Name: real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Lars 4sU birincil T hücreleri için etiketleme kurmak için Dölken tavsiye için teşekkür ederiz; Elisabeth Graf ve Thomas Schwarzmayr Kütüphane nesiller ve sıralamanın önemli yardım için; Eick ve Andrew Flatley RNAPII ve T hücre antikorları sağlamak için dirk; N. Henriette Uhlenhaut ve Franziska Greulich ChIP-seq Kütüphane hazırlığında yardım için; Caroline C. Friedel hibe FR2938/7-1 ve CRC 1123 (Z2) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) üzerinden tarafından desteklenen; Elke Glasmacher hibe GL 870/1-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ve Alman merkezi için diyabet araştırma (DZD), Helmholtz Zentrum München tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Gen düzenlemesi tüm süreç analiz tamamen hücresel adaptasyon belirli uyarıcı veya tedaviye yanıt olarak anlamak gereklidir. Toplam RNA-seq birleştirerek, 4sU seq, profil oluşturma ribozom ChIP-seq farklı zaman noktalarda bizi bir gen düzenlemesi zaman içinde ana süreçlerin kapsamlı bir analiz için. Biyolojik süreçlerin derin bir anlayış deneysel Kur hem de uygun zaman noktaları tanımlamak için gereklidir.
Gen düzenlemesi çalışma yöntemleri hızla geliştirmek beri bu iletişim kuralları hızlı değişikliklere adapte edilebilir. Yine de, onlar temel gen düzenleyici mekanizmaları hücre her türlü içinde çalışmak için en önemli bir yöntem sağlar. Burada, bazı tuzaklar ve bir bu yöntemleri kullanırken göz önünde bulundurun zorunda gerçekleri tartışmak.
Hücreleri: Hücrelerin son derece uygun olması gerekir ve birincil izole hücreler kullanıyorsanız, hücre popülasyonlarının saflığı (örneğin, FACS analiz için birincil T hücreleri) garanti gerekir. Hatta biraz stresli hücreleri bu çok duyarlı sıralama yöntemleri sonuçlarını etkilemek ve yeni kopya etmek veya çevrilmiş RNA miktarı düşük ve istenmeyen sonuçlar sıralama sonuçlarında stres yanıtının neden. Bu protokol için hücreleri cips belirtilen aralıklarla hız birincil T hücreleri için optimize edilmiştir. Böylece, hücre tipine göre hızı ayarlayın.
4 hücre fizyolojisi üzerinde sU etkileri: Özellikle hücre sayıları sınırlı olan hücresel fizyoloji üzerine 4sU ek için en az pertürbasyon doğrulama yukarıda belirtilen seçenekleri ek olarak, daha fazla ve/veya ek analiz, gerçekleştirilebilir. Hücre çoğalması üzerine etkileri sadece etiketli ve etiketsiz hücreleri sayarak katlama zaman hücre doğrulama test edilebilir. Genelde stres indüksiyon Ayrıca hücre morfolojisi ayirt nucleolin ve hücre çekirdeği boyama ile analiz ederek test olabilir. 4sU etkisini daha da doğrulamak için değiştirilmiş küresel gen ekspresyonu sayar etiketli toplam RNA okumak için etiketlenmemiş toplam RNA birleştiriliyor tarafından ölçülen.
Cep numaraları: Oluşturulan vitro T hücreler için en az miktarını tablo 2' de belirtilen hücreleri ile başlayan öneririz. Hücre tipine göre yöntem başına yeterli numara seçin. T hücreleri daha az sitoplazma ve diğer hücrelere göre RNA beri daha düşük miktarlarda büyük olasılıkla diğer hücreleri yeterli olacaktır. ChIP-seq için hücre sayıları son derece kullanılan antikor ve faiz hücrelerindeki protein ifade düzeyine göre değişir. Hücre sayıları transkripsiyon faktörleri kullanıldığında, özellikle düşük seviyelerde ifade edilir eğer artırılması gerekiyor ise Histon veya RNAPII çip için fewe hücreleri, kullanılabilir.
4 sU etiketleme ve RNA biotinylation: Yapışık hücreleri kullanırken 4sU etiketleme Rädle ve arktarafından açıklandığı gibi yönlendirilebilir. 19 hücreleri çok hızlı bir şekilde dahil 4sU beri bu süspansiyon, yapışık veya yarı yapışık hücreleri orta doğrudan eklenebilir.
