבטיח נוקלאז ללא תנאים, ניתן פתרון decontaminating RNase לנקות מדי סוכר או משטחים. כל מאגרים עבור שבב-seq צריך להיות לפחות ללא DNase וניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. תמיד להוסיף מעכבי פרוטאז, וכן מעכבי פוספטאז לפני השימוש ולשמור על קרח.
ביואינפורמטיקה: ניתוח של כל הנתונים רצף (קרי, צ'יפ-seq, RNA-seq ו ribsosome פרופיל) כולל בקרת איכות (למשל, באמצעות FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), מתאם זמירה (למשלעם cutadapt20) ולאחר מכן על-ידי מיפוי הגנום הפניה לתאים שנבחנה. עבור נתונים RNA-seq (סה כ והן 4sU-seq), כמו גם ריבוזום פרופיל נתונים, ממפה נקודות spliced RNA-seq נדרש, כגון ContextMap 221. עבור שבב-seq במערכים הנתונים unspliced, באמצעות BWA-מ22 מספיקה. ניתן לחשב ביטוי גנים באמצעות מודל (קורא לכל Kilobase של אקסון לכל למפות קטעים מיליון) ' RPKM '1, לאחר קביעת לקרוא ספירות לכל הגן באמצעות של התוכנית, למשל featureCounts23. שהתקשרת שיא מנתונים שבב-seq, מספר תוכניות זמינות, למשל, מקינטוש24 או פנינה25. בהמשך ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם R26, בפרט באמצעות כלים שסופקו על-ידי project Bioconductor27.
כאן אתגר גדול בשילוב רמות ה-RNA 4sU - וסה ' כ ופעילות translational מן הריבוזום פרופיל זה נורמליזציה. בגישה קלאסית כדי לטפל בבעיה זו היא לנרמל את רמות של משק בית גנים. כדי להפחית את הרעש עקב תנודות אקראיות עבור גנים בודדים משק בית, מומלץ לא רק להשתמש כמה גנים משק בית אבל רמות החציוני עבור קבוצה גדולה, למשל > גנים משק בית 3,000 שגיבש אייזנברג, לבנון28 . עבור חישוב של RNA שיעורי מחזור של יחסי של 4sU-ל ש-RNA הכולל, נורמליזציה מבוסס על מחזור החציוני שיעורי (למשל, בהנחה של RNA half-life של 5 שעות)29. עם זאת, שכן ההנחה היא אין שינויים כוללים בהתאם לדרישה עבור גנים משק בית, אנו ממליצים להשתמש גישות ניתוח עצמאי של נורמליזציה, למשל, המתאם מבוסס-קיבוץ באשכולות של הזמן-סדרת סוגי הנתונים השונים כדי לזהות קבוצות של גנים עם התנהגות ברורים תמלול ותרגום במהלך ההפעלה. לקבלת תיאור מפורט על bioinformatical שילוב של סוגי הנתונים השונים, אנו מכנים הפרסום המקורי11.
ניתוח של אינטגרציה המחירים והנתונים מחזור: מאמר שפורסם לאחרונה33 השוואת מחצית החיים נקבע על-ידי פקד מרובבת ג'ין (MGC) שיטות גלובליות יכול להראות כי מחצית החיים בקורלציה הטוב ביותר עם אלו מתקבל על ידי שיטות תיוג מטבולית, לעומת שיטות אחרות (למשל, כללי עיכוב של תעתוק סמים). עם זאת, יש לציין כי ההבדלים בין מחצית חיים חישובים יכול להיווצר, היה מתואר 15,34. אנחנו מהווים רוב בעיות ההבדלים אשר הציג מאת תגובת המתח עקב חשיפה ממושכת 4sU. לכן, זה הכרחי כדי לא לכלול את תגובת המתח שהוצגו על ידי תיוג 4sU. כדי לתת תוקף נוסף מחזור המחירים, אנו ממליצים על השימוש MGCs.
בנוסף, ערכת נתונים כפי שנוצר כאן יכול לשמש גם עבור אינטגרטיבית יותר נתונים ניתוח (למשל, ויסות זמן אי קידוד RNAs)35,36.

