Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00
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Nous sommes reconnaissants à Robert Graffin et Pauline Duhant pour leur soutien technique.

Le protocole expérimental a été réalisé conformément aux Directives du Conseil européen des communautés pour l’expérimentation animale (2010/63/UE, 86/609/CEE et 87-848/CEE) et a été approuvé par l’Animal éthique Comité des FUNDP (éthique du projet n ° 17-284 ). La figure 1 illustre les deux approches respectives : transdiaphragmatic ou injections transthoracique. Utilisez la souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois dans l’étude.
<p class="jove_title...

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Le protocole décrit ci-après peut être appliqué à une souche de souris adultes ou à n’importe quel paradigme expérimental où l’intégrité de la circuiterie de diaphragme-PhMN doit être évaluée. Par exemple, sclérose latérale amyotrophique (SLA) et du col de la moelle épinière (cSCI) sont des conditions liées à la perte de PhMN, antérograde une dégénérescence des axones phréniques et compromis respiratoire subséquente. Modèles animaux de SLA ou cSCI imitent les déficits respiratoires histopat...

L’objectif de l’étude est de présenter une méthode fiable pour identifier les neurones moteurs phréniques (PhMN) sur des coupes de moelle épinière de souris. Injection d’un traceur fluorescent neuroanatomique dans la cavité pleurale a été choisie comme la méthode de livraison pour atteindre les projections neuromusculaires le diaphragme phréniques et transport rétrograde le long des axones phréniques permet d’étiqueter des corps cellulaires phréniques. Deux techniques de livraison intrapleurale sont décrites : transdiaphragmatic versus transthoracique.
Motoneurones phréniques sont des cellules de relais de la colonne vertébrale dont les axones convergent dans des nerfs phréniques, qui finalement innervent le diaphragme. Ce sont des neurones moteurs inférieurs recevoir l’entraînement inspiratoire des centres respiratoires bulbaires et il relais des messages vers les jonctions neuro-musculaires du diaphragme (NMJ). PhMN sont structurées en deux colonnes de moteurs, un pour chaque hemicord, le long de la colonne vertébrale-cervical. Dans la plupart des espèces de mammifères dont les humains, les colonnes moteurs phréniques propagation de niveaux C3 à C61,2,3. Nous et autres avons confirmé que PhMN concentrés dans des niveaux de C3-C5 dans le rat et la souris moelle épinière4,5,6,7,8. La répartition topographique des cellules phréniques n’est pas au hasard ; motoneurones innervant la partie sternale du diaphragme sont distribués plus dense dans la partie crânienne de la piscine de moteur phrénique (C3), tandis que les motoneurones innervant la partie crurale sont plus caudal (C5)9. En outre, les PhMN sont regroupés diversement dans la matière grise de corne ventrale. Au niveau de la C3, les grappes de cellules phréniques se trouvent latéralement, puis qu’elles bougent dans le sens ventro ni sont trouvent ventromedially à la plus caudale niveaux10,11.
Compte tenu de leur rôle essentiel pendant l’inspiration, il est primordial d’identifier avec précision PhMN dans la moelle épinière en bonne santé, mais également suivre leur sort au cours de pathologies, telles que les traumatismes de la moelle épinière ou de maladies dégénératives. Car PhMN ne diffèrent pas morphologiquement des autres neurones moteurs du col utérin, identification de PhMN repose sur l’administration ciblée des traceurs neuroanatomiques soit au niveau des centres respiratoires primaires8, le diaphragme NMJ7 ou au le nerf phrénique4. Le traceur est absorbé par les fibres nerveuses et transporté jusqu'à les phréniques corps cellulaires dans le rachis cervical, où elle peut être visualisée à l’aide de systèmes de détection directe ou indirecte. Rétrograde ou antérograde traceurs sont commercialement disponibles avec une large gamme de conjugués. Remarquable, chaque traceur est doté de no, basses ou hautes capacités pour le suivi des trans synaptique.
Dans la présente étude, nous avons choisi la sous-unité bêta de la toxine de choléra (CTB) fonctionnalisée avec Alexa Fluor 555 (désormais dénommé CTB-fluorophore) comme une étiquette fluorescente, ce qui permet une visualisation directe des PhMN sur des coupes congelées de la moelle épinière. CTB est habituellement décrite comme traceur monosynaptique, bien que les données expérimentales tendent à montrer un passage de transneuronal12. CTB a la capacité de lier le ganglioside GM1 à la membrane plasmique de la terminaison nerveuse. CTB est internalisée par clathrin-dépendante ou - indépendant des mécanismes et des trafics à travers le réseau trans-Golgi dans le réticulum endoplasmique dans un mode rétrograde13,14. L’internalisation et le transport rétrograde semblent dépendre l’actine cytosquelette15,16 , ainsi que sur le réseau de microtubules17.
Pour démontrer l’utilité de la CTB comme traceur neuroanatomique rétrograde étiquetage diaphragme-PhMN circuit, CTB-fluorophore fut livré intrapleurale. CTB a été administré à l’aide de deux techniques : l’une comprenait une laparotomie et injections multiples de transdiaphragmatic ; le second, moins invasive, utilisé une unique injection transthoracique. Quatre jours plus tard, fluorescent marqué PhMNs ont été quantifiés dans la moelle épinière cervicale à la fois sain et animaux (C4) spinal-blessés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Motoneurones phréniques sont des neurones de moteur du col utérin provenant de C3 à C6 niveaux en plus des mammifères. Projections axonales convergent dans des nerfs phréniques qui innervent le diaphragme respiratoire. Dans des tranches de la moelle épinière, les motoneurones phréniques ne peut être identifiés d’autres neurones moteurs sur des critères morphologiques ou biochimiques. Nous fournissons la description des procédures pour visualiser les corps cellulaires des motoneurones phréniques chez des souris, des injections d’intrapleurale suivants de bêta de sous-unité choléra toxine (CTB) conjugué à un fluorophore. Ce traceur fluorescent neuroanatomique a la capacité d’être rattrapé à la jonction neuromusculaire de diaphragme, être emportés marqués les axones phréniques et atteindre les corps cellulaires phréniques. On compare les deux approches méthodologiques de la livraison CTB intrapleurale : transdiaphragmatic versus les injections transthoracique. Les deux approches sont efficaces et donner lieu à un nombre similaire de motoneurones phréniques CTB-étiqueté. En conclusion, ces techniques peuvent être appliquées afin de visualiser ou de quantifier les motoneurones phréniques dans diverses études expérimentales telles que celles axées sur le circuit de diaphragme-phrénique.

Les souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois ont été inclus dans l’étude. Au jour J0 de l’expérience, 8 souris ont subi une contusion unilatérale de C4, côté droit, selon le protocole publié7,18. Comme intervention factice, 10 souris ont subi une laminectomie sur le dessus de C4 sans contusion. Au 3e jour, souris ont été préparés pour les injections intrapleurale de CTB-fluorophore selon les deux proc...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Nous décrivons ici, un protocole d’identification des motoneurones phréniques chez la souris après que livraison intrapleurale du fluorophore conjugué bêta de choléra toxine sous-unité. Deux techniques sont comparées pour injecter de la cavité pleurale : transdiaphragmatic par rapport aux approches transthoracique.

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