Bu biotinylation RNA'ın 60-80 µg ile başlatmak için tavsiye edilir. Yine de, RNA düşük miktarda kullanılabilir, her ne kadar biz did değil sınav için daha az 30 µg. ekleyin (örneğin, GlycoBlue) bir coprecipitant ne zaman Pelet görmek zor ise RNA presipite. Duffy ve ark. da o methylthiosulfonate aktif biotin (MTS-biotin) daha verimli bir şekilde 4sU etiketli RNA ile HPDP-biotin31tepki verir göstermiştir. Bu nedenle, bu MTS-biotin, özellikle, daha az üridin artıkları (Duffy vd.; bkz: Arıtma 4sU etiketli RNA tarafından bahsedilen biotinylation iletişim kuralı aşağıdaki anlamlara sahip olma eğilimi, küçük RNA'ları Kurtarma için geçiş dikkate değer olabilir Deneysel yordamlar).
Yeni transkripsiyonu RNA kurtarma için paramagnetic boncuk veya RNA Temizleme boncuk seçtiğiniz kullanmak mümkündür. Her zaman bu kitleri ya da değil arındırmak için belirli RNA'ların dikkate almak. MiRNAs içinde ilgileniyorsanız, örneğin, belirli kitleri miRNA yakalama ve sıralama için kullanmayı düşünün.
Yeni transkripsiyonu RNA'ın miktar: Doğru yeni transkripsiyonu RNA ölçmek için uygun bir yer tarafından ölçüm yapılmalıdır ( Tablo malzemelerigörmek). 4sU maruz kalma 1 saat içinde yeni transkripsiyonu RNA toplam RNA'ın yaklaşık % 1-4 temsil eder. Yeni transkripsiyonu RNA 1 etiketli h aktive T hücreleri oluşur rRNA%11~ 90-94.
Ribozom profil oluşturma: Yöntem kurarken, özgün protokolünde önerilen 1.5 x nükleaz miktarda kullanarak doğru sindirim garanti belirledi. Ayrıca, herhangi bir yan etkisi nükleaz yüksek miktarda bildirilmiştir. Ribozomal proteinler tarafından bağlı RNA parçası oldukları sırada RPFs overdigest oldukça zor olduğundan, hala biraz en iyi nükleaz sindirim titre tutarı artırabilir.
Eğer daha az 500 ng RPF RNA'ın adım 4.4.2 kurtarıldı, rRNA tükenmesi ve havuzu saf RPFs RNA temiz & yoğunlaştırıcı-5 sütunları ile yineleyin. Alternatif olarak, iki aynı örnek üzerinde jel (Adım 4.5.3) birbirine yakın ve havuzu jel dilimleri yük sırasında RNA elüsyon jel (Adım 4.5.6) üzerinden.
Biz RPFs üzerinde bir jel mümkün olduğunca sıkı bir şekilde 28 ve 30 nt grup kesme öneririz. Bu istenmeyen parçaları rRNA'lar ve tRNA, hangi daha sonra kitaplığınıza parçası haline gelir ve sıralama okuma senin RPFs için azaltmak giderilmesinde yardımcı olur.
Ayrıca UV jel arıtma sırasında ışığı önlemek için önerilir. Bu RNA parçaları, aynı zamanda da sonunda ciddi Kütüphane hazırlanması ve sıralama sonuçları etkileyen pirimidin dimer nickler oluşturabilirsiniz.
Kütüphane hazırlama ve veri sıralama: Sıralama için uygun bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için ribozom Protokolü profil oluşturma sağlar. 4sU etiketleme tarafından oluşturulan örnek doğrudan herhangi bir uygun RNA sıralama kiti ile kütüphane hazırlık için kullanabilirsiniz. Özellikle kısa kullanarak kez, etiketleme henüz poliadenile, olmayabilir zaman yeni transkripsiyonu RNA beri hayır Poli-bir seçim yapılmalıdır. Bunun yerine, rRNA tükenmesi önlemek için önerilir gerçek örnek için sıralama derinliği azaltılması. T hücreleri kullanarak, biz 400 gerçekleştirilen ng (bağlı olarak kit, bkz: belgeleri), yeni kopya etmek ve toplam RNA'ın rRNA tükenmesi ile başladı ve çember PCR güçlendirme PCR önyargı en aza indirmek daha düşük. Kütüphane hazırlık başlangıç daha az malzeme ile gerçekleştirilebilir. PCR döngüleri Kütüphane karmaşıklık numaralarındaki hesap için optimize edilmelidir.