בשנים האחרונות, RNA-רצף (RNA-seq) הפכה להיות הכלי סטנדרטי כדי לנתח כל ביטוי RNAs בתוך תא או של האורגניזם1. עם זאת, כדי להבין את כל התהליך של תאים בהתאמת בתגובה לגירוי/תרופה ספציפית, יש צורך לקבוע באופן מלא כל התהליכים שבבסיס, החל mRNA שעתוק עיבוד, תחלופה של תרגום. שינויים לטווח קצר שעתוק RNA בקושי נמדד על ידי הכולל RNAseq, מאז שינויים של RNA הכולל תלויים גורמים למשל RNA מחצית החיים ופעילות תעתיק, אשר הם תבנית המסכן עבור המשקף את העיבוד של תאים השפעות סביבתיות2,3. ואכן, מגוון רחב של טכניקות רצף חדשות פותחו לאפשר ניתוח של שלבים שונים בתהליך ג'ין תקנה4 בשילוב בצורה נכונה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב כמה טכניקות רצף די בקלות החלים המאפשרים מעקב אחר ברגולציה של שכבות חיוני של mRNA באופן השוואתי. ניתוח פעילות גנים ברמת השעתוק, מגוון שיטות תוארו, כגון כובע-אנליזה של ג'ין ביטוי (קייג ')5, התארכות יליד התעתיק רצף (NET-seq)6ו ברמת הגנום הגרעיני שלא נגמרות (GRO-seq)7 , 8, bromouridine-רצף (ברו-seq) וכן 4-thiouridine-רצף (4sU-seq), אשר השתמש מטבוליטים זה משולבים החדש עיבד RNA9,10, רק כדי להזכיר כמה. בעוד כלוב מזהה האתר התחלה שעתוק מדויק, נטו-seq, GRO-seq לספק מידע מדויק יותר על קריאת ההוראות ו- 4sU-seq (שהיא השיטה המתוארת כאן) מזהה רק לאחרונה עיבד RNA. עם זאת, 4sU-seq היא רגישה מאוד, יכול להיות מיושם במסגרות זמן שונות כדי למדוד כמותית פעילות גנים ברמת השעתוק שינוי אקטיבי תאים, כמו גם שינויים כמותיים עיבוד mRNA (וזה קורה בתוך דקות)9, 11,12. יתר על כן, 4sU-seq אידיאלי לשלב עם ה-RNA-seq לחישוב RNA מחזור המחירים עבור גנים9. שעתוק של ה-mRNA מתבצעת על ידי RNA פולימראז II (RNAPII), אשר בתורו מושפע על ידי מספר רב של גורמים, כגון גורמי שעתוק, שינויים היסטון, מפעילים/repressors כללי זה יכול גם להיות חלק תעתיק מורכבות. כדי לבדוק כמה גנים/יזם/משפר אזורים מאוגדים על ידי גורם אחד, צ'יפ-seq פותחה, אשר נקרא כיום השיטה הרגילה למטרה זו, עקב נוגדנים זמינים מסחרית רבים13. עם זאת, למרות ChIPseq נותן מידע ברור על איפה ויסות גורמים bind, זה לא משקף אם זה אכן מוביל לשינויים שעתוק14. לכן, ביצוע שבב-seq עם 4sU-seq הוא השילוב האידיאלי לשאלות כאלה ביולוגי. בקרת גנים יכול להתרחש גם בשלב מאוחר יותר, מאז ה-mRNA ורמות החלבון לא בהכרח מתאימות15,16, המציין תקנה משמעותי פוטנציאלי translational או post-translational רמת, בהתאם להקשר. בשנת 2011, ריבוזום פרופיל היו כבר קודם בשילוב עם ה-RNA-seq והוא עכשיו השיטה של בחירה כדי לכמת את השינויים המתרחשים במהירות חלבון, שכן עדיין יש כמה מגבלות רגישות עם ספקטרומטר מסה17. אכן, תעריפי התרגום המתקבל שיטות כאלה הוכחו לספק הערכה טובה יחסית של שינויים ברמות החלבון (נמדד לפחות ליצירת שינוי ארוך טווח) ולאפשר מבט מפורט אפילו יותר על התהליך של תרגום, למשל הנחישות של תרגום בצד התחלה ואלטרנטיבית מסגרות17. השימוש קומבינטורית בכל ארבעת השיטות ניתן להשתמש במצב יציב, בין סוגי תאים שונים, או בסדרתי זמן הניסוי התא המשתנה במהירות11. שימוש זה מספק סקירה ברמת הגנום של שינויים באיגוד פקטור שעתוק המשפיעים על שעתוק RNA, עיבוד, תרגום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4sU-labeling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine (100 mg)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>13957-31-8</td>
			<td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &#8211;20&#176;C in aliquots of 50-500 &#181;l; do not refreeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121589</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72692005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72694005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>372978</td>
			<td>WARNING &#8211; HAZARDOUS TO HEALTH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00983.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>21341</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&#176;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634.1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td>Use in step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15&#160;ml centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &#215; g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &#8211; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32852</td>
			<td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td>Optional; includes Buffer RLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Macs Streptavidin Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-074-101</td>
			<td>Store at 4&#176;C, includes &#181;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability and stress assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9033</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab26</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-EIF2a (Ser51)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9721</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BH3I-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B 8809</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4sU Washing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA precipitation buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td rowspan="3">Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&#160;&#215;&#160;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430 R</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>One stand holds 8 &#181;Macs columns.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>ML204T</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel iBase Power System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G6400UK</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G4020-01</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2201</td>
			<td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribosome Profiling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPYSC12116 (Yeast)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPHMR12126 (Mammalian)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-25 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZG126 or MRZG12324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(High Sensitivity DNA Kit)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Already needed for 4sU-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other consumables and equipment are listed in the User guide</td>
			<td>!!!</td>
			<td></td>
			<td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Plus Marker</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Formaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Add to a final concentration of 1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP library preparation kit</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK8504</td>
			<td>Or use the kit of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-901-393-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBRgreen Master mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase, DNase free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-119915001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE pH 8.0</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (ChIP grade if possible)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Histon H3K36me3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or antibody of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding/Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP IP buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&#160;mM EDTA; 16.7&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT up to 6 months</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer I</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer II</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&#160;mM EDTA; 20&#160;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer III</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.25&#160;M LiCl; 1% NP-40; 1&#160;mM EDTA; 10&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>use this instrument for electrophoretical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or tubes special for your sonication device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &#181;l each tube)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand for tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

בעת ההפעלה, תאים לשנות במהירות את התוכניות הפונקציונלית שלהם, וכך, פרופיל ביטוי גנטי. מסיבית שינויים בביטוי הגנים להתרחש, לדוגמה, במהלך התמיינות מורפוגנזה, גירוי פונקציונלי (כגון הפעלה של תאים חיסוניים), או לאחר חשיפה תרופות וגורמים אחרים מן הסביבה המקומית. בהתאם לסוג הגירוי ותא, שינויים אלו מתרחשים במהירות, בכל רמה אפשרית של הכונה. הצגת כל התהליכים מולקולרית של תא מגיבה לסוג מסוים של גירוי/סמים היא אחת המשימות הקשה ביותר בביולוגיה מולקולרית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח בו זמנית של שכבות מרובות של הכונה. אנו משווים, בפרט, גורם שעתוק מחייב (כרומטין-immunoprecipitation-רצף (צ'יפ-seq)), דה נובו שעתוק (4-thiouridine-רצף (4sU-seq)), עיבוד mRNA, ו מחזור, וכן תרגום (ריבוזום יצירת פרופיל). על ידי שילוב שיטות אלה, זה אפשרי להציג קורס מפורט של הגנום כולו של פעולה.
קביעת רצף הרנ א לאחרונה משועתקים מומלצת במיוחד בעת ניתוח במהירות התאמה או שינוי מערכות, מאז זה מתאר את הפעילות תעתיק של כל הגנים בזמן החשיפה 4sU (ללא קשר אם הם למעלה - או downregulated). השימוש קומבינטורית RNA הכולל-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בנוסף מאפשר חישוב המחירים מחזור ותרגום RNA. ניתוח Bioinformatic של תפוקה גבוהה רצף תוצאות מאפשר אמצעים רבים עבור ניתוח ופרשנות של הנתונים. הנתונים המופקים גם מאפשר מעקב אחר co-transcriptional ואלטרנטיבית שחבור, רק כדי להזכיר כמה תוצאות אפשריות.