ChIP-seq için orada da birçok kitleri Kütüphane hazırlık için kullanılabilir. Bizim eller kitaplığında hazırlık de 2'den başlayarak çalıştı ng çip DNA'ın (malzeme kullanmak için hangi kiti bir öneri için bakınız). Sıralama sırasında Endeksi için renk dengesini kontrol ettiğinizden emin olun. Bir sıralama derinlik x 106 okuma 4sU seq, toplam RNA-seq ve ChIP-seq örnekleri için her ≥40 ve ≥80 x 106 okuma ribozom örnekleri profil oluşturma için tavsiye ediyoruz. Sıralama derinlik örnek ve aşağı akım Biyoinformatik analizi bağlıdır ve dikkatle düşünülmelidir. Cotranscriptional boşluklarına ayıran, 100 intronic okuma analiz etmek için bp eşleştirilmiş uç sıralama seçilmiş gerekir.
Önyargı sıralama: Sıralama transkripsiyon, çevirisi veya transkripsiyon faktörü bağlama küresel değişimler belirlerken altın standart haline gelmiştir. Son yıllarda içinde varolan yöntemleri için sınırları itilmiş veya RNA başlangıç giderek daha az miktarda sıralama için yeni teknikler geliştirilmiştir. Bu gürültü veya önyargı tanıttı cDNA amplifikasyon gerektirir. Son zamanlarda, benzersiz moleküler tanımlayıcıları (UMIs) deneysel olarak PCR tarafından tanıtılan çoğaltmaları tanımlamak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, bu UMIs sadece hafif sıralama güç ve yanlış bulma oranı fark gen ifade32için geliştirmek gösterilmiştir. Yine de, tüm sıralama Denetim Kitaplığı karmaşıklığı için kitaplıklarına için benzersiz moleküler tanımlayıcılarını (UMIs) kullanarak özellikle RNA düşük miktarda başlatırken ve birçok PCR döngüleri gerektiğinde düşünün.
Arabellek ve hisse senedi çözümleri: 4sU seq ve ribozom profil oluşturma için tüm arabellekleri nükleaz ücretsiz su kullanarak sıkı RNase free koşullar altında hazırlanmalıdır. Bu önceden yapılmış nükleaz ücretsiz NaCl, Tris-HCl, EDTA, sodyum sitrat ve su satın almak için tavsiye edilir. Nükleaz ücretsiz koşulları sağlamak için RNase decontaminating çözümünü Pipetler veya yüzeyleri temizlemek için kullanılabilir. ChIP-seq için tüm arabellekleri gerekir Dnaz boş en az ve oda sıcaklığında depolanabilir. Her zaman proteaz inhibitörleri ve isteğe bağlı olarak, fosfataz inhibitörleri kullanmadan önce ekleyin ve buz üzerinde tutun.
Biyoinformatik: Tüm sıralama veri (Yani, ChIP-seq, RNA-seq ve ribsosome profil oluşturma) analizini içerir Kalite kontrol (FastQC, kullanarakörneğin, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), bağdaştırıcı kesme (örneğin, ile cutadapt20) başvuru genom hücrelerin altında eğitim için eşleme tarafından takip. RNA-seq veri (Toplam ve 4sU seq) yanı sıra için veri profil oluşturma ribozom, spliced RNA-seq mapper, ContextMap 221gibi gereklidir. ChIP-seq unspliced veri hizalamaları için yeterli BWA-MEM22 kullanmaktır. Gen ifadesinin RPKM modeli (okuma kilobaz Exon milyon parçaları eşlenen başına başına)1, sayıları kullanarak bir program, örneğin featureCounts23gen başına okumak belirledikten sonra kullanılarak hesaplanabilir. ChIP-seq verilerden en yüksek arama için bir dizi program are elde edilebilir, örneğin, MAC'ler24 veya mücevher25. Daha da aşağı akım analizleri, R26özellikle Bioconductor proje27tarafından sağlanan araçlar kullanılarak, gerçekleştirilebilir.
Burada, normalleştirme 4sU ve toplam RNA düzeyleri ve ribozom profil oluşturma üzerinden translasyonel aktivite entegre büyük bir sorun olduğunu. Bu sorunu çözmek için bir klasik ev tutma genler düzeylere normalize etmek yaklaşımdır. Gürültü bireysel ev tutma genler için rastgele dalgalanmalar nedeniyle azaltmak için bu sadece bir kaç ev tutma genler medyan düzeyleri daha büyük bir küme için örneğin kullanılması önerilir > Eisenberg ve Levanon28 tarafından derlenmiş 3.000 ev tutma genler . RNA ciro oranları toplam RNA, normalleştirme medyan ciro dayanmaktadır oranları 4sU-e üzerinden hesaplanması için (5 h bir RNA half-life varsayarakörneğin,)29oranları. Bu ev tutma genler için genel değişiklik varsayar beri Ancak, çözümleme yaklaşımlar normalleştirme, örneğin, korelasyon tabanlı bir zaman-dizi gen grupları tanımlamak için farklı veri türleri kümeleme bağımsız kullanmanızı öneririz Transkripsiyon ve translasyon etkinleştirme sırasında farklı davranış ile. Bioinformatical tümleştirilmesi farklı veri türleri hakkında ayrıntılı bir açıklama için özgün yayın11' e bakın.