הגישה המשולבת המתוארים כאן יכול להיות מיושם עבור אורגניזמים מודל שונה או סוגי תאים, כולל ראשי תאים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור כל שיטת שימוש, כולל פקדים איכות, ולדון בבעיות פוטנציאליות ואת החסרונות.

4 סו תיוג: ודא אופטימלית 4 סו-תיוג תנאים (אפופטוזיס, גרעיני מתח, מתח cytoplasmic), זמן, ריכוז: רמות גבוהות של 4sU ניתן לעכב את ייצור ועיבוד של rRNA, לגרום מתח cytoplasmic וכן גרעיני30. לכן, תאים עניין צריך להיבדק 4sU-induced הלחץ, כמו גם אפופטוזיס. תספיג חלבון ניתוח מומלץ להמחשת הצטברות p53, אשר מציין מתח גרעינית, הגדלת רמות פוספו-EIF2a המציגים cytoplasmic מתח, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח של אפופטוזיס. רמות גבוהות של חשיפה ממושכת 4sU או תרופות כמו thapsigargin או arsenite יכול לשמש כדי לגרום מתח סלולארית. כדי לגרום אפופטוזיס או לתא המוות, תאים שטופלו BH3I-1 (500 ng/µL) או הדגירה למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס (חום הלם). Annexin V/7-מ מכתים שימש לקביעת מוות (Annexin V) ותאים מתים (7-מ). תיוג של במבחנה שנוצר העיקרי תאי Th1 עבור h 0.5 עם 500 4sU מיקרומטר (ריכוז סופי) או h 1 עם 200 מיקרומטר 4sU גם מעוררת סימני מצוקה סלולרי ולא אפופטוזיס (איור 1) אבל להוביל ההתאגדות 4sU מספיק.
RNA תיוג זמן גם יכול להתקצר (≤5 דקות) אשר מוביל לעלייה קצרת ימים intronic רצף בהשוואה עוד פעמים תיוג. כדי להמחיש co-transcriptional המחירים splicing, תיוג 4sU פעמים לא יעלה על 30 דקות. לקבלת פרטים נוספים על 4sUlabeling, נא עיין Rädle et al. 19
בקרת איכות: שלמות RNA הוא בעל חשיבות רבה בעת עיבוד ה-RNA. זה הכי נוח לבדוק את איכות ה-RNA של RNA התווית על-ידי 4sU לאחר biotinylation ניתוח electrophoretical (ראה טבלה של חומרים). שקול אימות RNA מבודד מהשלב 2.2.2, במיוחד כאשר משתמשים בו על רצף של RNA הכולל. RNA תקינות מספר (RIN) צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA לעיבוד נוסף (איור 3).
ניתוח electrophoretical יכול לשמש גם כדי לוודא שזה עתה משועתקים RNA. שימו לב כי לאחרונה משועתקים RNA מכיל rRNAs באופן משמעותי פחות בוגר לעומת סך RNA עם הלהקות rRNA טיפוסי להיות הרבה פחות בולטים.
ריבוזום פרופיל: PCR הגברה של ספריית cDNA: cDNA הגברה (שלב 4.9.1) הוא שלב קריטי כדי להבטיח תוצאות רצף טוב. לנתח את ספריות מוגבר על-ידי ניתוח electrophoretical. דגימה טובה של ספריות מוגבר מראה לשיא סביב 140-160 bp (איור 4A). עודפות של מתאם הדימרים צריך להיות נמנע (איור 4B) ויש את הדגימות נוסף לטהרו באמצעות ההליך טיהור דף לפי הפרוטוקול של היצרן (דף טיהור של מוצרי ה-PCR). תבנית יותר מדי או מחזורים PCR מדי עלולה להביא הגברה יתר מאופיין על ידי הופעת להקות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מוצרי ה-PCR מרוח ומוצרים דיימר מתאם (איור 4C). עבור רוב דגימות 1-5 µL של circularized cDNA ומחזורי PCR 9 עבור הגברה בדרך כלל תניב כמויות מספיקות של המוצר הנכון של ה-PCR.