Ciro oranları ve veri tümleştirme analizi: Yarı-hayat bir çoğaltılmış gen denetim (MGC) tarafından belirlenen genel yöntemleri için karşılaştırma bir kısa bir süre önce kağıt33 yarı-hayat bu metabolik etiketleme yöntemleri (örneğin, diğer yöntemlerine göre elde edilen en iyi korelasyon gösterir misiniz Genel inhibisyonu transkripsiyon uyuşturucu tarafından). Ancak, half-life hesaplamalar arasındaki farklar ortaya çıkabilir ve açıklanan 15,34olmuştur belirtilmelidir. Sorunlar ve uzun süreli 4sU maruz kalma nedeniyle stres tepkisi tarafından tanıtıldı farklılıklar çoğu için hesap. Bu nedenle, 4sU etiketleme tarafından tanıtılan stres tepkisi dışlamak için vazgeçilmezdir. Daha fazla ciro oranları doğrulamak için MGCs kullanmanızı tavsiye ederiz.
Ayrıca, burada oluşturulan bir veri kümesi de bir daha bütünleştirici veri analizi (örneğin, uzun kodlamayan RNA'ların Yönetmeliği)35,36için kullanılabilir.

Son yıllarda, RNA-sıralama (RNA-seq) bir hücre veya bir organizma1içindeki tüm ifade RNA'ların analiz etmek için Standart araç haline gelmiştir. Ancak, yanıt olarak belirli bir uyarıcı/ilaç adapte hücreleri tüm süreci anlamak için mRNA transkripsiyon işleme, ciro ve çeviri kadar tüm temel işlemler tam olarak belirlemek gereklidir. RNA transkripsiyonu kısa vadeli değişiklikler pek ölçülebilir toplam RNAseq tarafından faktörler örneğin RNA yarı-hayat ve transkripsiyon etkinlik, değişiklikleri toplam RNA'ın bağlıdır beri hücrelere uyarlaması yansıtan için zavallı bir şablon olan çevresel etkileri2,3. Gerçekten de, yeni sıralama teknikler geliştirilmiştir farklı adımları doğru şekilde birleştirildiğinde gen yönetmelik4 sürecinde bir analizini sağlayan. Bu iletişim kuralı, mRNA temel katmanları Yönetmeliği karşılaştırmalı bir şekilde izleme sağlar bazı oldukça kolayca uygulanabilir sıralama teknikleri birleştirmek açıklar. Transkripsiyon faaliyetini çözümleme için çeşitli yöntemler tarif edilmiştir, Cap-analizi gibi gen ifade (Kafes)5, yerli uzama transkript sıralama (NET-seq)6ve genom çapında nükleer çalıştırma (GRO-seq)7 , 8, hem de bromouridine-sıralama (Bru-seq) ve 4-thiouridine-sıralama (4sU-seq), metabolitleri kullanan bu yeni eklenen transkripsiyonu RNA9,10, sadece birkaç söz için. KAFES tam transkripsiyon başlangıç sitesini tanımlayan, NET-seq ve GRO-seq yön okuma hakkında daha doğru bilgi sunmak ve yalnızca yeni (ki burada açıklanan yöntemi) 4sU seq algılar ise RNA transkripsiyonu. Ancak, 4sU seq son derece hassas ve farklı zaman dilimlerini aktif hücreleri gibi (ki birkaç dakika içinde olur) mRNA işlemesi nicel değişiklikler değiştirme nicel transkripsiyon etkinliğini ölçmek için uygulanabilen9, 11,12. Ayrıca, 4sU seq genler9için RNA ciro oranları hesaplamak için RNA-seq ile birleştirmek idealdir. MRNA transkripsiyonu RNA polimeraz II (transkripsiyon faktörleri, Histon değişiklikler ve hatta genel harekete geçirmek/repressors transkripsiyon parçası olması gibi faktörler, çok sayıda tarafından sırayla etkilemiş RNAPII tarafından), yürütülen karmaşık. Nasıl pek çok gen/organizatörü/artırıcı bölge bir faktör tarafından bağlı olan test etmek için ChIP-seq, hangi şimdi birçok ticari olarak mevcut antikorlar13nedeniyle bu amaçla standart yöntemdir geliştirilmiştir. Her ne kadar ChIPseq nerede bind düzenleyen faktörler net bilgi verir, ancak, bu gerçekten transkripsiyon14değişikliklere yol Eğer yansıtmak zorunda değildir. Bu nedenle, ChIP-seq 4sU-seq ile gerçekleştirme biyolojik tür sorular için en ideal kombinasyonu. MRNA ve protein düzeyleri mutlaka15,16translasyonel veya post-translational potansiyel olarak önemli regülasyonu gösteren, ilişkilendirmek değil bu yana, düzenleme gen ekspresyonu, daha sonraki bir aşamada da oluşabilir düzeyi, bağlama. Yıl 2011, ribozom profil oluşturma ilk RNA-seq ile kombine edilmiş ve kütle spektrometresi17ile bazı duyarlılık sınırlar hala olduğundan hızla protein, oluşan değişiklikleri ölçmek için seçtiğiniz yöntemi şimdi. Nitekim, çeviri oranları bu tür yöntemleri elde nispeten iyi bir tahmin (hiç olmazsa için uzun vadeli değişiklikleri ölçülür) protein düzeyleri değişiklikleri teslim ve çeviri, örneğin süreci üzerinde daha detaylı bir görünümüne izin ver gösterilmiştir başlangıç tarafı ve alternatif çeviri belirlenmesi17çerçeveler. Dört yöntemi Kombinatorik kullanımı arasında çeşitli hücre tiplerinin, kararlı duruma kullanılabilir veya zaman-seri hızla değişen hücre11deneme. Bu kullanım transkripsiyon faktörü bağlama RNA transkripsiyonu, işleme ve çeviri etkileyen değişiklikler genom geniş bakış sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4sU-labeling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine (100 mg)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>13957-31-8</td>
			<td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &#8211;20&#176;C in aliquots of 50-500 &#181;l; do not refreeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml safe-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121589</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72692005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72694005</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Compatible with Dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>372978</td>
			<td>WARNING &#8211; HAZARDOUS TO HEALTH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00983.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>21341</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&#176;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634.1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td>Use in step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene 15&#160;ml centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &#215; g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &#8211; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32852</td>
			<td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MinElute Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td>Optional; includes Buffer RLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrat</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;Macs Streptavidin Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-074-101</td>
			<td>Store at 4&#176;C, includes &#181;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability and stress assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9033</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab26</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-EIF2a (Ser51)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9721</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BH3I-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B 8809</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4sU Washing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Buffer (10x)</td>
			<td></td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
			<td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA precipitation buffer</td>
			<td></td>
			<td>store at RT</td>
			<td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td rowspan="3">Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&#160;&#215;&#160;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430 R</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>One stand holds 8 &#181;Macs columns.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>ML204T</td>
			<td>Or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel iBase Power System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G6400UK</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G4020-01</td>
			<td>For RNA gels; or equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2201</td>
			<td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribosome Profiling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPYSC12116 (Yeast)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RPHMR12126 (Mammalian)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-25 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5 kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZG126 or MRZG12324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(High Sensitivity DNA Kit)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Already needed for 4sU-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All other consumables and equipment are listed in the User guide</td>
			<td>!!!</td>
			<td></td>
			<td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp Plus Marker</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM0323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Formaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Add to a final concentration of 1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Always prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP library preparation kit</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK8504</td>
			<td>Or use the kit of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-901-393-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBRgreen Master mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase, DNase free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-119915001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE pH 8.0</td>
			<td>gereral lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies (ChIP grade if possible)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Histon H3K36me3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or antibody of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding/Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP IP buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&#160;mM EDTA; 16.7&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT up to 6 months</td>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei-Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer I</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer II</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&#160;mM EDTA; 20&#160;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&#160;mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer III</td>
			<td></td>
			<td>Store at RT</td>
			<td>0.25&#160;M LiCl; 1% NP-40; 1&#160;mM EDTA; 10&#160;mM Tris-HCl, pH 8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>use this instrument for electrophoretical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or tubes special for your sonication device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &#181;l each tube)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand for tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

Harekete geçirmek, hücreleri hızlı bir şekilde onların fonksiyonel programları değiştirme ve, dolayısıyla, onların gen ifade profil. Büyük değişiklikler gen ekspresyonu gerçekleşir, örneğin, hücresel başkalaşım, morfogenez ve fonksiyonel stimülasyon (örneğin etkinleştirme bağışıklık hücreleri), sırasında veya yerel ortamdan uyuşturucu ve diğer etkenlere maruz kaldıktan sonra. Uyarıcı ve hücre türüne bağlı olarak, bu değişikliklerden hızla ve gen düzenlemesi mümkün herhangi bir düzeyde. Yanıt veren bir hücrenin tüm moleküler işlemler belirli bir uyarıcı/uyuşturucu görüntüleme Moleküler biyolojide en zor görevlerden biridir. Burada, tarif biz gen düzenlemesi çok katmanlı eşzamanlı analizini etkinleştiren bir iletişim kuralıdır. Biz, özellikle, transkripsiyon faktörü (Kromatin-immunoprecipitation-sıralama (ChIP-seq)) bağlama, de novo transkripsiyon (4-thiouridine-sıralama (4sU-seq)), mRNA işlemesi ve ciro gibi çeviri (ribozom karşılaştırın profil oluşturma). Bu yöntemleri birleştirerek, detaylı ve genom çapında elbette eylem görüntülemek mümkündür.