שבב: כרומטין הטיה: חיתוך אופטימאליים צריך להיות מותאם לכל סוג של תא. לקבוע תנאים ההטיה (למשל, מספר מחזורי, כוח גבוה או נמוך) מראש. להשתמש באותו המספר של תאים באותו אמצעי אחסון למטרות, בדיקה מאז צפיפות התאים נמוך מגביר את יעילות ההטיה. נסה להימנע נגמר - או תחת-הטיה כרומטין. שברי כרומטין גדול יכול להשפיע באופן דרמטי על תוצאות שבב על ידי סתימת, הטיית יתר יכול להרוס את epitopes על החלבון של עניין, שמוביל ליעילות נמוכה הכריכה על ידי הנוגדן. בניסוי זה, הושגו התוצאות הטובות ביותר כאשר השבר הראשי של כרומטין הוטו היה בסביבות 1,000 bp או מעט נמוך (איור 5A).
אימות שבב על ידי qPCR: לפני שמתחילים את השבב, מומלץ לבדוק אם הנוגדן בשימוש מתאים שבב (במידת האפשר, השתמש שבב כיתה נוגדנים) על ידי שבב-qPCR. לאמת את השבב עבור רצף על ידי qPCR לפני תחילת הכנת ספריה (ראה שלב 5.6.5). עיצוב תחל זה לאגד אתר יעד ידוע של החלבון עניין. אם אתר היעד המדויק בתוך הגן אינו ידוע, כמה זוגות פריימר יכול לשמש כדי לסרוק את ג'ין ואלמנטים רגולטוריות המשויך. עבור שבב RNAPII של Th1 תאים Ifng, אשר transcriptionally upregulated על גירוי, תחל אקטין יכול לשמש פקד חיובי. Sox9 , אינסולין לשמש פקד שלילי, מאחר הגנים האלה אינם מבוטאים בתאים Th1 (איור 5B). תזכרו לא להשתמש פורש אקסון תחל, אשר משמשים בדרך כלל עבור qPCR של mRNA. פקד IgG יכול לשמש גם כדי להוכיח יחודיות של הנוגדן בשימוש. Immunoprecipitated DNA ניתן למדוד עם fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). כמויות של DNA nonspecifically המאוגד על-ידי הפקד IgG צריכה להיות משמעותית נמוכה לעומת הסכום DNA הנוגדן עניין כבול.
משכפל: הוכחה חשיבות ביולוגית: מומלץ בחום לבצע את הניסוי קינטי עבור כל השיטות החל מאותו מאגר של תאים כדי להבטיח תאים יש זהות זהה עבור כל לא מטופל ומטופל דוגמאות (איור 2). עם זאת, מומלץ לקחת aliquots קטן של נקודות זמן הראשי עבור כל שיטת להשוות בין דגימות שכפול ביולוגי (למשל, על ידי qPCR, ניתוח FACS). דבר זה מאפשר הערכה גסה, אם הטיפול עבור שניהם משכפל לשחזור, אתה יכול להמשיך עם רצף. אימות של משכפל צריכה להתבצע על-ידי ניתוח bioinformatical. הפארמצבטית של תוצאות יכול להידרש מבחינת מתאם בין ערכים FPKM בין משכפל, visualized באמצעות פיזור החלקות (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> איור 1: אימות של תנאים אופטימליים תיוג 4sU ללא perturbing פיזיולוגיה של התא (איור מ Davari et al. 11) (א) גילוי של אפופטוזיס תא על-ידי ניתוח FACS: במבחנה שנוצר Th0 תאים שטופלו ריכוזים שונים של 4sU (מסומן בסוגריים) עבור 0.5 h, 1 h 2 h, בהתאמה. טיפול BH3I-1 שימש כדי לגרום אפופטוזיס נקבע על ידי Annexin V, ואילו הלם חום (5 דקות ב 95 ° C) נעשה שימוש כדי לגרום מוות תאי נקבע על ידי 7-מ. (B) תספיג ןועברל p53 של 4sU התייחסו ומופעל תאי T: דגימות הודבקו תוויות עם 200 מיקרומטר 4sU במשך הזמן המצוין של ההפעלה, למעט נקודת זמן 0.5 h זה סומן עם 500 4sU מיקרומטר. (ג) ניתוח תספיג פוספו-EIF2a ו- EIF2a הכולל תאי Th1 מופעל עם תיוג באותם התנאים כמו (B). Thapsigargin שימש פקד חיובי. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> איור 2: סקירה סכמטי של מלכודת קינטי לעקוב אחר שינויים ברמת הגנום ערכה זו ממחישה את הכיוונון לשילוב 4sU-seq הכולל RNA-seq, פרופיל ריבוזום, צ'יפ-seq ללמוד שינויים ברמת הגנום על טיפול תאי. בריכה תאים, להפריש את המספר הנדרש של תאים עבור פקד ללא טיפול. לטפל בתאי שנותרה ולהתחלק עבור כל נקודה בשיטה וזמן. תווית לא מטופל/מטופלים תאים עבור 4sU-seq עם 4sU כמתואר. נקודות זמן ודוגמאות עבור כל שיטת תלויה השאלה ביולוגי מסוים נבדק. לקחת דגימות עבור כל נקודת זמן ושיטת ופעל החלק הייעודי של הפרוטוקול. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> איור 3: בקרת איכות של RNA התווית על-ידי 4sU סה כ RNA ו biotinylated RNA המתקבל ע י תאי Th1 מופעל נותחו על Bioanalyzer. 18S rRNA 28S rRNA מוצגים, RNA תקינות מספר (RIN) ניתנת על ידי המכשיר כדי לקבוע בשלמות הרנ א. רין צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> איור 4: פרופילים Bioanalyzer של ריבוזום פרופיל ספריות ספריה טובה (א) A: המדגם מציגה לשיא במטווח הגודל הצפוי (140-160 bp) וכן אין טיהור נוספת נדרשת. (B) דוגמה זו מציגה מוצר מוגבר של דיימר מתאם מוגזמת (120 bp) ביחס המוצר הרצוי (140-160 bp). ספריה זו מחייבת עוד יותר טיהור. (ג) דוגמה יתר מוגבר: פסגות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מרוח PCR amplicons גלויים (המסומנים על ידי חצים). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> איור 5: גודל אופטימלי כרומטין אחרי הטיית ואימות של שבב על ידי qPCR (א) Agarose ג'ל התמונה מראה גודל אופטימלי שבר כרומטין הוטו מדגימות שלושה היו לכסנתם מחזורים 25 ב sonicator, מטוהרים כמתואר לפני בפרוטוקול. (B) Q-PCR תוצאות שבב RNAPII הכולל (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) מיוצג כאחוז של קלט. Ifng ואני אקטין תחל שימשו חיובי ואילו Sox9 , אינסולין שלילי פקדים (שני הגנים אינם מבוטאים בתאים Th1 מופעל). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> איור 6: השוואה של הביולוגיה משכפל (איור מ. Davari et al. 11) פיזור נציג מגרש בהשוואת ערכים הביטוי (FPKM) בין משכפל של h RNA 4 משועתקים לאחרונה (4sU) לאחר גירוי תאי Th1 מופעל. הקו הירוק מציין ערכים FPKM שווים ומצוין המתאם דרגה כל מגרש.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>משך תיוג (דקות)</td>
			<td>ריכוז 4sU המומלצת (מיקרומטר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מומלץ ריכוזי 4sU (מ- Rädle, et al. 19) הטווח של ריכוזי 4sU המומלץ הוא הצביע עבור זמנים שונים של תיוג.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שיטה</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד</td>
			<td>כמות ה-RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיוג-4sU</td>
			<td>≥2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריבוזום פרופיל</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>שבב-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הכמות הנדרשת של תאי T ראשי הכמות המינימלית של תאי T העיקרי הנדרש עבור כל אחת מהשיטות. כמויות יכול להיות פחות בעת שימוש סוגי תאים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...