Yeni transkripsiyonu RNA sıralama hızla adapte veya bu 4sU maruz kalma (ne olursa olsun onlar yukarı - ya da downregulated olup) zamanında tüm genlerin transkripsiyon faaliyet gösteriyor bu yana sistemlerinin, değişen analiz ederken özellikle önerilir. Toplam RNA-seq ve ribozom profil oluşturma Kombinatorik kullanımı Ayrıca RNA ciro ve çeviri oranları hesaplama sağlar. Bioinformatic analizi yüksek üretilen iş sıralama sonuçlarının analizi ve verilerin yorumlanması için birçok araç sağlar. Oluşturulan veri Ayrıca co-transcriptional ve alternatif, sadece birkaç olası sonuçları söz Uçbirleştirme izleme sağlar.
Burada açıklanan kombine yaklaşım farklı model organizmalar veya Primer hücre de dahil olmak üzere hücre tipleri için uygulanabilir. Ayrıca, kalite kontrol, dahil olmak üzere kullanılan, her yöntem için detaylı iletişim kuralları sağlar ve olası sorunları ve tuzaklar tartışmak.

4 sU etiketleme: en iyi doğrulamak 4 sU etiketleme koşulları (apoptosis, nükleer stres, sitoplazmik stres), zaman ve konsantrasyon: 4sU yüksek düzeyde üretim ve işleme rRNA inhibe ve sitoplazmik yanı sıra nükleer stres30teşvik. Bu nedenle, faiz hücrelerinin 4sU kaynaklı stres gibi Apoptozis için test edilmelidir. Western blot analizi nükleer stres gösterir, p53 birikimi görüntülenmesi için önerilir sitoplazmik stres ve floresan aktif hücre (FACS) analiz apoptosis için sıralama görüntülemek fosfo-EIF2a düzeylerini artırma. Hücresel stres ikna etmek için yüksek düzeyde ve uzun pozlama 4sU veya thapsigargin veya arsenite gibi ilaçlar kullanılabilir. Apoptozis ya da hücre ölüm ikna etmek için hücreleri BH3I-1 ile tedavi edildi (500 ng/µL) veya inkübe 95 ° c (ısı şok) 5 min için. V/7-AAD boyama annexin apoptotik (Annexin V) ve (7-AAD) ölü hücreleri belirlemek için kullanıldı. Vitro etiketleme oluşturulan 500 µM 4sU ile 0,5 h için birincil Th1 hücre (son konsantrasyonu) veya 200 µM 4sU ile 1 saat de hücresel stres belirtileri indükler ne de apoptoz (şekil 1) ama yeterli 4sU birleşme için yol.
Zaman etiketleme RNA-da var kısaltılmış (≤5 min) göre artık bu etiketleme kez dizileri hangi intronic kısa ömürlü bir artış yol açar. Co-transcriptional dikişi oranları görselleştirmek için 4sU etiketleme kez 30 dk geçmemelidir. 4sUlabeling ile ilgili daha fazla bilgi için lütfen Rädle ve arkbakın. 19
Kalite kontrol: RNA bütünlük RNA işlenmesi sırasında büyük önem taşıyor. Electrophoretical analizi ile biotinylation sonra 4sU etiketli RNA RNA kalitesini kontrol etmek en uygun olan ( Tablo malzemelerigörmek). Özellikle için toplam RNA'ın sıralama kullanırken adım 2.2.2, izole RNA doğrulama göz önünde bulundurun. RNA bütünlük numarası (RIN) ≥8 (şekil 3) işleme daha fazla için RNA bütünlüğünü güvenceye almak için olmalıdır.
Electrophoretical analiz yeni transkripsiyonu RNA doğrulamak için de kullanılabilir. Yeni transkripsiyonu RNA toplam RNA çok daha az belirgin olan tipik rRNA bantları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az olgun rRNA'lar içerdiğini unutmayın.
Ribozom profil oluşturma: PCR güçlendirme cDNA Kütüphanesi: cDNA amplifikasyon (Adım 4.9.1) iyi sıralama sonuçlar sağlamak için kritik bir adımdır. Güçlendirilmiş kitaplıkları tarafından electrophoretical analizi. Bir tepe etrafında iyi güçlendirilmiş kütüphanelerin gösterir 140-160 bp (şekil 4A). Aşırı miktarda bağdaştırıcısı dimer olmalıdır (şekil 4B) kaçınılması ve şu örnekleri daha fazla üreticinin iletişim kuralı (sayfa arıtma PCR ürünlerinin) göre sayfa arıtma yordamı kullanarak saf. Çok fazla şablon veya çok fazla PCR döngüleri beklenenden daha yüksek molekül ağırlıklı bantları, lekeli PCR ürünleri ve bağdaştırıcı dimer ürünleri (şekil 4 c) görünümünü tarafından karakterize aşırı amplifikasyon neden olabilir. Çoğu örnekleri için 1-5 µL olan circularized cDNA ve amplifikasyon 9 ÇSYİ devredir genellikle doğru PCR ürününün yeterli miktarda ortaya çıkarır.
Çip: Kromatin yamultma: Optimal kesme koşullar hücre türüne göre ayarlanması gerekir. Kesme koşulları (örneğin, döngü, yüksek veya düşük enerji sayısı) önceden belirleyin. Aynı sayıda hücre ve aynı birim için sınav amaç, daha düşük bir hücre yoğunluğu kesme verimliliği artırır bu yana kullanın. Bitti - veya altında-makaslama Kromatin önlemek için deneyin. Büyük Kromatin parçaları önemli ölçüde tıkanma tarafından ChIP sonuçları etkileyebilir ve aşırı yamultma epitopları için daha düşük bir bağlama verimliliği antikor tarafından önde gelen ilgi protein üzerinde yok edebilir. Yamultulmuş Kromatin ana kısmını yaklaşık 1.000 yaşındayken bu deneyde, en iyi sonuçları elde edildi kan basıncı ya da biraz daha düşük (şekil 5A).
Doğrulama ChIP qPCR tarafından: Çip başlamadan önce Eğer kullanılan antikor küçük parça için uygundur test etmek için tavsiye edilir (mümkünse, ChIP sınıf antikorlar kullanın) ChIP-qPCR tarafından. Kitaplık hazırlama başlamadan önce qPCR tarafından küçük parça için sıralama doğrulayın (bkz. Adım 5.6.5). Tasarım astar bir protein ilgi bilinen hedef siteye bağlayın. Tam hedef site içinde bir gen bilinmiyorsa, birkaç astar çiftleri gen ve ilişkili düzenleyici elemanlarının taramak için kullanılabilir. Ifng, RNAPII çip Th1 hücre için hangi transcriptionally upregulated üzerine stimülasyon ve aktin astar pozitif kontrol kullanılan. Bu genlerin Th1 hücre (şekil 5B) ifade değil beri Sox9 ve insülin bir negatif kontrol hizmet vermektedir. Normalde mRNA qPCR için kullanılan exon kapsayan astar kullanmayı unutmayın. Bir IgG denetimi kullanılan antikor özgüllük kanıtlamak için de kullanılabilir. Immunoprecipitated DNA ile uygun bir yer ölçülebilir ( Tablo malzemelerigörmek). Nonspecifically ilişkili DNA IgG denetim tarafından miktarda önemli ölçüde daha düşük faiz antikor tarafından bağlı DNA miktarının karşılaştırılması gereken.
Çoğaltır: biyolojik önemi kanıt: Kesinlikle aynı havuzun hücreleri tüm tedavi edilmezse ve tedavi örnekleri (Şekil 2) için aynı kimliğe sahip sağlamak için hücre başlayarak tüm yöntemleri için Kinetik deney gerçekleştirmek için önerilir. Yine de, bu küçük aliquots bir biyolojik Çoğalt (örneğin, qPCR, FACS analiz tarafından) örnekleri karşılaştırmak her yöntemi için ana zaman puan almak için tavsiye edilir. Bu her iki çoğaltır için tedavi tekrarlanabilir ve sıralama ile devam için kaba bir tahmin sağlar. Çoğaltır doğrulanmasını bioinformatical analiz yoluyla yapılmalıdır. Tekrarlanabilirlik sonuçlarının çoğaltır arasında FPKM değerleri arasındaki ilişki açısından değerlendirildi ve scatter araziler (şekil 6) kullanarak görüntülenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Resim 1: Doğrulama koşullardan hücre fizyolojisi perturbing olmadan optimum 4sU etiketleme (şekil--dan Davari ve ark. 11) Hücre apoptosis FACS analizi tarafından tespiti(a): vitro üretilen hücreler tedavi (parantez içinde gösterilir) 4sU farklı konsantrasyonları ile 0,5 h, 1 h ve 2 h, Th0 anılan sıraya göre. BH3I-1 tedavi ısı şok (95 ° C'de 5 dk) 7-AAD tarafından belirlenen hücre ölümü ikna etmek için kullanıldı ise apoptosis Annexin V tarafından belirlenen ikna etmek için kullanıldı. (B) Western blot analizi 4sU p53 için tedavi ve T hücreleri aktive: örnekleri ile 200 µM 4sU harekete geçirmek, 500 µM 4sU ile etiketli 0,5 h saat noktası dışındaki belirtilen süre için etiketli. (C) Western blot analizi fosfo-EIF2a ve (B) olduğu gibi etiketleme aynı koşullarla aktif Th1 hücrelerdeki toplam EIF2a. Thapsigargin pozitif bir denetim olarak kullanıldı. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Resim 2: Genom genelindeki değişiklikleri izlemek için Kinetik bir kurulum şematik bakış Bu düzen 4sU seq, toplam RNA-seq, ribozom profil oluşturma ve genom genelinde değişiklikler hücre tedavisi üzerine çalışmaya ChIP-seq birleştirmek için kurulum gösterilmektedir. Hücreleri havuz ve hücreleri tedavi edilmezse kontrolü için gerekli sayıda bir kenara koyun. Kalan hücreleri tedavi ve her yöntem ve saat noktası için bölünmüş. Tedavi edilmezse/tedavi hücreleri 4sU-seq açıklandığı gibi 4sU ile etiketleyin. Zaman puan ve her yöntem için örnekleri incelenmektedir belirli biyolojik soruda bağlıdır. Her zaman nokta ve yöntem örnekleri almak ve adanmış protokolünün bir parçası olarak izleyin. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Şekil 3: kalite kontrol 4sU etiketli RNA'ın Toplam RNA ve biotinylated RNA aktif Th1 hücrelerinden elde edilen bir Bioanalyzer üzerinde analiz edildi. 18s rRNA ve 28S rRNA gösterilir ve RNA bütünlük numarası (RIN) RNA bütünlüğünü belirlemek için aracı tarafından verilir. RIN ≥8 RNA bütünlüğünü güvenceye almak için olmalıdır. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Resim 4: Bioanalyzer profilleri ribozomların kitaplıkları profil oluşturma (A) A iyi Kütüphane: örnek bir tepe beklenen boyutu aralığı (140-160 bp) gösterir ve başka hiçbir arıtma gereklidir. (B) Bu örnek gösterir aşırı bağdaştırıcısı dimer güçlendirilmiş ürün (120 bp) göreceli istenilen ürün (140-160 bp). Bu kütüphane daha fazla arıtma gerektirir. (C) aşırı güçlendirilmiş bir örnek: beklenenden daha yüksek molekül ağırlıklı tepeler ve lekeli PCR amplicons görünür (oklarla gösterilen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Şekil 5: Optimal Kromatin boyutu kesme ve çip doğrulama tarafından qPCR sonra (A)özel jel resmi bir sonicator 25 döngüleri için sheared ve iletişim kuralında daha önce açıklandığı gibi saf üç örneklerinden yamultulmuş Kromatin en iyi parçası boyutunu gösterir. (B) toplam RNAPII küçük parça (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) sonuçlarını Q-PCR giriş yüzdesi olarak temsil edilir. Sox9 ve insülin negatif denetimleri (hem genler aktive Th1 hücrelerde ifade edilir değil) iken Ifng ve aktin astar olumlu olarak kullanılmıştır. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Şekil 6: Biyolojik karşılaştırılması (Davari ve ark. rakam çoğaltır. 11) İfade değerleri (FPKM) arasında karşılaştırma temsilcisi dağılım çizim yeni kopya etmek (4sU) RNA 4 h sonra aktif Th1 hücre stimülasyon çoğaltır. Yeşil hat eşit FPKM değerleri gösterir ve sıralama korelasyon her mezarlığına belirtilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Süresi (dk) etiketleme</td>
			<td>Önerilen 4sU konsantrasyonu (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: 4sU konsantrasyonları önerilir (Rädle, üzerinden ve ark. 19) Önerilen 4sU konsantrasyonları çeşitli maddelerinin etiketlenmesi farklı zamanlarda belirtilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yöntemi</td>
			<td>Cep numarası</td>
			<td>RNA miktarı</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU etiketleme</td>
			<td>≥2 10 x7
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribozom profil oluşturma</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çip seq</td>
			<td>≥2 10 x7 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Gerekli miktarda birincil T hücreleri Her yöntem için gerekli birincil T hücrelerinin minimum tutar. Miktarları az diğer hücre tipleri kullanırken olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...